Introduction
Immunohistochemie (IHC) is een standaard laboratorium techniek voor detectie van eiwitten in weefsel en IHC nog veel gebruikt in zowel onderzoek als diagnostische pathologie. De evaluatie van IHC kleuring is vaak semi-kwantitatieve, de invoering van mogelijke vertekening in de interpretatie van de resultaten. Veel semikwantitatieve benaderingen ontwikkeld die zowel kleurintensiteit en kleuring mate nemen in einddiagnose 1-4. Andere systemen omvatten scoring intensiteit en subcellulaire locatie om expressie 5 beter te lokaliseren. Opname van de gemiddelde scores van de verschillende kijkers wordt vaak gebruikt om de effecten van één kijker vertekening 6 minimaliseren. Ondanks deze inspanningen subjectiviteit analyse blijft, met name wanneer zij de mate van kleuring 7. Protocol standaardisatie en het minimaliseren van de subjectiviteit van de menselijke inbreng is van cruciaal belang voor het creëren van accurate, reproduceerbare IHC resultaten.
content "> Er zijn andere opties naast IHC voor het bepalen van proteïne expressie in weefsels. In het onderzoek instelling is immunohistochemie traditioneel beschouwd als middel om eiwit lokalisatie 8 onderzoeken, terwijl andere technieken zoals immunoblotting worden beschouwd als gouden standaard voor het onderzoeken eiwitexpressie . Bepaling weefsel of cel compartiment-specifieke expressie is moeilijk zonder integratie van geavanceerde technieken zoals mobiele fractionering of laser capture microdissectie 9,10. Het gebruik van fluorescente antilichamen op weefselobjectglaasjes biedt een redelijk compromis, maar achtergrond autofluorescentie door NADPH, lipofuscins, reticulaire vezels, collageen en elastine kunnen accurate kwantificering lastig 11 te maken.Geautomatiseerde computationele pathologie platformen zijn een veelbelovende richting voor meer objectieve kwantificering van pathologie kleuring 12-15. De combinatie van multispectrale beeldvorming met weefsel microarraysfaciliteert high-throughput analyse van eiwitexpressie in grote steekproefomvang. Bij deze technieken analyse van eiwit-co-lokalisatie, kleuring heterogeniteit en weefsel- en subcellulaire lokalisatie mogelijk terwijl zowel inherente vooroordelen en tijd voor analyse aanzienlijk verminderen, terwijl terugkeer data in een continu plaats categorische indeling 16. Daarom was het doel van deze studie naar het nut van en de methodologie voor het uitvoeren van multiplex-immunohistochemie met de analyse, het gebruik van multispectrale imaging software te demonstreren.
Dit protocol is geschreven voor handmatige, multiplex immunohistochemische kleuring van een weefselsectie dia met vier geoptimaliseerde monoklonale antilichamen. Als representatief experiment, kern anti-konijn oestrogeen receptor alpha (ERa) en androgeenreceptor (AR) gemultiplext met membraangebonden anti-muis CD147 en membraangebonden anti-muis E-cadherine. Elk antilichaam van keuze kan worden substituted voor de hierin genoemde antilichamen, maar elke combinatie van antilichamen vereist afzonderlijke optimalisatie. Voorbehandeling van alle antilichamen identiek zijn. De AR en CD147 antilichamen moet individueel en vervolgens worden geoptimaliseerd als een cocktail. Elk antilichaam wordt gedetecteerd met een biotine-vrij polymeersysteem en één van 4 unieke chromogenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het protocol hierin beschreven kleuring en analyse van een tissue microarray (TMA), 12,17,18 eerder beschreven. De 4 pm dik TMA sectie werd verkregen uit een paraffine blok met behulp van een standaard microtoom.
LET OP: Een spectrale bibliotheek voor de 4 chromogenen en tegenkleuring moet worden gecreëerd voor het kwantificering. Om dit te bereiken moet het protocol geoptimaliseerd voor elk antilichaam worden uitgevoerd met één antilichaam per dia, minus de tegenkleuring. Een vijfde dia worden gekleurd met hematoxyline de 5 afbeeldingen nodig spectrale bibliotheek te maken genereren.
1. Multiplex Immunohistochemie
- Bak schuift in een 60 ° C oven gedurende 20 min. Met behulp van een chemische dampkap, dompel dia in 100% xyleen. Herhaal dit voor 2 veranderingen van xyleen. Dompel dia in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal dit met verse 100% ethanol.
- Dompel dia in 95% ethanol gedurende 3 min. Herhaal met verse95% ethanol. Dompel dia in 70% ethanol gedurende 3 min. Dompel dia in gedestilleerd water gedurende 3 minuten. Herhaal dit met vers gedestilleerd water. Tik dia verticaal om water af te voeren van de glijbaan. Solliciteer 200 ul van kant-en-klare endogene peroxidase blocker gedurende 5 minuten.
- Drain peroxidase blocker van dia en ondergedompeld in 45 ml kant-en-klare retrieval buffer (pH lager dan 7,0). Plaats slide container in een snelkookpan en start programma ingesteld op 124 ° C gedurende 4 min. Sta snelkookpan afkoelen 20 min. vóór de opening.
- Verwijder de zak van het opvragen buffer en laat nog 10 minuten afkoelen. Spoel dia in gedestilleerd water gedurende 10 min. Giet het water van de glijbaan en zorgvuldig af te bakenen van het weefsel op de dia met een hydrofobe barrière pen.
- Voeg 200 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) .Transfer dia een vlakke houder met deksel (incubatiekamer) met vochtig gaas.
- Bereid 1 liter 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST) door verdunning 50 ml 20x Tris gebufferde zoutoplossing met 1% Tween-20 en 950 ml gedestilleerd water.
- Giet PBS uit dia's en 200 ul van 1x TBST toe te passen. Incubeer 2 min. Drain TBST van dia's en dia terug te keren naar incubatiekamer. Toepassen 200 gl van kant-en-klare universele eiwit blokkeren, close kamer en incubeer gedurende 7 min.
- Giet eiwit blok en schuif terug te keren naar incubatiekamer. Verdun anti-ERa antilichaam 1: 400 door het toevoegen van 0,6 pi van RNA van 239,4 pl antilichaam verdunningsmiddel. Solliciteer 200 ul verdund antilichaam te glijden en in de buurt de kamer.
- Incubeer glijbaan bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Drain antilichaam van dia en spoel af met TBST gevolgd door onderdompeling gedurende 5 minuten in TBST.
- Drain TBST van dia's en dia terug te keren naar incubatiekamer. Toepassen 200 gl van kant-en-klare geit anti-konijn mierikswortel peroxidase polymeer en nauwe ruimte. Incubeer gedurende 30 min. op kamertemperatuur. Spoel de dia met TBST en plaats dia in een container van TBST gedurende 5 min. </ Li>
- Bereid brown mierikswortelperoxidase-3,3'-diaminobenzidine (HRP-DAB) chromogeen door toevoeging van 8 pi chromogeen DAB tot DAB 250 ui substraatbuffer en goed mengen.
- Drain TBST van dia, return slide incubatie kamer en 200 ui bruine HRP-DAB chromogeen gelden voor 6 min. Spoel de dia met gedestilleerd water en plaats dia in een bak met gedestilleerd water.
- Meng de denaturerende oplossing door het combineren van 50 ui van het eerste reagens elutie met 150 ul van de tweede buffer reagens. Giet het water van de glijbaan en toe te passen verdunde denaturering oplossing voor de glijbaan voor 3 min. op kamertemperatuur. Giet en spoel denaturerende reagens met TBST. Dompel dia in TBST gedurende 5 min.
- Bereid AR / CD147 antilichaam cocktail van verdunning 4,2 pl anti-AR antilichaam en 2,8 pl anti-CD147 antilichaam met 203 gl antilichaam verdunningsmiddel. Tap TBST van de glijbaan, slide terug te keren naar de incubatie kamer en 200 ul van AR / CD147 c van toepassingocktail aan de dia. Afsluiten kamer en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Spoel de dia met TBST en onder te dompelen in TBST gedurende 5 minuten.
- Afvoer TBST, rendement dia incubatiekamer en 200 gl van kant-en-klare geit anti-konijn alkalisch fosfatase polymeer toegepast. Sluit de kamer en incubeer glijbaan voor 30 min. op kamertemperatuur. Spoel de dia met TBST en onder te dompelen in TBST gedurende 5 minuten.
- Prepare rood alkalische fosfatase chromogeen door toevoeging van 3,2 pi chromogeen rode tot 250 pl chromogeen rode buffer en meng goed.
- Drain TBST van dia's en dia terug te keren naar incubatiekamer. Solliciteer 200 ul van de verwaterde rode alkalische fosfatase chromogeen aan de dia, in de buurt kamer en incubeer gedurende 7 min.
- Giet chromogeen en spoel dia met gedestilleerd water. Plaats dia in een bak met gedestilleerd water gedurende 5 minuten. Giet het water van de glijbaan, spoelen met TBST en terug te keren naar incubatiekamer. Toepassen 200 ul geit anti-muis-HRP polymeer aan de glijbaan en close kamer. Incubeer gedurende 30 min. op kamertemperatuur.
- Drain polymeer van de glijbaan en spoel af met TBST. Plaats dia in TBST gedurende 5 min. Bereid 200 ul van paars-HRP gebonden chromogeen door toevoeging van 3,2 pi van het stabiliserend reagens 250 pl van de buffer en meng. Voeg 3,2 pl chromogeen paars en meng vervolgens 3,2 ul van het waterstofperoxide reagens en meng goed.
- Giet TBST uitknop en 200 ul van bereide paars chromogeen te glijden en incubeer gedurende 7 min van toepassing. op kamertemperatuur. Spoel dia met gedestilleerd water en plaats dia in een bak met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- Meng de denaturerende oplossing door het mengen van 50 ui van het eerste reagens elutie met 150 ul van de tweede buffer reagens. Giet het water van de glijbaan en toe te passen verdunde denaturering oplossing voor de glijbaan voor 3 min. op kamertemperatuur.
- Spoel denaturerende reagens met TBST. Plaats dia in container van TBST gedurende 5 minuten. Verdun anti-E-cadherine antilichaamtot 1: 200 door het toevoegen van 1,1 pi antilichaam tegen 218,9 gl antilichaam verdunningsmiddel. Giet de TBST van de glijbaan, return slide incubatie kamer en 200 ul van E-cadherine van toepassing zijn op de dia. Sluit de kamer en incubeer 30 min. op kamertemperatuur.
- Spoel de dia met TBST en plaats dia in een container van TBST gedurende 5 minuten. Giet de TBST van dia terug glijbaan naar incubatiekamer en toe te passen 200 pi geit anti-muis HRP polymeer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Spoel de dia met TBST en plaats dia in een container van TBST gedurende 5 minuten.
- Bereid zwart HRP-gebonden chromogeen door toevoeging van 8 pi chromogeen tot 250 gl buffer. Toepassen 200 pl chromogeen te schuiven en te ontwikkelen voor 2 min. Spoel dia met gedestilleerd water en onder te dompelen in een container van gedestilleerd water.
- Hematoxyline verdunnen door toevoeging 40 pi hematoxyline tot 200 gl gedestilleerd water. Water uit glijbaan en 200 gl verdund hematoxyline toepassing slede 30 seconden. Rinse slidegrondig stromend water gedurende 2 min., spoel dan in gedestilleerd water gedurende 30 seconden. Plaats dia in een 60 ° C oven gedurende 15-30 minuten.
- Dompel dia in vers bereide 100% xyleen gedurende 30 seconden, veeg overtollig xyleen af en toe een druppel vaste montage media. Coverslip met een No. 1,5 dekglaasje.
2. Geautomatiseerde Image Acquisition and Analysis
- Laad gebrandschilderde dia's op een automatische dia scanner. Op basis van de diameter, scheiding, en het aantal TMA cores, maken een geautomatiseerde scanprotocol volgens instructies van de fabrikant handleiding.
- Open multispectrale imaging software om een spectrale bibliotheek van controleglaasjes gekleurd met individuele chromogenen en de hematoxyline gekleurd glijbaan bouwen. Open een afbeelding kubus verkregen van een controle glijbaan en selecteer 4-5 positief gekleurde gebieden om optisch te definiëren dat chromogeen. Herhaal dit met kubussen uit andere controleglaasjes totdat er een volledige spectrale bibliotheek representing alle chromogenen wordt gecreëerd, en sla de spectrale bibliotheek.
- Begin een nieuw project binnen multispectrale imaging software. Selecteer "Multispectral (.im3)" voor het beeldformaat optie en 'Helderveld "voor de sample-indeling. Ten eerste, het configureren van het project door te kiezen voor de gewenste opties: "Segment Tissue", "Find Features", "Phenotyping", "Score" en "Export". Op dit punt kan de beeldresolutie worden veranderd om de analyse tijd te versnellen indien gewenst.
3. Tissue Segmentatie
- Importeer de eerder gemaakte spectrale bibliotheek en selecteert u alle chromogenen moeten worden opgenomen in de analyse.
- Open kubussen te worden opgenomen in de training data door het selecteren van de optie "Open Image Cube" in te stellen. Om de nauwkeurigheid opleiding te verzekeren, selecteert u ten minste 18% van het totale aantal beelden te analyseren. Afbeeldingen kiezen dat alle ziektetoestanden vertegenwoordigen segmentatie nauwkeurigheid verhogen. Dit gedeelte van beelden is genaamd de training set van beelden.
- Witbalans beelden in de door het selecteren van de pipet en het kiezen van een gebied een afbeelding die is wit in te stellen training.
- Selecteer "Geavanceerd" knop om naar het weefsel segmentatie. Gebruik de "Tissue Categorieën" paneel om soorten weefsel kiezen om te worden geanalyseerd (ie "tissue" en "niet-weefsel"). Voor nauwkeuriger eiwit weefsellokalisatie, kunnen meerdere categorieën weefsels worden gebruikt (bv. "Epitheel" "stroma" en "non-tissue").
- Beginnen met het maken van het algoritme en het definiëren van weefsel categorieën door het tekenen rond groepen cellen in training beelden. Wanneer u klaar bent met een tissue categorie, herhalen voor andere categorieën weefsel. Zorg ervoor dat groepen cellen kiezen in afbeeldingen die kenmerkend zijn voor die categorie weefseltype zijn.
- Herhaal dit proces voor alle beelden binnen de training set van beelden.
- Select componenten (chromogenen) op te nemen in Training voor de "Tissue Segmenter". Bij het uitvoeren van de analyse van helderveld immunohistochemie beelden, worden alle componenten normaal opgenomen in opleiding. Omvatten overvloedige negatieve kleuring beelden in de set om vertekening tijdens deze stap te vermijden training.
- Kies een geschikte "Patronen Scale" voor de opleiding van het weefsel segmenter. Onder 20x vergroting, een grote patroon schaal is meestal het geval. Bij het werken met weefsels met een fijne architectuur onder hogere vergroting, een kleinere schaal patroon is meer geschikt.
- Selecteer de "Train Tissue Segmenter" knop om te beginnen met het trainen van het weefsel segmenter. Zich aan een pop-up box weergave nauwkeurigheid als gevolg van het aandeel van de pixels binnen de opleiding regio's die goed zijn ingedeeld.
NB: De software voortdurend probeert de juistheid van het algoritme te verbeteren tot handmatig gestopt. We hebben eerder aangetoond dat de opleiding op 18% van de beelden resultaten in 97% training nauwkeurigheid 12. Na het weefsel segmenter is opgeleid, kiest u een passende oplossing segment. Segment resolutie komt overeen met de tijd die nodig is om segment beelden, met grof resolutie die minder tijd en fijne resolutie die meer tijd. - Segment de volledige training set van beelden door te klikken op "segment Images". De software in staat voldoende tijd om het algoritme voor alle training afbeeldingen. Wanneer u klaar bent, bekijk het ingesteld op een verkeerd geclassificeerde weefsel met de huidige opleiding algoritme vinden training.
- Te fine-tunen van het weefsel segmentatie proces, toevoegen, bewerken of verwijderen weefsel training gebieden. Gebruik de optie 'bekleding randen "als pixels verlengen de randen van een weefsel in een andere categorie. Als kleine groepen van pixels worden onrechte, stelt u de drempel van de minimale segment grootte.
- Wanneer bewerkingen zijn voltooid, selecteert u "Segment Images", zal deze re-trein de weefsel segmenter om een nieuw algoritme voor het weefsel segmentatie creëren. Voorgaande algoritmeautomatisch opgeslagen en kunnen worden teruggestuurd, indien gewenst.
- Bij het vertrouwen met weefsel segmentatie algoritme resultaten, gaan naar cel segmentatie door het selecteren van de "Advance" knop.
4. Cell Segmentatie
- Kies de subcellulaire compartimenten worden opgenomen in cel segmentatie. Zorg dat "Kernen" al is geselecteerd voor "cytoplasma" of "Membrane" te kiezen.
OPMERKING: "Membrane" segmentatie mag alleen worden geselecteerd als een membraan-specifieke marker eiwit werd in IHC, zoals E-cadherine. - Binnen het tabblad "Kernen", zijn er verschillende opties. Begin met de juiste instellingen voor de nucleaire segmentatie kiezen (zie stap 4.3). Kies individueel of alle categorieën weefsel zal worden opgenomen in segmentatie.
- Selecteer een aanpak voor de nucleaire segmentatie
- Selecteer de tegenkleuring "pixel-based (Threshold)" -aanpak voor een vereenvoudigde methode voor het verkrijgen van een goederesultaten zonder te weten veel over instellingen voor beeldverwerking.
NB: Dit maakt vaak een goede eerste keus. Bij het selecteren van een benadering, "pixel-based (Threshold)" is meer geschikt wanneer er sprake is van een betrouwbare nucleair contra-vlek, terwijl de "object-based" moet worden gebruikt als er sprake is van een gebrek aan consistente nucleaire tegenkleuring. - Selecteer de "Pixel-Based (Threshold)" benadering wanneer er een betrouwbare nucleaire tegenkleuring.
LET OP: Deze aanpak is puur op basis van pixels. Deze benadering kan ook worden gebruikt voor andere beeldanalyse behoeften die kan worden voldaan met een eenvoudige drempel, zoals registratie van alle pixels binnen een weefsel categorie die positief vlek voor IHC vlek. - Selecteer de objecten gebaseerde benadering als de nucleaire tegenkleuring consistente en specifieke kleuring van de nucleaire objecten niet voorziet, en meer geavanceerde-morfometrie gebaseerde benaderingen zijn nodig om kernen te detecteren.
- Selecteer "Onderdelen voor Nucleaire Segmentation", "Nuclear Size "en" Clean-up "als de gebruiker wenst te kernen segmentatie instellingen verder te definiëren.
- Selecteer de tegenkleuring "pixel-based (Threshold)" -aanpak voor een vereenvoudigde methode voor het verkrijgen van een goederesultaten zonder te weten veel over instellingen voor beeldverwerking.
- Selecteer cytoplasma vorm parameters
- Selecteer de "Advance" knop om naar cytoplasma segmentatie.
NB: Er zijn verschillende mogelijkheden binnen cytoplasma segmentatie om uit te kiezen. De optie aangeduid als "innerlijke afstand tot de kern" is op basis van pixels. Het geeft de afstand tussen de buitenkant van de kern en de binnenkant van het cytoplasma. Het verhogen van deze waarde vermindert de kans dat de nucleaire signaal kruisen over in het cytoplasma compartiment. - Volgende selecteren, "outer afstand tot nucleus".
LET OP: Dit is ook op basis van pixels. Buitenafstand NUCLeUS geeft de afstand tussen de buitenkant van de kern en de buitenkant van de cel. Deze waarde kan groot of klein genoeg op te nemen of uit te sluiten membraan signalen desgewenst worden ingesteld. - Volgende selecteren, "minimummaat".
LET OP: De minimale grootte, Pixel gebaseerde, weerspiegelt het cytoplasma minimale monstergrootte moeten worden opgenomen in de analyse. Indien het cytoplasma kleiner is in een bepaalde cel zoals wanneer cellen dicht op elkaar zitten, wordt dit cytoplasma segmentatie uitgesloten van analyse. - Selecteer de volgende optie, "Component" met "Primair", "Secundair", en selecteer "Tertiaire" als secundaire opties.
LET OP: Hier kan men een specifiek cytoplasma marker te kiezen. Soortgelijke nucleaire segmentatie, indien een specifiek cytoplasmatisch IHC marker is gebruikt, kan deze component worden gebruikt om het cytoplasma te definiëren door het vinden van een minimum drempelwaarde. Dit helpt bij het bepalen van het cytoplasma, maar is niet noodzakelijk voldoende nauwkeurigheid. - Verhuizen naar de laatste van de drie tabbladen opties is "Membrane". Hier definieert de gebruiker het membraan met daarop een marker proteïne. Kies "Primair", "Secundair" en / of "Tertiair" voor elk membraan specifieke marker gebruikt. Adjust "Full Scale OD "naar een minimumdrempel of een positief voor elke marker op celmembranen te vinden.
- Voortzetting van onder het tabblad "Membrane" en selecteer de optie "Maximum Cell Size".
LET OP: Dit is de afstand tot membraan waarde in pixels, waarbij de maximale grootte van de cellen aangeeft. Een waarde van 12 is normaliter toereikend voor opnamen met 20X vergroting. - Na het selecteren van alle opties, selecteer "Segment Afbeelding" of "Segment All". Pas de instellingen toe om beelden en observeren hen "individueel" of "Galerij" mode.
LET OP: Pas de instellingen en drempels, indien nodig, en re-segment tot tevreden met mobiele segmentatie resultaten in de training set van beelden.
- Selecteer de "Advance" knop om naar cytoplasma segmentatie.
5. Fenotypering van Cellen
LET OP: Accurate cel segmentatie is nodig om nauwkeurige cel fenotypering te verkrijgen, en de fenotypering functie is trainbaar.
- Gebruik de "Add &# 34; knop om fenotypes toe te voegen aan de 'Phenotypes "lijst. Gebruikers kunnen een kleur voor het fenotype te selecteren.
- Klik op "Edit fenotypes" naar een fenotype toe te wijzen aan een cel. Klik op een bepaalde cel om een drop-down menu op te roepen, zodat de gebruiker om het fenotype te kiezen en ga dan verder. Identificeren van ten minste vijf (5) cellen in elk fenotype om verder te gaan. De waarde 25 of meer cellen van elk fenotype vereist om optimale resultaten te bereiken.
6. Scoring IHC en Co-lokalisatie
- Kies "Advance" om naar de "Score IHC of IF" stap. Kies een "Tissue Category" te scoren.
Opmerking: aan een weefsel categorie kan worden gemaakt in een bepaalde analyse, maar als verkregen cijfers worden de andere categorie weefsel gewenst, kan de analyse worden herhaald later met andere instellingen. - Kies de gewenste "Scoring" type.
LET OP: Positiviteit maakt twee bakken (positieve en negatieve) voor een onderdeel van belang, Terwijl de dubbele positiviteit wordt gebruikt voor co-lokalisatie analyse. Andere opties zijn 4-bin, 10-bin, en 50-bin analyses voor een marker van keuze. - Kies de cel "bakje" voor gebruik in het maken van analyses.
- Net als bij het vinden van een minimumdrempel voor de primaire nucleaire component, selecteert u "View Component Data" en beweeg de cursor over de training afbeeldingen om passende optische dichtheid minimumdrempels van kleuring te vinden voor de positieve cellen voor de component (s) van belang.
- Als intens gekleurde cellen moeten worden uitgesloten, hoe lager de drempel max op een geschikt niveau. Gebruik anders de auto-knop om een drempel maximum voor analyse te kiezen.
- Kies het trainen van afbeeldingen om te scoren om drempelwaarden waarden te valideren.
NB: Het percentage cellen in een bepaalde bak wordt geretourneerd en kan worden vergeleken door visueel onderzoek of handmatige telling. Eenmaal voltooid, selecteert u "Advance" om door te gaan naar "Export" stap.
- Test het algoritme gemaakt door weefsel segmentatie, cel segmentatie, en scoren waarden door de uitvoer van de gegevens voor de training set. Volg de aanwijzingen om een nieuwe map te maken voor de export directory. Selecteer afbeeldingen en tabellen worden gemaakt en opgenomen in de analyse. Voer de analyse door te kiezen voor "Export for All".
- Tafels worden uitgevoerd in door tabs gescheiden tekstbestanden en kunnen worden geopend in de meeste programma's voor gegevensanalyse.
- Bij analyse is voltooid, kijkcel segmentatie en scoring data voor beelden met zowel hoge als lage kleuring nauwkeurigheid instellingen evalueren.
- Wanneer u tevreden bent met de instellingen, van toepassing het algoritme gemaakt op basis van de training set van beelden naar de volledige reeks van beelden door middel van batch-analyse. Klik op het tabblad "Batch Analysis" en de geopende algoritme zal worden gekopieerd van het actieve project.
- Kies een nieuwe export directory en selecteren welke afbeeldingen en tables worden opgenomen in de analyse. Onder de optie input-bestanden, selecteer "Beelden toevoegen" en kies alle afbeeldingen moeten worden opgenomen in de batch-analyse.
- Voer de analyse door de optie "Run". Net als bij de analyse van de trainingsset, zal deze stap een variabele hoeveelheid tijd nodig, afhankelijk van de specifieke instellingen en het aantal beelden opgenomen in de analyse.
- Als ze klaar zijn, gaan naar het "/ Samenvoegen beoordeling" tab. De batch directory standaard naar de export directory van de batch-analyse en kan desgewenst worden veranderd. Selecteer 'Inclusief alle "en selecteer" Merge "naar data sheets met de samenvatting van de gegevens voor analyse te maken.
8. Analyse van de geëxporteerde gegevens
- Open geëxporteerde tabellen in de data-analyse software en verwijderen of data kolommen die niet relevant zijn voor de analyse, zoals de minimale en maximale waarden voor elke component te verbergen. De primaire gegevens die in analyse van de gemiddelde optische dichtheid column voor elke component.
- Beoordeling geëxporteerd segmentatie kaarten en RAW-afbeeldingen om te bepalen welke monsters of TMA kernen van de analyse uit te sluiten zijn. Tissue percentages moeten bepalen of een monster moet worden opgenomen of niet met een willekeurige cutoff van <5% meestal gebruikt voor uitsluitingscriteria.
- Verwijderen irrelevante gegevens of rijen met monsters van gegevensanalyse worden uitgesloten.
- Gebruik eiwit kwantificering gegevens op veranderingen in de ziekte staat of de relatie met clinico-pathologische kenmerken van de ziekte 12,18-21 onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In figuur 1 is training uitgevoerd op prostaatweefsel segmenteren afbeeldingen in epitheliale en stromale delen, tezamen met het niet-weefselcompartiment. Via de epitheliale membraan marker E-cadherine werd cel segmentatie uitgevoerd om de kern, cytoplasma en membraan gedeelten, getoond in figuur 2 te scheiden.
In één experiment gebruikten we gemultiplexte IHC om de expressie en lokalisatie van AR, ERa, E-cadherine en CD147 onderzoeken, zie figuur 3. Met deze technieken kunnen we cellen positief voor nucleaire expressie van zowel ERa en identificeren AR (Figuur 3B - 3C) ondanks overlappende colorimetrische signalen, zoals getoond met groene pijlen in figuur 3A. We vonden duidelijke verschillen in het aantal dubbele positieve stromale cellen in verschillende staten van prostate ziekte (Figuur 3D). We gekwantificeerd celmembraan-specifieke expressie van CD147 met behulp van E-cadherine als een marker eiwit (rode pijlen in figuur 3A), en we waren de eerste groep om membraan specifieke CD147 expressie in prostaat weefsels te onderzoeken. We vonden een significante afname van CD147 expressie in associatie met prostaatkanker progressie (figuur 3E) en vonden een belangrijke associatie met postoperatieve prognose 19.
Er zijn gevallen waarin een slechte experiment ontwerp kan leiden tot onnauwkeurige weefsel segmentatie. In figuur 4, het algoritme toegepast op een reeks weefsels niet nauwkeurig segment epitheliale en stromale compartimenten (Figuur 4C). In dit experiment, α-gladde spier actine (α-SMA) gebruikt voor het stromale compartiment markeren. Omdat α-SMA en gladde spier wordt verminderd of verloren in sommige tumoren (Figure 4A), het algoritme gemaakt door weefsel segmentatie (Figuur 4B) was niet in staat om nauwkeurig onderscheid te maken tussen epitheliale en stromale vakken vanaf morfometrische data alleen. Voorzichtigheid is geboden bij het kiezen van eiwit markers voor weefsels of cellen compartimenten.
Figuur 1: Tissue Segmentatie Met behulp van multispectrale Software. Een prostaatweefsel microarray werd gekleurd met behulp van multiplex immunohistochemie voor androgeenreceptor (AR), oestrogeen receptor-alpha (ERa), E-cadherine, en CD147. Een set van training beelden werden geïmporteerd in multispectrale imaging software die soorten weefsel en ziekten van de hele reeks van beelden (A). Weefsel categorieën zijn gemaakt met inbegrip van stroma (groen), epitheel (rood), en niet-weefsel (blauw), en categorieën werden gedefinieerd door met de hand tekenen op de topvan de opleiding foto's (B). Na het tekenen van op training beelden, een algoritme voor het weefsel segmentatie is gemaakt en toegepast op de training set afbeeldingen (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Cel Segmentatie naar nucleaire, cytoplasmatische en membraan compartimenten. De nucleaire compartiment werd gedefinieerd voor mobiele segmentatie door het instellen van een minimumdrempel voor hematoxyline tegenkleuring (A). Het cytoplasma is gedefinieerd ten opzichte van de kern met vooraf ingestelde algoritme binnen de software (B). E-cadherine werd gebruikt als een membraan merker en een minimale gemiddelde OD drempel aangebracht op het membraancompartiment (C) definiëren. Deze techniek Alleows gelijktijdige kwantificering van eiwitexpressie in alle subcellulaire compartimenten (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van Co-lokalisatie en membraan-eiwitexpressie. Multiplexed IHC werd gebruikt om de expressie en lokalisatie van androgeen receptor (AR), oestrogeen receptor-alpha (ERa), E-cadherine en CD147 (A) onderzocht. DAB (bruine chromogeen) werd gebruikt voor AR (B) en een rode chromogeen gebruikt om aan te geven ERa (C) te markeren. We konden ruimtelijk overlappende biomarkers (groene pijlen in A) en kwantificeren (D) het percentage van cellen met kern co-lokalisatie van ERa en ARbinnen prostaat stroma. Via E-cadherine (black chromogeen) naar de plasmamembraan (rode pijlen in A) definiëren we gekwantificeerd membraan-specifieke expressie van CD147 in prostaatweefsel (E) 19. One-way variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt voor statistische analyse, error bars weerspiegelen standaardafwijking van het gemiddelde, en sterretjes vertegenwoordigen p <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Onvoldoende Weefsel Segmentatie Als gevolg van Experimental Design. Goedaardige en kwaadaardige prostaatkanker weefsels werden gekleurd voor α-gladde spier actine (α-SMA, groen chromogeen), androgene receptor (rood chromogeen) en androgene receptor variant 7 (DAB chromogeen). a-SMA gebruikt alseen marker van stroma en daalden bij sommige tumoren, waaronder prostaat (A). Toen training werd uitgevoerd (B) en het weefsel segmentatie algoritme werd toegepast, de stromale en epitheliale compartimenten waren onvoldoende gesegmenteerd te wijten aan de afwezigheid van α-SMA kleuring (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van traditionele immunohistochemie gaan eiwitexpressie wordt beperkt door subjectieve, semi-kwantitatieve analysemethoden 22,23. Advance platforms zijn gemaakt voor high-throughput analyse van biomarker expressie en lokalisatie. Gedetailleerde segmentatie van zowel weefsel en subcellulaire compartimenten kunnen gebruikers biomarker expressie, lokalisatie, en co-lokalisatie te studeren met andere markers van belang. In eerdere studies hebben we het nut van IHC en multispectrale, vooral wanneer gebruikt om eiwitten gelokaliseerd op hetzelfde cellulaire compartiment 18,20,21 onderzoeken aangetoond. In combinatie met weefsel microarrays 24, deze technieken zorgen voor een snellere en meer objectieve kwantificering van eiwitexpressie dan toegestaan door handmatige analyse door een patholoog.
Een probleem met het gebruik van immunohistochemie voor eiwitkwantificering is irreproducibility resultaten vanwege de subjectieve aard analyse en inherente verschillen in techniek en reagentia. Een belangrijk voordeel van platforms zoals multispectrale voor het meten van eiwitexpressie is reproduceerbaarheid. Gegevens van geautomatiseerde pathologie platforms correleert sterk met handmatige analyse door een patholoog, terwijl de terugkeer van gegevens in een continu-formaat en een aanzienlijke vermindering van de werktijd, in het bijzonder bij het werken met grote steekproef maten 12,16,25. Studies hebben aangetoond hoge totale overeenstemming tussen de resultaten van verschillende multispectrale platforms 14. Verder hebben we eerder aangetoond dat kleuringen zeer reproduceerbaar zelfs wanneer er variatie in het aantal eiwitten onderzocht 12. Het gebruik van geautomatiseerde pathologie platforms zowel kleuring en analyse voorkomt niet alle afwijkingen in de resultaten, zoals die voortvloeien uit antilichamen gemaakt aan verschillende epitopen, maar door deze platforms hoofdzaak vertekening en ir verminderenreproduceerbaarheid vaak geassocieerd met immunohistochemie.
Er zijn bepaalde stappen in het protocol die essentieel zijn voor de terugkeer van accurate, reproduceerbare resultaten zijn. Passende experimenteel ontwerp door de keuze van eiwitten te worden opgenomen als weefsel of subcellulaire markers is van belang voor een nauwkeurige segmentatie. Bij het uitvoeren van positiviteit analyse, het selecteren van een lagere drempel voor positieve kleuring heeft een groot effect op de uiteindelijke resultaten. Het kiezen van een drempelwaarde voor "on / off" eiwitten zoals nucleaire transcriptiefactoren is vrij eenvoudig, het vinden van een drempelwaarde voor meer heterogeen tot expressie gebrachte eiwitten wordt moeilijk. Deze moet idealiter worden uitgevoerd in samenwerking met een board-gecertificeerd urogenitale patholoog of als een gemiddelde score over meerdere waarnemers naar de ideale drempel voor analyse te vinden.
Het is belangrijk om een aantal beperkingen van de huidige versies van deze technologie herkennen. toen deklaringsmiddel het cytoplasma compartiment, kunnen drie benaderingen worden gebruikt: (1) kleuring met een cytoplasma-specifieke marker, (2) kleuren met een membraan-specifieke merker en met behulp van de kern naar membraan marker afstand cytoplasma, en (3) met behulp een tekening benadering van de grenzen van het cytoplasma handmatig definiëren ten opzichte van de kern. Onze ervaring is toepassing van een membraan-specifieke marker is de meest nauwkeurige techniek. De handmatige tekening benadering gewoonlijk nauwkeuriger als kernen centraal gelegen of indien de biomarker plaats gelijkmatig verdeeld over het cytoplasma. Nauwkeurig bepalen van het cytoplasma van stromale cellen zoals fibroblasten en gladde spiercellen blijft moeilijk en rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van een experiment.
Een andere beperking van de techniek is de afhankelijkheid van kernen voor mobiele segmentatie. Als vlak van sectie de kern van een bepaalde cel uitsluit, zal deze cel niet worden opgenomen in de analyse. Als er geenzichtbaar cytoplasma tussen aangrenzende kernen of bosjes kernen, deze worden vaak gezien als een grote nucleaire brok, in plaats van verschillende kernen. In het algemeen, hematoxyline tegenkleuring is normaal gesproken voldoende voor aanvaardbare nucleaire segmentatie, en manipulatie van software-instellingen, zoals maximale drempel voor nucleus formaat kunnen de meeste problemen met de nucleaire segmentatie te lossen.
Een laatste beperking van geautomatiseerde pathologie platforms is onbetrouwbaar segmentatie van weefsels als gevolg van slechte experimenteel ontwerp. Het belang van het kiezen van de juiste weefsels en cellen biomarkers voor het beantwoorden van de vraag van belang kan niet worden overschat. Zoals we in onze representatieve resultaten laten zien, kan een epitheliale of stromale marker die aanzienlijk verandert expressie tussen de ziekte van staten problemen opleveren bij het maken van een algoritme voor het weefsel segmentatie. Vermeldenswaard is dat er alternatieve opties als moeilijk analyseert als deze zich voordoen. Bijvoorbeeld, individuele images kunnen worden geanalyseerd door alle weefselcompartimenten hand tekening, plaats door toepassing van een algoritme van een trainingsset van beelden. Dit biedt het voordeel van segmentatie die perfect in lijn met wat de gebruiker wenst, maar introduceert ook subjectiviteit en kan een aanzienlijke verhoging van de tijd die nodig is om een analyse te voltooien. Passende experimenteel design is de makkelijkste manier om de analyse te versnellen en de nauwkeurigheid van de weefsels en cellen segmentatie te maximaliseren.
Deze technologie en protocol hebben veel toekomstige toepassingen. Tal van biomarkers voor bepaalde ziekte staten zijn geïdentificeerd, maar niet gevalideerd. Hoge doorvoer objectieve analyse met multispectrale platforms faciliteert validatie van deze biomarkers. Verder kan de evaluatie van de expressie en co-lokalisatie van meervoudige eiwitten inzichten in slecht begrepen signaalroutes verschaffen. Ongetwijfeld, het verminderen van de inherente subjectiviteit in verband met de analyse van immunohistochemisch staining is waardevol voor het begrijpen van de expressie en lokalisatie van uiteenlopende eiwit markers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken de Universiteit van Wisconsin Translational Research Initiatives in Pathologie laboratorium, mede ondersteund door de UW afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde en UWCCC subsidie P30 CA014520, voor het gebruik van de faciliteiten en diensten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
- Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
- McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
- Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
- Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
- Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
- Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
- Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
- Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
- Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102 (2014).
- Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
- Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549 (2015).
- Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
- Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).
