Introduction
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקת מעבדה סטנדרטית עבור זיהוי של חלבון בתוך רקמות, IHC עדיין נעשה שימוש נרחב הוא במחקר והן פתולוגיה אבחון. ההערכה של מכתים IHC היא בדרך כלל חצי כמותית, החדרת הטיה פוטנציאלית לתוך פרשנות של תוצאות. רבי גישות וכמותיות פותחו אשר משלבות הוא בעצמה מכתימה והיקף מכתים לתוך אבחנה סופית 1-4. מערכות אחרות כוללות עוצמת ניקוד ומיקום subcellular כדי למקם טוב יותר ביטוי 5. התאגדות של ממוצע ציונים של צופים רבים לעתים קרובות מנוצלת כדי למזער את ההשפעות של צופה יחיד הטיה 6. למרות מאמצים אלה, הסובייקטיביות ניתוח עדיין נשאר, במיוחד כאשר אנו מעריכים את מידת מכתים 7. סטנדרטיזציה פרוטוקול וסובייקטיביות מזעור מכניסת האדם הוא בעל חשיבות עליונה ליצירת תוצאות IHC מדויק, לשחזור.
תוכן "> ישנן אפשרויות אחרות מלבד IHC לקביעת ביטוי חלבון בתוך רקמות. בתוך מערך המחקר, אימונוהיסטוכימיה נצפתה באופן מסורתי כאמצעי לבחון חלבון לוקליזציה 8, ואילו טכניקות אחרות כגון immunoblotting נתפסות תקן זהב על חקירת ביטוי חלבון . רקמת קביעה או תא תא ספציפי ביטוי קשה בלי שילוב של טכניקות מתקדמות כגון לכידת ליזר חלוק או תא microdissection 9,10. שימוש נוגדני ניאון בשקופיות רקמות מציע פשרה סבירה, אבל autofluorescence רקע בשל NADPH, lipofuscins, רשתי סיבי קולגן, ואלסטין יכול לעשות quantitation מדויק קשה 11.פלטפורמות פתולוגיה חישובית אוטומטיות הן כיוון מבטיח אלקטרוני כדי לכמת את המטרה יותר של מכתים פתולוגיה 12-15. שילוב הדמיה multispectral עם microarrays רקמותמאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של ביטוי חלבון מדגם גדולה. בעזרת שיטות אלה, ניתוח של שיתוף לוקליזציה חלבון, ההטרוגניות מכתימים, ורקמות ולוקליזציה subcellular אפשרי תוך צמצום ניכר הוא הטיות מובנהיות וסיכון זמן דרוש לניתוח, תוך חזרת נתונים רציף ולא 16 בפורמט הקטגורים. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה להדגים את התועלת של ומתודולוגיה לביצוע אימונוהיסטוכימיה מרובב עם ניתוח, באמצעות תוכנת הדמיה multispectral.
פרוטוקול זה נכתב עבור ידני, מכתים immunohistochemical זמני של שקופית קטע רקמה אחת עם ארבעה נוגדנים חד שבטיים מותאמים. כניסוי נציג, אלפא קולטן אסטרוגן נגד ארנב גרעיני (ERα) ו קולטן האנדרוגן (AR) הם multiplexed עם קרום הנכנס אנטי עכבר CD147 קרום הנכנס אנטי עכבר E-cadherin. כל נוגדן של בחירה עשוי להיות substitutאד עבור הנוגדנים המפורטים להלן, אבל כל שילוב של נוגדנים דורש אופטימיזציה נפרד. טיפול קדם לכל הנוגדנים חייב להיות זהה. נוגדני AR ו CD147 צריכים להיות מותאמים באופן אינדיבידואלי ולאחר מכן כמו קוקטייל. כל נוגדן מזוהה באמצעות מערכת פולימר ללא ביוטין ואחד 4 chromogens ייחודי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול במסמך מתאר מכתים וניתוח של microarray רקמות (TMA), שתואר לעיל 12,17,18. 4 מיקרומטר עבה סעיף TMA הושג מבלוק פרפין באמצעות microtome סטנדרטי.
הערה: ספרייה ספקטרלי עבור 4 chromogens ו counterstain יש ליצור אלקטרוני כדי לכמת את התמונה. על מנת לעשות זאת, פרוטוקול אופטימיזציה עבור כל נוגדן פרט צריך לרוץ עם נוגדן אחד לכל שקופית, מינוס counterstain הסופי. שקופית חמישית צריכה להיות מוכתמת hematoxylin לייצר 5 התמונות הדרושות כדי ליצור את ספריית הרפאים.
1. Multiplex אימונוהיסטוכימיה
- מגלשות אופים בתנור C 60 מעלות במשך 20 דקות. שימוש במנדף כימי, לטבול שקופיות קסילן 100%. חזור על 2 שינויים של קסילן. לטבול שקופיות באתנול 100% במשך 5 דקות. חזור עם אתנול 100% טרי.
- לטבול שקופיות באתנול 95% במשך 3 דקות. חזור עם טרי95% אתנול. לטבול שקופיות באתנול 70% במשך 3 דקות. לטבול שקופית במים מזוקקים במשך 3 דקות. חזור עם מים מזוקקים טריים. שקופית קש אנכית לניקוז מים משקופית. החל 200 μl של חוסם peroxidase אנדוגני מוכן לשימוש במשך 5 דקות.
- מסננים חוסם peroxidase משקופית וטבלו 45 מ"ל מוכן לשימוש חיץ אחזור (pH פחות מ 7.0). מקום מיכל שקופיות בתוך סיר לחץ ותכנית להתחיל מוגדר 124 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. אפשר בסיר לחץ להתקרר במשך 20 דקות. לפני הפתיחה.
- סור מכל של חיץ יחזור להתקרר 10 דקות נוספות. יש לשטוף שקופית במים מזוקקים למשך 10 דקות. מסנני מים משקופית ובזהירות להתוות את הרקמה בשקופית עם עט מחסום הידרופובי.
- הוסף 200 μl של פוספט בופר סליין (PBS) .Transfer שקופיות אל כלי קיבול שטוח עם מכסה (תא דגירה) המכיל גזה לחה.
- כן 1 ליטר 1x טריס שנאגר מלוח עם Tween-20 (TBST) על ידי דילול 50 מ 'l של 20x טריס שנאגרו מלוחים המכיל 1% Tween-20 ו -950 מ"ל מים מזוקקים.
- מסננים PBS משקופית ולהחיל 200 μl של 1x TBST. דגירה 2 דקות. מסנני TBST משקופית ולחזור שקופיות בתא דגירה. החל 200 μl של מוכן לשימוש בלוק חלבון אוניברסלי, תא קרוב דגירה במשך 7 דקות.
- מסננים לחסום חלבון ולחזור שקופיות בתא דגירה. לדלל נוגדן אנטי ERα 1: 400 על ידי הוספת 0.6 μl של נוגדנים 239.4 μl של diluent נוגדן. החל 200 μl של נוגדן מדולל להחליק קאמרי קרוב.
- דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. מסנני נוגדן משקופית ולשטוף עם TBST ואחריו טבילה למשך 5 דקות ב TBST.
- מסנני TBST משקופית ולחזור שקופיות בתא דגירה. החל 200 μl של מוכן לשימוש עז פולימר peroxidase חזר נגד הארנב קאמרי קרוב. דגירה למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר. שקופית לשטוף עם שקופיות TBST ומניחים מיכל של TBST במשך 5 דקות. </ Li>
- כן חזרת חום peroxidase-3,3'-diaminobenzidine (HRP-DAB) אַב צֶבַע ידי הוספת 8 μl של אַב צֶבַע DAB 250 μl חיץ DAB מצע ערבוב טוב.
- מסננים TBST משקופית, בתמורה שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של אַב צֶבַע חום HRP-DAB עבור 6 דקות. לשטוף ביסודיות את השקופית עם מים מזוקקים במקום שקופיות במיכל של מים מזוקקים.
- מערבבים את הפתרון denaturing ידי שילוב 50 μl של מגיב elution הראשון עם 150 μl של מגיב חיץ השני. מסננים מים את השקופית וליישם פתרון denaturing מדולל לשקופית במשך 3 דקות. בטמפרטורת החדר. למזוג ולשטוף denaturing מגיב עם TBST. לטבול שקופיות ב TBST במשך 5 דקות.
- הכן קוקטייל נוגדנים AR / CD147 ידי דילול 4.2 μl של נוגדן anti-AR ו -2.8 μl של נוגדן אנטי CD147 עם 203 μl של diluent נוגדן. מסננים TBST משקופית, לחזור שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של ג AR / CD147ocktail לשקופית. תא סגור דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות עם TBST וטבלו TBST במשך 5 דקות.
- מסננים TBST, בתמורה שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של פולימר phosphatase אלקליין מוכן לשימוש עז נגד ארנב. תא סגור שקופיות דגירה במשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות עם TBST וטבלו TBST במשך 5 דקות.
- הכן phosphatase אלקליין אדום אַב צֶבַע על ידי הוספת 3.2 μl של אַב צֶבַע אדום 250 μl אדום חיץ אַב צֶבַע ומערבבים היטב.
- מסנני TBST משקופית ולחזור שקופיות בתא דגירה. החל 200 μl של אַב צֶבַע phosphatase אלקליין אדום מדולל לתא שקופיות, קרוב דגירה במשך 7 דקות.
- מסנני אַב צֶבַע וביסודיות לשטוף שקופיות עם מים מזוקקים. מניחים שקופיות במיכל של מים מזוקקים למשך 5 דקות. מסנני מים משקופית, לשטוף עם TBST ולחזור בתא דגירה. החל 200 μl עז פולימר אנטי עכבר HRP לשקופית קלותא דואר. דגירה למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר.
- מסנני פולימר משקופית ולשטוף עם TBST. שקופית מקום ב TBST במשך 5 דקות. הכן 200 μl של אַב צֶבַע סגול צמודי HRP על ידי הוספת 3.2 μl של מגיב ייצוב 250 μl של חיץ ומערבבים היטב. להוסיף 3.2 μl של אַב צֶבַע סגול ומערבבים היטב, ולאחר מכן 3.2 μl של מגיב מי חמצן ומערבבים היטב.
- מסננים TBST את השקופית וליישם 200 μl של אַב צֶבַע סגול מוכן להחליק דגירה במשך 7 דקות. בטמפרטורת החדר. שקופית לשטוף עם מגלשת מים ומקום מזוקק במכל של מים מזוקקים למשך 5 דקות.
- מערבבים את הפתרון denaturing על ידי ערבוב 50 μl של מגיב elution הראשון עם 150 μl של מגיב חיץ השני. מסננים מים את השקופית וליישם פתרון denaturing מדולל לשקופית במשך 3 דקות. בטמפרטורת החדר.
- לשטוף denaturing מגיב הסתלק TBST. מניחים שקופיות במיכל של TBST במשך 5 דקות. לדלל נוגדן אנטי E-cadherinעד 1: 200 על ידי הוספת נוגדנים 1.1 μl אל 218.9 μl diluent נוגדן. מסננים את TBST משקופית, בתמורה שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 μl של E-cadherin לשקופית. תא סגור דגירה 30 דקות. בטמפרטורת החדר.
- שקופית לשטוף עם שקופיות TBST ומניחים מיכל של TBST במשך 5 דקות. מסננים את TBST משקופית, לחזור שקופיות בתא דגירה ולהחיל 200 פולימר HRP אנטי עכבר μl עז. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שקופית לשטוף עם שקופיות TBST ומניחים מיכל של TBST במשך 5 דקות.
- כן אַב צֶבַע HRP צמוד השחור על ידי הוספת 8 μl של אַב צֶבַע 250 חיץ μl. החל 200 μl אַב צֶבַע להחליק ולפתח 2 דקות. לשטוף ביסודיות שקופיות עם מים מזוקקים וטבל מיכל של מים מזוקקים.
- לדלל hematoxylin על ידי הוספת 40 μl hematoxylin 200 μl מים מזוקקים. מסנני מים משקופית ולהחיל 200 μl של hematoxylin בדילול להחליק במשך 30 שניות. שקופית לשטוףביסודיות במים זורמים מהברז למשך 2 דקות., ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים למשך 30 שניות. שקופית מקום בתנור C 60 מעלות במשך 15-30 דקות.
- לטבול שקופיות קסילן וטרי 100% למשך 30 שניות, לנגב קסילן עודף לסרוגין להוסיף טיפה אחת של תקשורת הרכבה קבעה. Coverslip עם coverslip מס '1.5.
2. רכישת תמונה אוטומטית וניתוח
- טען שקופיות מוכתמות על סורק שקופיות אוטומטי. בהתבסס על הקוטר, הפרדה, מספר ליבות TMA, ליצור פרוטוקול סריקה אוטומטית על פי הוראות ההפעלה של היצרן.
- תוכנת הדמית multispectral להרחיב לבנות ספריית רפאים מן השקופיות מלאות מוכתמות chromogens הפרט לבין השקופיות מוכתמות hematoxylin. פתח קוביית תמונת רכש שקופית מלאה ולחץ על ארבעה לחמישה תחומים עיקריים מוכתמים חיובי להגדיר אופטי כי אַב צֶבַע. חזור עם קוביות תמונת שקופיות בקרה אחרות עד representi ספרייה ספקטרלי מלאng כל chromogens נוצר, ולאחר מכן שמור את הספרייה רפאים.
- בגין פרויקט חדש בתוך תוכנת הדמיה multispectral. בחר "Multispectral (.im3)" עבור האפשרות פורמט התמונה ואת "Brightfield" עבור פורמט דגימה. ראשית, להגדיר את הפרויקט על ידי בחירת אפשרויות רצויות: "רקמות מגזר", "מצא את התכונות", "phenotyping", "ציון" ו "יצוא". בשלב זה, את רזולוציית התמונה ניתן לשנות כדי לזרז את זמן הניתוח אם תרצה בכך.
פילוח רקמות 3.
- ייבא את ספריית ספקטרלי שנוצרו בעבר ובחר כל chromogens להיכלל בניתוח.
- קוביות פתח את התמונה כדי להיכלל נתוני האימון להגדיר על ידי בחירת האפשרות "פתח תמונה Cube". כדי להגיע לרמת דיוק הדרכה, לבחור לפחות 18% של המספר הכולל של תמונות כדי להיות מנותח. בחר דימויים המייצגים את כל מצבי מחלה מנת לשפר את דיוק פילוח. חלק של תמונות זה אניהים שנקרא אימון הקבוצה של תמונות.
- תמונות איזון לבנות באימון שקבע בחירת הכלי טפטף עין ובחירת שטח בתמונה אחת כי הוא לבן.
- "מראש" בחר כפתור לעבור פילוח רקמות. השתמש בלוח "קטגוריות רקמות" לבחור סוגי רקמות להיות מנותח (כלומר "רקמה" ו- "לא-רקמות"). עבור לוקליזציה רקמת חלבון מדויקת יותר, קטגוריות רקמות מרובות ניתן להשתמש (כלומר. "Epithelia," "stroma," ו "רקמות שאינן").
- התחל ביצירת האלגוריתם והגדיר קטגוריות רקמה על ידי ציור סביב קבוצות של תאים בתוך תמונות אימונים. כאשר סיים עם קטגוריה ברקמה אחת, חזור עבור קטגוריות רקמה אחרות. הקפד לבחור קבוצות של תאים בתוך דימויים אופייניים לסוג בקטגורית רקמה.
- חזור על התהליך עבור כל התמונות בתוך אימון קבוצה של תמונות.
- רכיבים בחר (chromogens) להיכלל traiנינג עבור "Segmenter רקמות". בעת ביצוע ניתוח של תמונות אימונוהיסטוכימיה brightfield, כל הרכיבים כלולים בדרך כלל באימונים. כלול תמונות מכתימות שליליות בשפע האימונים להגדיר כדי למנוע הטיה במהלך שלב זה.
- בחר "סולם תבנית" מתאים לאימון segmenter הרקמות. תחת 20X גדל, בקנה מידת דפוס גדול הוא בדרך כלל מתאימה. כשעובדים עם רקמות עם הארכיטקטורה קנס בהגדלה גבוהה, בקנה מידה דפוס קטן מתאים יותר.
- בחר בלחצן "רקמות רכבת Segmenter" כדי להתחיל באימון segmenter הרקמות. שים דיוק מוקפץ תיבת מוצגות משקף השיעור של פיקסלים בתוך אזורי אימון מסווגות כראוי.
הערה: התוכנה ללא הרף מנסה לשפר את הדיוק של האלגוריתם עד הפסיק באופן ידני. אנחנו הוכחנו בעבר כי הכשרה ב -18% של תוצאות תמונות דיוק אימון 97% 12. לאחר רקמת segmenter מאומן, לבחור ברזולוציית קטע מתאימה. מגזר ברזולוציה תואמת הזמן הנדרש תמונות מגזר, עם רזולוציה גסה הדורשת זמן פחות ונחישותו הנאצלת הדורשים יותר זמן. - מגזר להגדיר את האימון כולו של תמונות על ידי לחיצה על "תמונות מגזריות". אפשר בפעם התוכנה נאותה ליישם את האלגוריתם על כל תמונות האימון. בסיום, לסקור את האימון מוגדר למצוא את כל רקמת סיווג שגויה עם אלגוריתם אימון הנוכחי.
- כדי לכוונן את תהליך פילוח הרקמות, להוסיף, לערוך, או להסיר אזורי אימון רקמות. השתמש באפשרות "קצוות לקצץ" אם פיקסלים להאריך בשולי בקטגוריה רקמה אחת לאחרת. אם מאפשרים לקבוצות קטנות של פיקסלים מסווגות באופן שגוי, להתאים את הסף על גודל פלח המינימום.
- כאשר עריכות הושלמו, בחר "תמונות מגזר", זה יהיה להתחיל מחדש לאמן את segmenter רקמות ליצור אלגוריתם חדש עבור פילוח רקמות. האלגוריתם הקודםהוא נשמר באופן אוטומטי וניתן חזר במידת הצורך.
- כאשר בטוח עם תוצאות אלגוריתם פילוח רקמות, להתקדם פילוח תא על ידי לחיצה על הכפתור "המתקדם".
חלוקת תאים 4.
- בחר את התאים subcellular להיכלל פילוח התא. ודא כי "גרעינים" כבר נבחרו לבחור "הציטופלסמה" או "ממברנה".
הערה: "ממברנה" פילוח צריך להיבחר רק כאשר סמן חלבון ספציפי קרום נכלל IHC, כגון E-cadherin. - בכרטיסייה "גרעינים", יש כמה אפשרויות. התחל בבחירת הגדרות מתאימות עבור פילוח גרעיני (ראה שלב 4.3). בחר אם קטגוריות פרט או כל רקמה תיכללנה פילוח.
- בחר בגישה עבור פילוח גרעיני
- בחר את counterstain "פיקסל מבוסס (Threshold)" גישה עבור שיטה פשוטה לקבלה טובהתוצאות בלי לדעת הרבה על הגדרות עיבוד תמונה.
הערה: זו הופכת את הבחירה הראשונה טובה. בעת בחירת גישה, "פיקסל מבוסס (Threshold)" הוא מתאים יותר כאשר יש כתם מונה גרעיני אמין, בעוד "אובייקט מבוסס" אמור לשמש אם קיים מחסור של counterstain הגרעיני העקבי. - בחר את הגישה "פיקסל המבוסס (Threshold)" כשיש counterstain גרעיני אמין.
הערה: גישה זו היא אך ורק פיקסל מבוסס. גישה זו יכולה לשמש גם לצרכי ניתוח תמונה אחרים שיכול להיות מרוצה עם סף פשוט, כגון איתור כל הפיקסלים בתוך קטגורית רקמה להכתים חיובי עבור כתם IHC. - בחר את הגישה מבוססת אובייקטים אם counterstain הגרעיני אינו מספק מכתים עקבי עצמים מסוימים גרעיניים, גישות המבוססות morphometry מתקדמות יותר יש צורך לזהות גרעינים.
- בחר "מרכיבי פילוח גרעיני", "Nuclאוזן גודל ", ו" לנקות "אם משתמש רוצה להגדיר הגדרות פילוח גרעינים נוספים.
- בחר את counterstain "פיקסל מבוסס (Threshold)" גישה עבור שיטה פשוטה לקבלה טובהתוצאות בלי לדעת הרבה על הגדרות עיבוד תמונה.
- בחר פרמטרי צורה הציטופלסמה
- בחר בלחצן "המתקדם" לעבור פילוח הציטופלסמה.
הערה: ישנן מספר אפשרויות בתוך פילוח הציטופלסמה לבחירה. אפשרות הכינה "מרחק פנימי לגרעין" היא פיקסל מבוסס. הוא משקף את המרחק בין החלק החיצוני של הגרעין הפנימי של הציטופלסמה. הגדלת ערך זה מקטין את ההסתברות כי האות גרעיני חוצה לתוך תא הציטופלסמה. - הבא בחר "מרחק חיצוני לגרעין".
הערה: זהו גם פיקסל מבוסס. המרחק החיצוני לגרעין משקף את המרחק בין החלק החיצוני של הגרעין לבין החלק החיצוני של התא. ערך זה יכול להיות מוגדר גדול או קטן מספיק כדי לכלול או לא לכלול אותות קרום אם תרצה בכך. - בא בחר "גודל מינימאלי".
הערה: הגודל המינימלי, pixel המבוסס, משקף את גודל מדגם הציטופלסמה המינימום להיכלל בניתוח. אם גודל הציטופלסמה קטן בתא מסוים כגון כאשר תאים צפופים יחד, פילוח הציטופלסמה זה נשלל מן הניתוח. - בחר את האפשרות הבאה, "רכיב" עם "ראשי", "משני", ובחר "שליישונים" כאפשרויות משניות.
הערה: כאן אפשר לבחור סמן הציטופלסמה ספציפי. בדומה לפילוח גרעיני, אם סמן ספציפי ציטופלסמית IHC נוצל בעבר, רכיב זה יכול לשמש כדי להגדיר את הציטופלסמה ידי מציאת ערך סף מינימום. זה מסייע בהגדרת הציטופלסמה אך אין זה הכרחי עבור דיוק מקובל. - מעבר ל האחרון שלוש האפשרויות הלשוניות הוא "ממברנה". כאן, המשתמש מגדיר את תא קרום בטוש חלבון. בחר "ראשוניים", "משני", ו / או "שליישונים" עבור כל סמן קרום ספציפי בשימוש. התאם "מלא סולם OD "כדי למצוא סף מינימאלי או חיובי עבור כל סמן על קרום תא.
- המשך תחת הלשונית "ממברנה" ובחר באפשרות "גודל תא מקסימום".
הערה: זהו המרחק לשווי קרום, בפיקסלים, אשר מציין את הגודל המרבי של התאים. ערך של 12 מתאים בדרך כלל עבור תמונות שצולמו בהגדלה 20X. - לאחר בחירת כל האפשרויות, בחר "תמונת פלח" או "כל מגזר". להחיל את ההגדרות לתמונות ולבחון אותם "בנפרד" או במצב "גלריה".
הערה: התאם את הגדרות ספים במידת צורך, מחדש קטע עד מרוצה מתוצאות פילוח תא אימון הקבוצה של תמונות.
- בחר בלחצן "המתקדם" לעבור פילוח הציטופלסמה.
5. phenotyping של תאים
הערה: חלוקת תאים מדויקת נדרשה על מנת לקבל phenotyping תא מדויק, ותכונת phenotyping היא שאפשר לאלף.
- השתמש "הוסף &# 34; כפתור להוסיף פנוטיפים לרשימת "פנוטיפים". משתמשים יכולים לבחור צבע עבור הפנוטיפ.
- לחץ על "פנוטיפים ערוכים" להקצות פנוטיפ לתא. לחץ על תא מסוים כדי להציג תפריט נפתח, המאפשרים למשתמש לבחור את הפנוטיפ ולאחר מכן להמשיך הלאה. לזהות לפחות חמש (5) תאי בכל פנוטיפ כדי להמשיך. בחירת 25 תאים או יותר של כל פנוטיפ הוא זקוק כדי להשיג תוצאות אופטימליות.
6. ניקוד IHC ושיתוף לוקליזציה
- בחר "מתקדם" כדי להעביר את "ציון IHC או אם" צעד. בחר "קטגורית רקמות" להבקיע.
הערה: רק בקטגוריה ברקמה אחת יכולה להיות בקיעה במהלך ניתוח מסוים, אבל אם תוצאות ניקוד בקטגורית רקמה אחרת הם רצויים, הניתוח ניתן לחזור מאוחר יותר עם הגדרות שונות. - בחר סוג "ניקוד" רצוי.
הערה: חיוביות יוצרת שני פחים (חיוביים ושליליים) עבור רכיב של ריבית, בעוד משמשות חיוביות כפולות לניתוח שיתוף לוקליזציה. אפשרויות אחרות כוללות 4-סל, 10-בן, ו -50 סלים ניתוחים סמן בחירה. - בחר את התא "תא" לשמש בקיע ניתוח.
- דומה למציאת סף מינימום של המערך הגרעיני הראשי, בחר "תצוגת רכיב נתונים" ו להזיז את הסמן מעל תמונות האימון למצוא ספי מינימום אופטי צפיפות מתאימה של מכתים עבור תאים חיוביים עבור הרכיב (ים) של עניין.
- אם תא צבעוני מאוד הם ייכללו, להנמיך את מקסימום הסף ברמה מתאימה. אחרת, להשתמש בלחצן האוטומטי לבחור מקסימום סף לניתוח.
- בחר להכשרת תמונות להבקיע כדי לאמת ערכי סף.
הערה: אחוז התאים בתוך סל מסוים יוחזר ניתן להשוות ידי בדיקה ויזואלית או ספירה ידנית. לכשיושלם, בחר "מתקדם" כדי להמשיך לשלב "ייצוא".
- בדוק את האלגוריתם נוצר באמצעות פילוח רקמות, פילוח תא, וערכי בקיע ידי יצוא הנתונים עבור להגדיר את האימון. עקוב אחר הוראות כדי ליצור תיקייה חדשה עבור ספריית היצוא. תמונות וטבלאות בחר להיווצר נכללו בניתוח. לבצע את הניתוח על ידי בחירת "ייצוא עבור כל".
- שולחנות מיוצאים קבצי טקסט מופרדים בטאבים וניתן לפתוח בתוכניות ניתוח ביותר נתונים.
- כאשר הניתוח הושלם, להציג פילוח תא ניקוד נתונים עבור תמונות עם מכתים גבוה ונמוך כאחד להעריך דיוק של הגדרות.
- כשתהיה מרוצה עם הגדרות, להחיל את האלגוריתם נוצר מתוך אימון הקבוצה של תמונות על הסט השלם של תמונות באמצעות ניתוח יצווה. לחץ על כרטיסיית "הניתוח יצווה" ואת אלגוריתם הפתח יועתק מהפרויקט הפעיל.
- בחר ספריית יצוא חדשה ובחר אשר תמונות tables הם להיכלל בניתוח. תחת אפשרות קבצי קלט, בחר באפשרות "הוסף תמונות" ולבחור את כל התמונות להיכלל בניתוח יצווה.
- לבצע את הניתוח על ידי בחירה באפשרות "הפעל". כמו במקרה של הניתוח להגדיר את האימון, שלב זה ידרוש כמות משתנה של זמן, בהתאם להגדרות בפרט ומספר התמונות נכללו באנליזה.
- כאשר יושלם, להתקדם "סקירה / מיזוג" הכרטיסייה. ברירת מחדל של הספרייה יצווה לספריית היצוא מהניתוח יצווה ניתן לשנות אם תרצה בכך. בחר "כלול כל" ובחר "מיזוג" כדי ליצור גיליונות נתונים עם נתוני סיכום לניתוח.
8. ניתוח של יצוא נתונים
- פתח שולחנות לייצא תוכנה לניתוח נתונים ולהסיר או להסתיר עמודות נתונים שאינם רלוונטיים לניתוח, כגון ערכי מינימום ומקסימום עבור כל רכיב. הנתונים העיקריים המשמשים בניתוח נמצאים ג הצפיפות האופטי הממוצעolumn לכל רכיב.
- סקירה לייצא מפות פילוח ותמונות גלם כדי לקבוע אילו דוגמאות או ליבות TMA הם ייכללו מניתוח. ערכי אחוז רקמות לסייע בקביעה האם מדגם צריך להיכלל או לא, עם הפסקה שרירותית של <5% משמשת לרוב עבור קריטריונים דרים.
- סר נתונים לא רלוונטיים או שורות המכילות דגימות להיכלל ניתוח נתונים.
- השתמש בנתוני כימות חלבון לחקור שינויים במצב מחלה או יחסים עם מאפייני Clinico-פתולוגיים של המחלה 12,18-21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באיור 1, אימון מתבצע על רקמות ערמונית לתמונות קטע לחלקי אפיתל סטרומה, יחד עם התא שאינם רקמות. באמצעות E-cadherin סמן קרום אפיתל, חלוקת תאים בוצעה על מנת להפריד את הגרעין, הציטופלסמה, וכן חלקים קרום, שמוצג באיור 2.
בניסוי אחד, השתמשנו מרובב IHC לחקור את ביטוי לוקליזציה של AR, ERα, E-cadherin, ו CD147, כפי שמוצג באיור 3. שימוש בשיטות אלה, אנו מסוגלים לזהות תאים חיוביים עבור ביטוי גרעיני של שני ERα ו AR (איור 3 ב - 3C) למרות חופפים אותות colorimetric, כפי שמוצג עם החצים הירוקים ב איור 3 א. מצאנו הבדלים בולטים גם חלקם של תאי סטרומה חיוביים כפולים בתוך מצבים שונים של יחסי ציבורהמחלה ostate (איור 3D). אנחנו לכמת ביטוי תא ספציפי הממברנה של CD147 באמצעות E-cadherin כחלבון סמן (חצים אדומים באיור 3 א), והיינו הקבוצה הראשונה לחקור ביטוי CD147 קרום ספציפיים ברקמות הערמונית. מצאנו ירידה משמעותית ביטוי CD147 בשיתוף עם התקדמות סרטן הערמונית (האיור 3E) ו מצאנו קשר חשוב עם פרוגנוזה לאחר ניתוח 19.
ישנם מקרים בם תכנון ניסוי ירוד יכול להוביל פילוח רקמות מדויק. באיור 4, האלגוריתם שחל על קבוצה של רקמות אפיתל לא קטע במדויק ותאי סטרומה (איור 4C). בניסוי זה, יקטין שריר חלקת α (α-SMA) שמש לציון תא סטרומה. בגלל α-SMA ו שריר חלק הוא ירד או אבדו בגידולים מסוימים (figuמחדש 4A), האלגוריתם נוצר באמצעות פילוח רקמות (האיור 4B) לא היה מסוגל להבחין במדויק בין תאי אפיתל סטרומה מנתונים morphometric לבד. יש להקפיד בעת בחירת סמנים חלבוניים לסלוני רקמה או תאים.
איור 1: פילוח רקמות באמצעות Multispectral הדמיה תוכנה. Microarray רקמות הערמונית הוכתם באמצעות אימונוהיסטוכימיה מרובב עבור קולטן האנדרוגן (AR), אלפא קולטן אסטרוגן (ERα), E-cadherin, ו CD147. סט של תמונות הכשרות יובא תוכנת הדמית multispectral המייצגים סוגי רקמות מצבי מחלה של המערכת השלמה של תמונות (א). קטגוריות רקמות נוצרו כולל stroma (ירוק), epithelia (אדום), ואת רקמות שאינן (כחול), וקטגוריות הוגדרו על ידי ציור ידני על גביתמונות של אימונים (B). לאחר ציור על תמונות אימונים, אלגוריתם פילוח רקמות נוצר מוחל על אימון הקבוצה של תמונות (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: חלוקת תאים לתוך גרעיני, cytoplasmic, ו ממברנות התאים. התא הגרעיני הוגדר פילוח תא על ידי קביעת סף מינימאלי עבור counterstaining hematoxylin (א). הציטופלסמה הוגדרה ביחס לגרעין באמצעות אלגוריתמים שנקבע מראש בתוך התוכנה (B). E-cadherin שימש כסמן קרום ומינימום מתכוון סף OD יושמה להגדיר בתא קרום (C). טכניקה זו כלOWS quantitation סימולטני של ביטוי חלבון בכל תאי subcellular (ד '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח של ביטוי Co-לוקליזציה ממברנה ספציפית חלבון. Multiplexed IHC שימש לחקור את הביטוי לוקליזציה של קולטן האנדרוגן (AR), אלפא קולטן אסטרוגן (ERα), E-cadherin, ו CD147 (א). DAB (אַב צֶבַע חום) שימש לציון AR (B) וכן אַב צֶבַע אדום המשמש לסימון ERα (C). הצלחנו לזהות סמנים ביולוגיים חופפים מרחבית (חיצים ירוקים א) ולכמת (ד) את חלקם של התאים עם לוקליזציה שיתוף הגרעין של ERα ו ARבתוך stroma הערמונית. באמצעות דואר cadherin (אַב צֶבַע שחור) להגדיר את קרום התא (חצים אדומים ב א), אנו לכמת ביטוי ספציפי-קרום של CD147 בתוך רקמות הערמונית (E) 19. חד סטרי הניתוח שונה (ANOVA) שמש לניתוח סטטיסטי, ברי שגיאה לשקף סטיית התקן של הממוצע, וכוכביות מייצגות p <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: פילוח רקמות לקו נובע עיצוב ניסיוני. רקמות ערמונית שפירים וממאירים היו מוכתמות עבור יקטין שריר α-חלקה (α-SMA; אַב צֶבַע ירוק), קולטן האנדרוגן (אַב צֶבַע האדום), ו -7 גרסת קולטן האנדרוגן (אַב צֶבַע DAB). אלפא-SMA שמשסמן של stroma והוא ירד בגידולים מסוימים, כולל הערמונית (א). כאשר הכשרה בוצעה (B) ואת אלגוריתם פילוח הרקמות היה מוחל, סטרומה ותאי אפיתל היו מפולחות כראוי בשל העדר של α-SMA מכתים (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש אימונוהיסטוכימיה מסורתיים להערכת ביטוי החלבון הוא מוגבל על ידי שיטות סובייקטיביות, וכמותיות של ניתוח 22,23. פלטפורמות Advance נוצרו לניתוח תפוקה גבוהה הביטוי ולוקליזציה סמן ביולוגי. פילוח מפורט של שתי רקמות ותאים subcellular מאפשר למשתמשים ללמוד ביטוי סמן ביולוגי, לוקליזציה, ואת שיתוף לוקליזציה עם סמנים אחרים בעלי עניין. במחקרים קודמים, יש לנו הדגימו את התועלת של IHC והדמיה multispectral, במיוחד כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד חלבונים מקומי לאותו 18,20,21 תא הסלולר. בשילוב עם microarrays רקמות 24, טכניקות אלו מאפשרות אלקטרוניים כדי לכמת מהר יותר אובייקטיביים של ביטוי חלבון העולה על מותר על ידי ניתוח ידני על ידי פתולוג.
נושא אחד עם השימוש אימונוהיסטוכימיה כדי לכמת את החלבון irreproducibility של תוצאות בשל subjecהטבע של ניתוח מופרז ו לאופי שונה טכניקה ריאגנטים. יתרון משמעותי של שימוש בפלטפורמות כמו הדמיה multispectral למדידת ביטוי החלבון הוא שחזור של התוצאות. נתונים מפלטפורמות פתולוגיה ממוחשב לתאם מאוד עם ניתוח ידני על ידי פתולוג תוך חזרת נתונים בפורמט רציף צמצום ניכר את זמן עבודה, במיוחד כאשר עובד עם מדגם גדול בגדלי 12,16,25. מחקרים הראו הקונקורדנציה הכולל גבוה בתוצאות בין פלטפורמות multispectral השונות 14. יתר על כן, אנו הוכחנו בעבר כי תוצאות מכתימות הם מאוד לשחזור גם כאשר ישנות שונה במספר החלבונים נחקר 12. שימוש פלטפורמות פתולוגיה אוטומטיות הן מכתים וניתוח לא לחסל את כל הפערים בתוצאות, כגון אלה הנובעים נוגדנים שנוצרו כלפי אפיטופים שונים, אבל הפלטפורמות האלה להפחית באופן משמעותי הטיה ו irשחזור נפוץ הקשורים אימונוהיסטוכימיה.
ישנם צעדים מסוימים בתוך הפרוטוקול כי הם חיוניים עבור החזרת תוצאות מדויקות, לשחזור. תכנון הניסוי המתאים דרך הבחירה של חלבונים להיכלל כמו רקמה או סמנים subcellular חשוב פילוח מדויק. בעת ביצוע ניתוח חיובי, הבחירה של רף נמוך יותר עבור מכתים חיובי יש השפעה גדולה על התוצאות הסופיות. בעת בחירת סף "on / off" חלבונים כגון גורמי שעתוק גרעיניים הוא פשוט למדי, מציאת סף החלבונים הביעו הטרוגני יותר קשה. זה צריך להתבצע באופן אידיאלי בשיתוף עם פתולוג מין ושתן-מועצת רואי או כקובץ ציון מחושב כממוצע משקיפים מרובים כדי למצוא את הסף האידיאלי לניתוח.
חשוב להכיר כמה מגבלות של הגירסאות הנוכחיות של טכנולוגיה זו. כאשר דהקנס בתא הציטופלסמה, שלוש גישות ניתן להשתמש: (1) מכתים בטוש הציטופלסמה ספציפי, (2) צביעה עם סמן קרום ספציפי באמצעות הגרעין אל קרום מרחק סמנו כפי הציטופלסמה, ו (3) באמצעות גישת ציור כדי להגדיר את הגבולות בציטופלסמה ביחס לגרעין ידני. מניסיוננו, באמצעות סמן קרום ספציפי היא הטכניקה המדויקת ביותר. גישת הציור הידנית מדויקת בדרך כלל אם גרעינים נמצאים במיקום מרכזי או אם הסמן הביולוגי של עניין הוא מפוזר באופן אחיד בכל הציטופלסמה. במדויק בהגדרת הציטופלסמה של תאי סטרומה כמו פיברובלסטים ותאי שריר חלק עדיין קשה וצריכה להילקח בחשבון בעת תכנון ניסוי.
מגבלה נוספת של הטכנולוגיה היא תלות גרעינים עבור חלוקת תאים. אם מטוס סעיף כולל את הגרעין של תא מסוים, התא הזה לא ייכלל בניתוח. אם איןהציטופלסמה גלוי בין גרעינים או גושים סמוכים של גרעינים, אלו נזקפים לעתים קרובות ככל גוש גרעיני אחד גדול, ולא גרעינים ברורים. באופן כללי, hematoxylin counterstain היא נאותה בדרך כלל פילוח גרעיני מקובל, ומניפולציה של גדרות תוכנה כגון סף מרבי עבור גודל גרעין יכול לתקן את רוב הבעיות עם פילוח גרעיני.
מגבלה סופית של פלטפורמות פתולוגיה אוטומטיות היא פילוח אמין של רקמות הנובע עיצוב ניסיוני עניים. החשיבות של בחירת סמנים ביולוגי רקמות בתא מתאימים לענות על השאלה של עניין לא יכולה להיות מוגזמת. כפי שהראינו בתוצאות הנציג שלנו, סמן אפיתל או סטרומה שמשנה ביטוי משמעותי בין מדינות מחלה יכולה להוות בעיה בעת יצירת אלגוריתם פילוח רקמות. ראוי לציין כי יש אפשרויות חלופיות כאשר קשה מנתח כזה להתעורר. לדוגמא, מתאר לעצמי פרטניתן לנתח es ידי התאים שמושכים אליהן הרקמות באופן ידני, ולא על ידי הפעלת אלגוריתם מתוך סדרה של תמונות אימונים. זה מספק את היתרון של פילוח כי הוא מושלם בקנה אחד עם מה המשתמש רוצה, אבל זה גם הציג הסובייקטיביות והוא יכול להגדיל באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי לסיים ניתוח. תכנון ניסוי מתאים הוא הדרך הקלה ביותר כדי לזרז ניתוח למקסם את הדיוק של רקמות ופילוח תא.
יש טכנולוגיה פרוטוקול זה יישומים עתידיים רבים. סמנים ביולוגיים רבים עבור מדינות מחלה מסוימות זוהו אבל לא תוקפים. תפוקה גבוהה ניתוח אובייקטיבי עם פלטפורמות multispectral מקל אימות של סמנים אלה. יתר על כן, ערכת ביטוי שיתוף הלוקליזציה של חלבונים רבים יכולה לספק תובנות מסלולי איתות גרועה הבינו. אין ספק, צמצום הסובייקטיביות מובנים הקשורים ניתוח staini immunohistochemicalng הוא חשוב להבנת הביטוי ולוקליזציה של מגוון רחב של סמנים חלבוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים אוניברסיטת יוזמות Translational מחקר ויסקונסין במעבדה לפתולוגיה, שנשען בחלקו על ידי UW המחלקה לפתולוגיה המעבדה לרפואה CA014520 P30 UWCCC מענק עבור שימוש במתקנים ושירותיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
- Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
- McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
- Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
- Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
- Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
- Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
- Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
- Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
- Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102 (2014).
- Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
- Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549 (2015).
- Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
- Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).
