Introduction
Immunhistokemi (IHC) er en standard lab teknik til påvisning af protein i væv, og IHC stadig meget udbredt i både forskning og diagnostisk patologi. Evalueringen af IHC farvning ofte semi-kvantitativ, indførelse potentiel skævhed i fortolkning af resultaterne. Der er udviklet mange semi-kvantitative metoder, der inkorporerer både farvning intensitet og farvning udstrækning til endelige diagnose 1-4. Andre systemer omfatter scorings intensitet og subcellulære lokalisering for bedre at lokalisere ekspressionen 5. Inkorporering af gennemsnitlige scores fra flere seere er ofte udnyttes for at minimere virkningerne af enkelt seer partiskhed 6. På trods af disse bestræbelser, subjektivitet i analysen stadig, især når en vurdering af omfanget af farvning 7. Protokol standardisering og minimere subjektivitet fra humant input er altafgørende for at skabe præcise, reproducerbare IHC resultater.
indhold "> Der er andre indstillinger udover IHC til bestemmelse protein ekspression i væv. Inden indstillingen forskning har immunhistokemi traditionelt blevet set som et middel til at undersøge proteinlokalisering 8, mens andre teknikker, såsom immunoblotting betragtes som guldstandard for at undersøge protein-ekspression . Bestemmelse væv eller celler rum-specifikke udtryk er svært uden at inkorporere avancerede teknikker såsom celle fraktionering eller laser capture mikrodissektion 9,10. brugen af fluorescerende antistoffer på væv slides tilbyder et rimeligt kompromis, men baggrunden autofluorescens grundet NADPH, lipofuscins, retikulære fibre, kollagen og elastin kan gøre nøjagtig kvantificering vanskelig 11.Automatiseret beregningsmæssige patologi platforme er en lovende retning for mere objektiv kvantificering af patologi farvning 12-15. Kombinere Multispektralbilledteknik med væv microarraysletter high-throughput analyse af protein-ekspression i store stikprøvestørrelser. Med disse teknikker, analyse af protein co-lokalisering, farvning heterogenitet, og væv og subcellulære lokalisering er muligt, mens væsentligt reducere både iboende fordomme og nødvendige tid til analyse, mens returnering af data i en kontinuerlig snarere end kategorisk format 16. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at demonstrere anvendeligheden af og metode til at udføre multiplex immunhistokemi med analyse, ved hjælp af multispektral imaging software.
Denne protokol er skrevet til manuel, multiplex immunhistokemisk farvning af en enkelt vævssnit slide med fire optimerede monoklonale antistoffer. Som repræsentativt forsøg, er nukleare anti-kanin østrogenreceptor alfa (ERa) og androgen receptor (AR) multiplekset med membranbundet anti-muse CD147 og membranbundet anti-muse E-cadherin. Enhver antistof valg kan substituted for antistofferne anført heri, men hver kombination af antistoffer kræver separat optimering. Forbehandling for alle antistofferne skal være identiske. De AR og CD147-antistoffer bør optimeres individuelt og derefter som en cocktail. Hvert antistof påvises ved anvendelse af et biotin-fri polymer system og et af 4 unikke chromogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen heri beskriver farvning og analyse af et væv microarray (TMA), tidligere 12,17,18 beskrevet. 4 um tyk TMA sektion blev opnået fra en paraffinblokken anvendelse af en standard mikrotom.
BEMÆRK: En spektral bibliotek for de 4 chromogener og kontrastfarve bør oprettes for billedet kvantificering. For at gøre dette, skal den optimerede protokol for hvert enkelt antistof køres med én antistof pr dias, minus den endelige kontrastfarve. En femte objektglas skal farves med hæmatoxylin for at generere de 5 billeder nødvendige for at skabe den spektrale bibliotek.
1. Multiplex Immunhistokemi
- Bage objektglassene i en 60 ° C varm ovn i 20 minutter. Ved hjælp af en kemisk stinkskab, fordybe slide i 100% xylen. Gentag for 2 hold xylen. Fordyb slide i 100% ethanol i 5 min. Gentag med frisk 100% ethanol.
- Fordyb slide i 95% ethanol i 3 min. Gentag med frisk95% ethanol. Fordyb slide i 70% ethanol i 3 min. Fordyb slide i destilleret vand i 3 min. Gentag med frisk destilleret vand. Tap dias lodret til at dræne vand fra slide. Påfør 200 pi klar-til-brug endogen peroxidase blocker for 5 min.
- Dræn peroxidase blocker fra dias og fordybe i 45 ml klar-til-brug hentning buffer (pH mindre end 7,0). Placer dias container i en trykkoger, og start programmet indstillet til 124 ° C i 4 min. Tillad trykkoger til afkøling i 20 min. før åbning.
- Fjern beholder med hentning buffer og lad det køle af yderligere 10 min. Skyl slide i destilleret vand i 10 min. Dræn vandet fra dias og afgrænse omhyggeligt vævet på diaset med en hydrofob barriere pen.
- Tilsæt 200 pi phosphatpufret saltvand (PBS) .Transfer slide til en flad beholder med låg (inkubation kammer) indeholdende fugtig gaze.
- Forberede 1 liter 1x Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBST) ved fortynding 50 ml 20x Tris-pufret saltvand indeholdende 1% Tween-20 og 950 ml destilleret vand.
- Drain PBS fra dias og anvende 200 pi 1x TBST. Inkuber 2 min. Dræn TBST fra dias og returnere dias til inkubation kammer. Påfør 200 pi klar-til-brug universal protein blok, tæt kammer og inkuber i 7 min.
- Hæld vandet protein blok og returnere dias til inkubation kammer. Fortynd anti-ERa-antistof 1: 400 ved tilsætning af 0,6 pi antistof til 239,4 pi antistoffortyndingsmiddel. Påfør 200 pi fortyndet antistof til at glide og tæt kammer.
- Inkuber objektglas ved stuetemperatur i 2 timer. Dræn antistof fra dias og skyl med TBST efterfulgt af nedsænkning i 5 min i TBST.
- Dræn TBST fra dias og returnere dias til inkubation kammer. Påfør 200 pi klar-til-brug gede-anti-kanin-peberrodsperoxidase polymer og tæt kammer. Inkuber i 30 minutter. ved stuetemperatur. Skyl slide med TBST og sted dias i beholder med TBST i 5 min. </ Li>
- Forbered brun peberrodsperoxidase-3,3'-diaminobenzidin (HRP-DAB) chromogen ved tilsætning 8 pi DAB kromogen til 250 pi DAB substrat puffer og blandes godt.
- Dræn TBST fra dias, tilbagevenden dias til inkubation kammer og anvende 200 pi brun HRP-DAB kromogen i 6 min. Skyl objektglasset med destilleret vand og sted dias i en beholder med destilleret vand.
- Bland denaturerende opløsning ved at kombinere 50 pi af den første eluering reagens med 150 pi af den anden puffer reagens. Dræn vandet fra dias og anvende fortyndet denaturerende løsning på dias for 3 min. ved stuetemperatur. Dekanteres og skyl denaturering reagens med TBST. Fordyb dias i TBST i 5 min.
- Forbered AR / CD147-antistof cocktail ved fortynding 4,2 pi anti-AR-antistof og 2,8 pi anti-CD147-antistof med 203 pi antistoffortyndingsmiddel. Dræn TBST fra slide, tilbage dias til inkubation kammer og anvende 200 gi AR / CD147 cocktail til dias. Luk kammer og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Skyl slide med TBST og fordybe i TBST i 5 min.
- Drain TBST, tilbagevenden slide inkubation kammer og anvende 200 pi klar-til-brug gede-anti-kanin-alkalisk phosphatase-polymer. Luk kammer og inkuber slide i 30 min. ved stuetemperatur. Skyl slide med TBST og fordybe i TBST i 5 min.
- Forbered rød alkalisk phosphatase chromogen ved tilsætning 3,2 pi røde kromogen til 250 pi rød kromogen buffer og bland godt.
- Dræn TBST fra dias og returnere dias til inkubation kammer. Påfør 200 pi fortyndet rød alkalisk fosfatase chromogen til dias, tæt kammer og inkuberes i 7 min.
- Tøm kromogen og grundigt skyl slide med destilleret vand. Placer dias i en beholder med destilleret vand i 5 min. Drænvand fra slide, skyl med TBST og vende tilbage til inkubation kammer. Påfør 200 pi gede-anti-muse-HRP polymer på objektglasset og close kammer. Inkuber i 30 minutter. ved stuetemperatur.
- Dræn polymer fra slide og skyl med TBST. Placer dias i TBST i 5 min. Forbered 200 pi lilla HRP-koblet chromogen ved tilsætning 3,2 pi af det stabiliserende reagens til 250 pi af buffer og bland godt. Sættes 3,2 pi lilla kromogen og bland godt, derefter 3,2 pi af hydrogenperoxid reagens og bland godt.
- Dræn TBST off dias og anvende 200 pi af tilberedt lilla kromogen at glide og inkuberes i 7 min. ved stuetemperatur. Skyl objektglas med destilleret vand og sted dias i en beholder med destilleret vand i 5 minutter.
- Bland denaturerende opløsning ved at blande 50 pi af den første eluering reagens med 150 pi af den anden puffer reagens. Dræn vandet fra dias og anvende fortyndet denaturerende løsning på dias for 3 min. ved stuetemperatur.
- Skyl denaturerende reagens af med TBST. Placer dias i beholder med TBST i 5 min. Fortynd anti-E-cadherin antistoftil 1: 200 ved tilsætning af 1,1 pi antistof til 218,9 pi antistoffortyndingsmiddel. Tøm TBST fra slide, tilbagevenden dias til inkubation kammer og anvende 200 pi E-cadherin til dias. Luk kammer og inkuber 30 min. ved stuetemperatur.
- Skyl slide med TBST og sted dias i beholder med TBST i 5 min. Tøm TBST fra dias, returnere dias til inkubation kammer og anvende 200 ul gede anti-mus HRP polymer. Der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. Skyl slide med TBST og sted dias i beholder med TBST i 5 min.
- Forbered sort HRP-koblet chromogen ved tilsætning 8 pi kromogen til 250 pi buffer. Påfør 200 pi kromogen til at glide og udvikle i 2 min. Skyl slide med destilleret vand og fordybe i beholder med destilleret vand.
- Fortynd hæmatoxylin ved at tilsætte 40 pi hæmatoxylin til 200 pi destilleret vand. Drænvand fra dias og anvende 200 pi fortyndet hematoxylin til at glide i 30 sekunder. Skyl diasgrundigt rindende ledningsvand i 2 min., derefter skylles i destilleret vand i 30 sekunder. Sted slide i en 60 ° C varm ovn i 15-30 min.
- Fordyb dias i frisk fremstillet 100% xylen i 30 sekunder, tørre overskydende xylen off og tilsæt en dråbe af permanente montering medier. Dækglasset med en nr 1,5 dækglas.
2. Automatiseret Image Acquisition og Analysis
- Indlæs farvede slides på en automatiseret dias scanner. Baseret på den diameter, separation, og antallet af TMA kerner, skabe en automatiseret scanning-protokol ifølge producentens brugsanvisning.
- Open Multispektralbilledteknik software til at bygge en spektral bibliotek fra kontrolglas farvet med individuelle chromogener og hæmatoxylin farvede dias. Åbn et billede terning erhvervet fra en kontrol dias og vælge fire til fem positivt farvede områder til optisk definere, at chromogen. Gentag med billede terninger fra andre kontrolglas indtil en fuldstændig spektral bibliotek representing alle chromogener er oprettet, og derefter gemme den spektrale bibliotek.
- Begynd et nyt projekt inden multispektral imaging software. Vælg "Multispektral (.im3)" for indstillingen billedets format og "Lysfelt" for prøven format. Først konfigurere projektet ved at vælge ønskede indstillinger: "Segment Tissue", "Find funktioner", "fænotype", "Score" og "Export". På dette tidspunkt kan beslutning billedet ændres til fremskynde analyse tid, hvis det ønskes.
3. Tissue Segmentering
- Importer den tidligere oprettede spektrale bibliotek og vælge alle chromogener, der skal indgå i analysen.
- Åbn billede terninger, der skal indgå i uddannelsen datasæt ved at vælge "Åbn billede Cube" valgmulighed. For at sikre uddannelse nøjagtighed, vælge mindst 18% af det samlede antal billeder, der skal analyseres. Vælg billeder, der repræsenterer alle sygdomstilstande at øge segmentering nøjagtighed. Denne del af billeder is kaldte uddannelsen sæt billeder.
- Hvidbalance billeder i uddannelsen indstilles ved at vælge pipette værktøjet og vælge et område i et billede, der er hvid.
- Vælg knappen "Advance" at flytte til væv segmentering. Brug "Tissue Kategorier" panel til at vælge vævstyper, der skal analyseres (dvs. "væv" og "ikke-væv"). For mere præcis protein væv lokalisering, kan flere kategorier væv anvendes (dvs. ". Epithel," "stroma," og "ikke-væv").
- Begynd at skabe den algoritme og definere væv kategorier ved at tegne rundt grupper af celler i uddannelse billeder. Når du er færdig med én væv kategori, gentag for andre kategorier væv. Vær sikker på at vælge grupper af celler i billeder, der er karakteristiske for dette væv kategori type.
- Gentag denne proces for alle billeder i uddannelsen sæt billeder.
- Vælg komponenter (chromogener), der skal indgå i afhentningssning til "Tissue Segmenter". Ved udførelse af analyse af lysfelt immunhistokemi billeder, er alle komponenter, der normalt indgår i uddannelsen. Medtag rigelige negativ farvning billeder i uddannelsen sat til at undgå bias i dette trin.
- Vælg en passende "Mønster Scale" for at træne vævet segmenterer. Under 20X forstørrelse, et stort mønster skala er typisk passende. Når man arbejder med væv med en fin arkitektur under større forstørrelse, en mindre skala mønster er mere passende.
- Vælg "Train Tissue Segmenter" knappen for at starte uddannelse vævet segmenterer. Overhold en pop-up boks viser nøjagtighed afspejler andelen af pixels inden træning regioner, der er korrekt klassificeret.
BEMÆRK: Softwaren løbende forsøger at forbedre nøjagtigheden af algoritmen indtil manuelt stoppes. Vi har tidligere vist, at uddannelse på 18% af billeder resulterer i 97% træning nøjagtighed 12. Efter vævet segmenterer er uddannet, vælge en passende segment opløsning. Segment opløsning svarer til tid, der kræves til segment billeder, med grov opløsning kræver mindre tid og fin opløsning kræver mere tid. - Segment hele uddannelsen sæt billeder ved at klikke på "-segmentet billeder". Lad softwaren tilstrækkelig tid til at anvende algoritmen til alle uddannelse billeder. Når du er færdig, gennemgå uddannelsen sat til at finde nogen fejlklassificeres væv med den aktuelle uddannelse algoritme.
- Til finjustere vævet segmentering proces, tilføje, redigere eller fjerne væv uddannelse regioner. Brug "trim kanterne" mulighed, hvis pixels strækker på kanten af en væv kategori til en anden. Hvis små grupper af pixels fejlklassificeres, justere tærsklen på minimum segment størrelse.
- Når redigeringer er afsluttet, skal du vælge "Segment billeder", vil dette igen træne vævet segmenterer at oprette en ny algoritme til væv segmentering. Den tidligere algoritmeer automatisk gemmes og kan returneres til, hvis nødvendigt.
- Når fortrolig med væv segmentering algoritme resultater, gå videre til celle segmentering ved at vælge knappen "Advance".
4. Cell Segmentering
- Vælg de subcellulære afsnit, der skal indgå i celle segmentering. Sørg for, at "Kerner" allerede er valgt til at vælge "Cytoplasma" eller "membran".
NB: "Membrane" segmentering bør kun vælges, når en membran-specifikt protein markør blev inkluderet i IHC, såsom E-cadherin. - Inden for "Nuclei" fanen, er der flere muligheder. Begynd med at vælge passende indstillinger for nuklear segmentering (se trin 4.3). Vælg, om individuelle eller alle kategorier væv vil blive inkluderet i segmentering.
- Vælg en tilgang til nuklear segmentering
- Vælg kontrastfarve "Pixel-Based (Threshold)" tilgang til en forenklet fremgangsmåde til at opnå godresultater uden at vide meget om billedbehandling indstillinger.
BEMÆRK: Denne ofte gør et godt første valg. Når du vælger en tilgang, "Pixel-Based (Threshold)" er mere passende, når der er en pålidelig nuklear counter-plet, mens "objektbaseret" bør anvendes, hvis der er mangel på sammenhængende nukleare kontrastfarve. - Vælg "Pixel-Based (Threshold)" tilgang, når der er en pålidelig nuklear kontrastfarve.
BEMÆRK: Denne tilgang er rent pixel-baseret. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til andre billedanalyse behov, der kan opfyldes med en simpel tærskel, såsom afsløre alle pixels i et væv kategori, der pletten positive for en IHC plet. - Vælg Objekt tilgang, hvis den nukleare kontrastfarve ikke giver konsekvent og specifik farvning af nukleare genstande, og der er behov mere avancerede morfometri tilgange til at opdage kerner.
- Vælg "Komponenter til Nuclear segmentering", "Nucløre Size "og" Clean-up ", hvis brugeren ønsker at yderligere at definere kerner segmentering indstillinger.
- Vælg kontrastfarve "Pixel-Based (Threshold)" tilgang til en forenklet fremgangsmåde til at opnå godresultater uden at vide meget om billedbehandling indstillinger.
- Vælg cytoplasma form parametre
- Vælg knappen "Advance" at flytte til cytoplasma segmentering.
BEMÆRK: Der er flere muligheder inden cytoplasma segmentering at vælge imellem. Muligheden betegnet "indre afstand til Nucleus" er pixel baseret. Det afspejler afstanden mellem ydersiden af kernen og indersiden af cytoplasmaet. Forøgelse denne værdi mindsker sandsynligheden for, at nuklear signal krydser over i cytoplasmaet rummet. - Næste vælge, "ydre afstand til Nucleus".
BEMÆRK: Dette er også pixel baseret. Den ydre afstand til kernen afspejler afstanden mellem ydersiden af kernen og ydersiden af cellen. Denne værdi kan indstilles stor eller lille nok til at inkludere eller ekskludere membran signaler, hvis det ønskes. - Næste vælge, "mindste størrelse".
BEMÆRK: Den mindste størrelse, PIXEl baseret, afspejler den minimale cytoplasma prøvestørrelse, der skal indgå i analysen. Hvis cytoplasmaet størrelse er mindre i en bestemt celle, såsom når celler tæt pakket sammen, er dette cytoplasmaet segmentering udelukket fra analysen. - Vælg den næste mulighed, "Component" med "Primary", "Sekundær", og vælg "Tertiær" som sekundære muligheder.
BEMÆRK: Her kan man vælge en specifik cytoplasma markør. Svarende til nuklear segmentering, hvis der er anvendt en specifik cytoplasmatisk IHC markering, denne komponent kan anvendes til at definere cytoplasmaet ved at finde en minimal tærskelværdi. Dette hjælper med at definere cytoplasmaet men ikke er nødvendig for acceptabel nøjagtighed. - Flytning til den sidste af de tre faner muligheder er "Membrane". Her definerer brugeren membranrummet med et protein markør. Vælg "Primær", "sekundære" og / eller "Tertiær" for hver membran specifik markør anvendes. Juster "Full Scale OD "for at finde en minimumsgrænse eller et positivt for hver markør på cellemembraner.
- Fortsætter under "Membrane" fanen og vælg indstillingen "Maksimal Cell Size".
BEMÆRK: Dette er afstanden til membranen værdi i pixel, som angiver den maksimale størrelse af cellerne. En værdi på 12 er normalt passende for billeder taget ved 20X forstørrelse. - Når du har valgt alle de muligheder, du vælge "Segment Image" eller "Segment Alle". Anvend indstillingerne til billeder og observere dem "individuelt" eller i "Galleri" mode.
BEMÆRK: Justering af indstillinger og tærskler om nødvendigt og re-segmentet indtil tilfreds med celle segmentering resultater i uddannelsen sæt billeder.
- Vælg knappen "Advance" at flytte til cytoplasma segmentering.
5. fænotype Celler
BEMÆRK: Nøjagtig celle segmentering er nødvendig for at opnå nøjagtig celle fænotypebestemmelse, og fænotypning funktion er trainable.
- Brug "Tilføj &# 34; knappen for at tilføje fænotyper til "fænotyper" liste. Brugerne kan vælge en farve til fænotype.
- Klik på "Edit fænotyper" for at tildele en fænotype til en celle. Klik på en bestemt celle for at få en drop-down menu, så brugeren kan vælge den fænotype og derefter gå videre. Identificere mindst fem (5) celler i hver fænotype for at fortsætte. Valg 25 eller flere celler af hver fænotype er nødvendig for at opnå optimale resultater.
6. Scoring IHC og Co-Lokalisering
- Vælg "Advance" for at gå til "Score IHC eller HVIS" trin. Vælg en "Tissue Kategori" at score.
BEMÆRK: Kun én væv kategori kan scoret i løbet af en bestemt analyse, men hvis der ønskes scoring resultater i en anden væv kategori, kan analysen gentages senere med forskellige indstillinger. - Vælg en ønsket "Scoring" type.
BEMÆRK: Positivitet skaber to beholdere (positive og negative) for en del af interesse, Mens dobbelt positivitet anvendes til co-lokalisering analyse. Andre valgmuligheder omfatter 4-bin, 10-bin, og 50-bin analyser for en markør af valg. - Vælg cellen "kammeret" benyttes i lave analyse.
- Svarende til at finde en minimumsgrænse for den primære nukleare komponent, vælg "Vis Component data" og flytte markøren over uddannelse billederne for at finde passende optisk densitet minimumstærskler af farvning for positive celler for bestanddel (e) af interesse.
- Hvis intenst farvede celler skal udelukkes, sænke tærsklen max til et passende niveau. Ellers skal du bruge den automatiske knappen for at vælge en tærskel maksimum for analyse.
- Vælg uddannelse billeder til at score for at validere tærsklingsparametre værdier.
BEMÆRK: Procentdelen af celler i en bestemt bin vil blive returneret og kan sammenlignes ved visuel inspektion eller manuel optælling. Når du er færdig, skal du vælge "Advance" for at fortsætte til "Export" trin.
- Test algoritmen skabt gennem væv segmentering, celle segmentering, og scoring værdier ved at eksportere data til træningssættet. Følg anvisningerne for at oprette en ny mappe til eksport mappe. Vælg billeder og tabeller, der skal oprettes og medtaget i analysen. Udfør analysen ved at vælge "Export for alle".
- Tabeller eksporteres i tabulatorseparerede tekstfiler og kan åbnes i de fleste data analyseprogrammer.
- Når analysen er færdig, se celle segmentering og scoring data til billeder med både høj og lav farvning til at evaluere nøjagtigheden af indstillinger.
- Når du er tilfreds med indstillingerne, anvende algoritmen oprettet fra uddannelsen sæt billeder til hele sæt af billeder via batch analyse. Klik på fanen "Batch Analysis" og den åbnede algoritme vil blive kopieret fra det aktive projekt.
- Vælg en ny eksport mappe og vælge hvilke billeder og tables skal indgå i analysen. Under indstillingen input filer skal du vælge "Tilføj billeder" og vælg alle billeder, der skal indgå i batch analyse.
- Udfør analysen ved at vælge "Kør" valgmulighed. Som med analysen af træningssættet, vil dette trin kræver en variabel mængde tid, afhængigt af særlige indstillinger og antal billeder indgår i analysen.
- Når det er gennemført, gå videre til "Review / Merge" fanen. De batch mappe som standard eksport biblioteket fra partiet analyse og kan ændres, hvis det ønskes. Vælg "Medtag Alle" og vælg "Flet" at skabe datablade med summariske oplysninger til analyse.
8. Analyse af eksporterede data
- Åbne eksporterede tabeller i dataanalyse software og fjerne eller skjule datakolonner der er irrelevante for analyse, såsom minimale og maksimale værdier for hver komponent. Den primære data, der anvendes i analysen er i den gennemsnitlige optiske densitet column for hver komponent.
- Anmeldelse eksporteret segmentering kort og rå billeder at bestemme, hvilke prøver eller TMA kerner skal udelukkes fra analysen. Tissue procentværdier bistå med at afgøre, om en prøve skal medtages eller ej, med en vilkårlig cutoff på <5% bruges oftest til udelukkelseskriterier.
- Fjern irrelevante data eller rækker, der indeholder prøver, der skal udelukkes fra dataanalyse.
- Brug protein kvantificering data til at undersøge ændringer i sygdomstilstand eller forholdet til klinisk-patologiske karakteristika sygdom 12,18-21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 er træning udført på prostatavæv at segmentere billeder i epitel og stroma portioner, sammen med den ikke-vævsområderne. Ved at bruge epithelmembranen markør E-cadherin blev celle segmentering udført for at adskille kerne, cytoplasma og membran portioner, vist i figur 2.
I et eksperiment brugte vi multipleksede IHC at undersøge ekspressionen og lokalisering af AR, ERa, E-cadherin, og CD147, som vist i figur 3. Under anvendelse af disse teknikker, er vi i stand til at identificere celler positive for nuklear ekspression af både ERa og AR (figur 3B - 3C) trods overlappende kolorimetriske signaler, som det er vist med grønne pile i figur 3A. Vi fandt markante forskelle i andelen af dobbelt positive stromale celler i forskellige tilstande af PRostate sygdom (figur 3D). Vi kvantificeret cellemembran-ekspression af CD147 ved hjælp af e-cadherin som en markør protein (røde pile i figur 3A), og vi var den første gruppe til at undersøge membran specifik CD147 udtryk i prostata væv. Vi fandt en signifikant nedgang i CD147 ekspression i association med prostatacancer progression (Figur 3E) og fundet en vigtig association med postkirurgisk prognose 19.
Der er tilfælde, hvor dårlig eksperiment design kan føre til unøjagtige væv segmentering. I figur 4 anvendes algoritmen til et sæt af væv ikke præcist segment epitel- og stromale kamre (figur 4C). I dette forsøg blev α-glatmuskelactin (α-SMA) anvendes til at markere det stromale rum. Fordi α-SMA og glat muskulatur er nedsat eller tabt i nogle tumorer (Figure 4A), algoritmen skabt gennem væv segmentering (figur 4B) var ikke i stand til nøjagtigt at skelne mellem epitel og stroma rum fra morfometriske data alene. Der bør udvises forsigtighed, når du vælger proteinmarkører til væv eller celler rum.
Figur 1: Tissue Segmentering Brug Multispektral Imaging Software. En prostatavæv mikroarray blev farvet ved anvendelse multipleksede immunhistokemi for androgen receptor (AR), estrogen receptor-alfa (ERa), E-cadherin, og CD147. Et sæt af uddannelse billeder blev importeret til multispektral imaging software repræsenterer vævstyper og sygdomstilstande for det samlede sæt af billeder (A). Væv kategorier blev skabt herunder stroma (grøn), epithel (rød), og ikke-væv (blå), og kategorier blev defineret ved manuelt at trække på toppentræning billeder (B). Efter at trække på uddannelse billeder, blev en algoritme til væv segmentering oprettes og anvendes til uddannelse sæt billeder (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cell Segmentering i Nuclear, Cytoplasmisk, og Membrane Rum. Den nukleare rum blev defineret for celle segmentering ved at fastsætte en minimumsgrænse for hæmatoxylin kontrastfarvning (A). Cytoplasmaet blev defineret i forhold til kernen ved hjælp af forudindstillede algoritmer i softwaren (B). E-cadherin blev anvendt som en membran markør og et minimum betyder OD tærskelværdi blev anvendt til at definere membranrummet (C). Denne teknik alleOWS samtidig kvantificering af protein-ekspression i alle subcellulære rum (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Analyse af Co-lokalisering og Membrane-specifikke Protein Expression. Multiplekset IHC blev anvendt til at undersøge ekspressionen og lokalisering af androgen receptor (AR), estrogen receptor-alfa (ERa), E-cadherin, og CD147 (A). DAB (brun chromogen) blev anvendt til at markere AR (B) og en rød kromogen bruges til at markere ERa (C). Vi var i stand til at identificere rumligt overlappende biomarkører (grønne pile i A) og kvantificere (D) andelen af celler med nukleare co-lokalisering af ERa og ARinden prostata stroma. Ved at bruge E-cadherin (sort chromogen) til at definere plasmamembranen (røde pile i A), kvantificeret vi membran-ekspression af CD147 inden prostata væv (E) 19. En-vejs blev anvendt variansanalyse (ANOVA) til statistisk analyse, fejlsøjler afspejler standardafvigelse af middelværdien, og asterisk repræsenterer p <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Utilstrækkelig Tissue Segmentering Som følge af Experimental Design. Benigne og maligne prostata væv blev farvet for α-glatmuskelactin (α-SMA, grøn chromogen), androgen receptor (rød chromogen), og androgen receptor variant 7 (DAB chromogen). a-SMA blev anvendt somen markør for stroma og formindskes i nogle tumorer, herunder prostata (A). Når træning blev udført (B) og vævet segmentering algoritme blev anvendt, det stromale og epiteliale rum var utilstrækkeligt segmenteret på grund af fraværet af α-SMA-farvning (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af traditionelle immunhistokemi til evaluering proteinekspression er begrænset af subjektive, semikvantitative analysemetoder 22,23. Advance platforme er skabt til high-throughput analyse af biomarkør udtryk og lokalisering. Detaljeret segmentering af både væv og subcellulære rum giver brugerne mulighed for at studere biomarkør udtryk, lokalisering, og co-lokalisering med andre markører af interesse. I tidligere undersøgelser har vi vist anvendeligheden af IHC og Multispektralbilledteknik, især når de anvendes til at studere proteiner lokaliseret til det samme cellulære rum 18,20,21. Når det kombineres med væv microarrays 24, disse teknikker giver mulighed for hurtigere og mere objektiv kvantificering af proteinekspression end tilladt ved manuel analyse af en patolog.
Et problem med anvendelsen af immunhistokemi for protein kvantificering er irreproducibility af resultater på grund af den subjektivetive karakter af analyse og iboende forskelle i teknik og reagenser. En væsentlig fordel ved at bruge platforme som Multispektralbilledteknik til måling proteinekspression er reproducerbarhed af resultater. Data fra edb patologi platforme korrelerer stærkt med manuel analyse af en patolog, mens returnering data i en kontinuerlig format og væsentligt reducerer arbejde tid, især når der arbejdes med store prøve størrelser 12,16,25. Undersøgelser har vist høj samlet konkordans i resultaterne mellem forskellige multispektrale platforme 14. Desuden har vi tidligere vist, at farvningsresultater er meget reproducerbar selv når der er variation i antallet af proteiner undersøgte 12. Anvendelse af automatiserede patologi platforme for både farvning og analyse vil ikke fjerne alle uoverensstemmelser i resultater, som dem der hidrører fra antistoffer skabt mod forskellige epitoper, men disse platforme kan væsentligt reducere bias og irreproducerbarhed ofte forbundet med immunhistokemi.
Der er særlige skridt i protokollen, som er af afgørende betydning for nøjagtige, reproducerbare resultater. Passende eksperimentelle design gennem udvælgelse af proteiner, der skal indgå som væv eller subcellulære markører er vigtig for præcis segmentering. Ved udførelse positivitet analyse, udvælgelse af en lavere tærskel for positiv farvning har en stor indvirkning på de endelige resultater. Mens valget en tærskel for "on / off" proteiner såsom nukleare transkriptionsfaktorer er ret ligetil, at finde en tærskel for mere heterogent udtrykte proteiner er vanskelig. Dette bør ideelt set ske i samarbejde med en bord-certificeret uro-genital patolog eller som en gennemsnitlig score på tværs af flere observatører til at finde den ideelle tærskel for analyse.
Det er vigtigt at erkende nogle begrænsninger, den nuværende udgaver af denne teknologi. Når debøder cytoplasmaet rum, kan tre metoder anvendes: (1) farvning med et cytoplasma-specifik markør, (2) farvning med en membran-specifik markør og ved anvendelse kernen-til-membran markør afstand som cytoplasma, og (3) ved anvendelse af en tegning tilgang til manuelt at definere grænserne for cytoplasmaet i forhold til kernen. Fra vores erfaring, anvendelse af en membran-specifikke markør er den mest nøjagtige teknik. Den manuelle tegning tilgang er normalt nøjagtig, hvis kerner er centralt beliggende, eller hvis biomarkør af interesse er ensartet fordelt i hele cytoplasmaet. Nøjagtigt definere cytoplasma stromaceller som fibroblaster og glatte muskelceller fortsat vanskelig og bør tages i betragtning ved udformning af et eksperiment.
En anden begrænsning ved teknologien er afhængighed af kerner for celle segmentering. Hvis plan sektion udelukker kernen i en bestemt celle, vil denne celle ikke indgå i analysen. Hvis der ikke ersynlig cytoplasma mellem tilstødende kerner eller klumper af kerner, er disse ofte anerkendt som en stor nuklear klump, snarere end forskellige kerner. Generelt hæmatoxylin kontrastfarve normalt tilstrækkelig til acceptabel nukleare segmentering, og manipulation af software indstillinger såsom maksimal grænse for kerne størrelse kan løse de fleste problemer med nukleare segmentering.
En endelig begrænsning af automatiserede patologi platforme er upålidelig segmentering af væv som følge af dårlig eksperimenterende design. Betydningen af at vælge passende væv og celler biomarkører for besvarelsen af spørgsmålet af interesse kan ikke overvurderes. Som vi viste i vores repræsentative resultater, kan en epitelial eller stromal markør, der markant ændrer udtryk mellem sygdomstilstande give problemer, når du opretter en algoritme til væv segmentering. Det er værd at bemærke, at der er alternative muligheder, når vanskelige analyser som denne opstår. F.eks individuel images kan analyseres ved manuelt at trække alle vævsrum, snarere end ved at anvende en algoritme fra et træningssæt af billeder. Dette giver den fordel, segmentering, der er helt i tråd med, hvad brugeren ønsker, men det indfører også subjektivitet og kan øge den tid, der kræves for at afslutte en analyse betydeligt. Passende eksperimentelle design er den nemmeste måde at fremskynde analysen og maksimere nøjagtigheden af væv og celler segmentering.
Denne teknologi og protokol har mange fremtidige ansøgninger. Talrige biomarkører for bestemte sygdomstilstande er blevet identificeret, men ikke valideret. High throughput objektiv analyse med multispektrale platforme letter valideringen af disse biomarkører. Endvidere kan vurderingen af ekspression og co-lokalisering af multiple proteiner give indsigt i dårligt forståede signalveje. Utvivlsomt, reducerer den iboende subjektivitet forbundet med analyse af immunhistokemisk staining er værdifuldt for forståelsen af ekspression og lokalisering af en bred vifte af proteinmarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker University of Wisconsin Implementeringsforskning initiativer i Patologi laboratorium, delvist støttet af UW Patologisk Institut og Laboratoriet Medicin og UWCCC tilskud P30 CA014520, til brug af sine faciliteter og services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
- Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
- McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
- Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
- Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
- Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
- Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
- Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
- Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
- Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102 (2014).
- Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
- Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549 (2015).
- Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
- Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).
