Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantifiering av proteinuttryck och samlokalisering Använda Multiplex Immuno-histokemisk färgning och multispektrala

doi: 10.3791/53837 Published: April 8, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Immunohistokemi (IHC) är en standard lab teknik för detektering av protein i vävnad, och IHC fortfarande används i stor utsträckning både forskning och diagnostiska patologi. Utvärderingen av IHC färgning är ofta halvkvantitativ, införa eventuell bias i tolkningen av resultaten. Många halv kvantitativa metoder har utvecklats som innefattar både färgningsintensitet och färgning utsträckning i slutlig diagnos 1-4. Andra system inkluderar poäng intensitet och subcellulär plats för att bättre lokalisera uttryck 5. Inkorporering av den genomsnittliga poängen från flera tittare används ofta för att minimera effekterna av enstaka betraktaren partiskhet 6. Trots dessa ansträngningar, fortfarande subjektivitet i analysen, särskilt vid bedömningen av omfattningen av färgning 7. Protokoll standardisering och minimera subjektivitet från mänsklig ingången är av största vikt att skapa exakta, reproducerbara IHC resultat.

innehåll "> Det finns andra alternativ förutom IHC för att bestämma proteinuttryck i vävnader. Inom forskningsmiljön har immunohistokemi traditionellt setts som ett sätt att undersöka protein lokalisering 8, medan andra tekniker såsom immunoblotting betraktas som gold standard för att undersöka proteinuttryck . Fastställande vävnad eller cellfack specifikt uttryck är svårt utan att införliva avancerade tekniker såsom cellfraktionering eller laser capture microdissection 9,10. användningen av fluorescerande antikroppar på vävnadsglas ger en rimlig kompromiss, men bakgrunden autofluorescens på grund av NADPH, lipofuscins, retikulär fibrer, kollagen och elastin kan göra exakt kvantifiering svårt 11.

Automatiserade beräknings patologi plattformar är en lovande riktning för mer objektiv kvantifiering av patologi färgning 12-15. Kombinera multispektrala avbildning med vävnads microarraysunderlättar hög genomströmning analys av proteinuttryck i stora provstorlekar. Med dessa tekniker är möjlig analys av protein samlokalisering, färgning heterogenitet, och vävnad och subcellulär lokalisering medan avsevärt minska både inneboende fördomar och tid som behövs för analys, medan återvänder data i en kontinuerlig snarare än kategoriska format 16. Därför är syftet med denna studie var att visa nyttan av och metod för att utföra multiplex immunohistokemi med analys, med hjälp av multispektral bildbehandlingsprogram.

Detta protokoll är skriven för manuell, multiplex immunhistokemisk färgning av en enda vävnadssnitt glida med fyra optimerade monoklonala antikroppar. Som ett representativt experiment, är kärnantikanin östrogenreceptor-alfa (ERa) och androgenreceptorn (AR) multiplexeras med membranbundna anti-mus-CD147 och membranbundna anti-mus-E-cadherin. Alla antikropp val kan utbytbarheted för antikropparna som anges häri, men varje kombination av antikroppar kräver separat optimering. Pre-behandling för alla antikropparna måste vara identiska. AR och CD147-antikroppar bör optimeras individuellt och sedan som en cocktail. Varje antikropp detekteras med hjälp av en biotin-fri polymersystemet och en av 4 unika kromogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: protokollet beskriver häri färgning och analys av ett vävnadsmicroarray (TMA), beskrivits tidigare 12,17,18. Den 4 pm tjock TMA sektion erhölls från en paraffin-block med användning av en standard-mikrotom.

OBS: En spektral bibliotek för 4 kromogener och kontrast bör skapas för bild kvantifiering. För att göra detta, bör optimerat protokoll för varje enskild antikropp köras med en antikropp per bild, minus den slutliga kontrast. En femte slide bör färgades med hematoxylin för att generera de 5 bilder behövs för att skapa den spektrala bibliotek.

1. Multiplex Immunohistokemi

  1. Baka glider i en 60 ° C ugn under 20 min. Med hjälp av en kemisk dragskåp, sänk bild i 100% xylen. Upprepa för 2 byten av xylen. Fördjupa bild i 100% etanol under 5 min. Upprepa med färska 100% etanol.
  2. Fördjupa bild i 95% etanol under 3 min. Upprepa med färsk95% etanol. Fördjupa bild i 70% etanol under 3 min. Doppa objektglaset i destillerat vatten under 3 min. Upprepa med färskt destillerat vatten. Knacka glida vertikalt för att dränera vatten från bilden. Applicera 200 l av redo att använda endogent peroxidas blockerare för 5 min.
  3. Dränera peroxidas blockerare från sliden och sänk ned i 45 ml redo att använda hämtningsbuffert (pH mindre än 7,0). Placera objektglaset behållare i en tryckkokare och starta program inställd på 124 ° C under 4 min. Låt tryckkokaren svalna i 20 minuter. innan öppnandet.
  4. Ta bort behållare med hämtning buffert och låt svalna ytterligare 10 minuter. Skölj objektglaset i destillerat vatten under 10 min. Dränera vatten från bilden och noggrant beskriva vävnaden på bilden med en hydrofob barriär penna.
  5. Tillsätt 200 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) .Transfer bild till en platt kärl med lock (inkubation kammare) innehållande fuktig gasväv.
  6. Förbereda en liter 1x Tris-buffrad saltlösning med Tween-20 (TBST) genom att späda 50 ml 20x Tris-buffrad koksaltlösning innehållande 1% Tween-20 och 950 ml destillerat vatten.
  7. Tappa PBS från bild och tillämpa 200 pl 1x TBST. Inkubera 2 min. Tappa TBST från bilden och återgå glida inkubation kammare. Applicera 200 l av färdiga att använda universell protein blocket, nära kammaren och inkubera i 7 minuter.
  8. Töm protein block och retur glida inkubation kammare. Späd anti-ERa antikropp 1: 400 genom att tillsätta 0,6 pl antikropp till 239,4 il antikroppsspädningsmedel. Applicera 200 l utspädd antikropp att glida och nära kammaren.
  9. Inkubera objektglaset vid rumstemperatur under 2 timmar. Tappa antikropp från bild och skölj med TBST, följt av nedsänkning under 5 minuter i TBST.
  10. Tappa TBST från bilden och återgå glida inkubation kammare. Applicera 200 l av färdiga att använda get anti-kanin pepparrotsperoxidas polymer och nära kammaren. Inkubera under 30 min. vid rumstemperatur. Skölj glida med TBST och plats glida i behållare av TBST under 5 min. </ Li>
  11. Förbered brun pepparrotsperoxidas-3,3'-diaminobensidin (HRP-DAB) kromogen genom att tillsätta 8 pl DAB kromogen till 250 pl DAB substratbuffert och blanda väl.
  12. Tappa TBST från slide, retur bild till inkubation kammare och applicera 200 il brun HRP-DAB kromogen för 6 min. Skölj objektglaset med destillerat vatten och placera objektglaset i en behållare med destillerat vatten.
  13. Blanda denatureringslösning genom att kombinera 50 | il av den första elueringsreagens med 150 | il av den andra buffertreagens. Tappa vatten utanför bilden och tillämpa utspädd denature lösning på bild för 3 minuter. vid rumstemperatur. Dekantera och skölj denaturerande reagenset med TBST. Doppa objektglaset i TBST under 5 min.
  14. Förbered AR / CD147 antikropp cocktail genom att späda 4,2 pl anti-AR-antikropp och 2,8 pl anti-CD147-antikropp med 203 pl antikroppsspädningsmedel. Töm TBST från bilden tillbaka bild till inkubation kammare och applicera 200 il AR / CD147 cocktail till bilden. Stäng kammaren och inkubera under en timme vid rumstemperatur. Skölj glida med TBST och doppa i TBST under 5 min.
  15. Dränera TBST, retur slide till inkubationskammaren och applicera 200 pl redo att använda get-anti-kanin-alkaliskt fosfatas-polymer. Stäng kammaren och inkubera bild för 30 minuter. vid rumstemperatur. Skölj glida med TBST och doppa i TBST under 5 min.
  16. Förbered röd alkalinfosfatas kromogen genom att tillsätta 3,2 pl röd kromogen till 250 l röd kromogen buffert och blanda väl.
  17. Tappa TBST från bilden och återgå glida inkubation kammare. Applicera 200 pl av utspätt rött alkaliskt fosfatas kromogen till rutschbana, nära kammaren och inkubera i 7 min.
  18. Töm kromogen och skölj glida med destillerat vatten. Placera bilden i en behållare med destillerat vatten i 5 minuter. Dränera vatten från bilden, skölj med TBST och återgå till inkubation kammare. Applicera 200 | il get-anti-mus-HRP polymer till sliden och close kammaren. Inkubera under 30 min. vid rumstemperatur.
  19. Töm polymer från bilden och skölj med TBST. Placera objektglaset i TBST under 5 min. Förbereda 200 pl lila HRP-länkad kromogen genom tillsats av 3,2 | il av den stabiliserande reagens till 250 ul av buffert och blanda väl. Lägg 3,2 pl lila kromogen och blanda väl, då 3,2 pl av väteperoxidreagens och blanda väl.
  20. Tappa TBST av bild och tillämpa 200 pl beredd lila kromogen för att skjuta och Inkubera under 7 min. vid rumstemperatur. Skölj objektglaset med destillerat vatten och placera objektglaset i en behållare med destillerat vatten under 5 min.
  21. Blanda denatureringslösning genom att blanda 50 | il av den första elueringsreagens med 150 | il av den andra buffertreagens. Tappa vatten utanför bilden och tillämpa utspädd denature lösning på bild för 3 minuter. vid rumstemperatur.
  22. Skölj denatureringsreagens bort med TBST. Placera bilden i behållare av TBST under 5 min. Späd anti-E-cadherin-antikropptill 1: 200 genom att tillsätta 1,1 l antikropp till 218,9 pl antikroppsspädningsmedel. Töm TBST från bilden, retur bild till inkubation kammare och applicera 200 il E-cadherin till bilden. Stäng kammaren och inkubera 30 min. vid rumstemperatur.
  23. Skölj glida med TBST och plats glida i behållare av TBST under 5 min. Töm TBST från sliden tillbaka bild till inkubation kammare och tillämpa 200 pl get anti-mus HRP polymer. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min. Skölj glida med TBST och plats glida i behållare av TBST under 5 min.
  24. Förbered svart HRP-kopplad kromogen genom att tillsätta 8 il kromogen till 250 pl buffert. Applicera 200 l kromogen att glida och utvecklas under två minuter. Skölj objektglaset med destillerat vatten och sänk i behållare av destillerat vatten.
  25. Späd hematoxylin genom att tillsätta 40 pl hematoxylin till 200 ul destillerat vatten. Dränera vatten från bild och tillämpa 200 pl utspätt hematoxylin att glida i 30 sekunder. skölj objektglasetgrundligt rinnande kranvatten under 2 min. och skölj sedan i destillerat vatten i 30 sekunder. Placera objektglaset i en ugn vid 60 ° C under 15-30 min.
  26. Sänk bilden i nygjord 100% xylen under 30 sekunder, torka överskott xylen bort och tillsätt en droppe av permanenta monterings media. Täckglas med en nr 1,5 täckglas.

2. automatiserad insamling och analys

  1. Ladda färgade diabilder på en automatiserad diascanner. Baserat på diametern, separation och antal TMA-kärnor, skapa en automatiserad skanning protokoll enligt tillverkarens bruksanvisning.
  2. Öppen multispektrala bildbehandlingsprogram för att bygga en spektral bibliotek från kontrollobjektglas som färgats med enskilda kromogener och hematoxylin färgade bilden. Öppna en bild kub förvärvats från en kontrollobjektglas och välj fyra till fem positivt färgade områden för att optiskt fastställa att kromogen. Upprepa med bild kuber från andra kontrollobjektglas tills en fullständig spektral bibliotek representing alla kromogener skapas, och sedan spara den spektrala bibliotek.
  3. Börja ett nytt projekt inom multispektral bildprogram. Välj "Multispektrala (.im3)" för alternativet bildformat och "Bright" för samplingsformat. Först konfigurerar projektet genom att välja önskade alternativ: "Segment Tissue", "Hitta funktioner", "fenotypning", "Score" och "Export". Vid denna punkt, kan bildupplösningen ändras för att påskynda analystiden om så önskas.

3. Tissue Segmente

  1. Importera tidigare skapade spektrala bibliotek och markera alla kromogener som skall ingå i analysen.
  2. Öppna bild kuber som ska ingå i de träningsdata som genom att välja "Öppna bild Cube" alternativet. För att säkerställa utbildning noggrannhet, välj minst 18% av det totala antalet bilder som ska analyseras. Välj bilder som representerar alla sjukdomstillstånd för att öka segmente noggrannhet. Denna del av bilderna is kallas övningsuppsättningen av bilder.
  3. Vitbalans bilder i övningsuppsättningen genom att välja pipett verktyget och välja ett område i en bild som är vit.
  4. Välj "Advance" för att gå till vävnadssegmentering. Använd "Vävnads kategorier" panel för att välja vävnadstyper som skall analyseras (dvs "vävnad" och "icke-vävnad"). För mer exakt protein vävnadslokalisering, kan flera kategorier vävnads användas (dvs.. "Epitel", "stroma", och "icke-vävnad").
  5. Börja skapa algoritmen och definiera vävnadskategorier genom att dra runt grupper av celler inom utbildningsbilder. När du är klar med ett mjukpapperskategorin, upprepa för andra kategorier vävnads. Se till att välja grupper av celler inom bilder som är karakteristiska för den vävnaden kategori typ.
  6. Upprepa denna process för alla bilder i övningsuppsättningen av bilder.
  7. Välj komponenter (kromogener) som skall ingå i training för "Tissue segmente". När du utför analys av bright immunohistokemi bilder, alla komponenter som normalt ingår i utbildningen. Inkludera riklig negativa färgnings bilder i övningsuppsättningen för att undvika partiskhet under detta steg.
  8. Välj en lämplig "Mönster Skala" för utbildning vävnadssegmente. Under 20X förstoring, är typiskt lämpligt ett stort mönster skala. När man arbetar med vävnader med en fin arkitektur under högre förstoring, är lämpligare mindre mönster skala.
  9. Välj "Train Tissue segmente" knappen för att börja träna vävnadssegmente. Iaktta en popup-ruta som visar noggrannhet återspeglar andelen pixlar inom utbildningsområden som är korrekt klassificeras.
    OBS: Programmet försöker ständigt att förbättra noggrannheten av algoritmen tills stoppas manuellt. Vi har tidigare visat att utbildning om 18% av bilder resulterar i 97% tränings noggrannhet 12. Efter vävnadssegmente tränas, välja en lämplig upplösning segment. Segment upplösning motsvarar tiden som krävs för att bilderna segment, med grov upplösning kräver mindre tid och fin upplösning kräver mer tid.
  10. Segment hela övningsuppsättningen av bilder genom att klicka på "-segmentet bilder". Låt programmet tillräcklig tid att tillämpa algoritmen för alla träningsbilder. När du är klar, granska utbildningen inställd på att hitta någon felklassificerad vävnad med den aktuella utbildningen algoritmen.
  11. Att finjustera vävnadssegmenteringsprocessen, lägga till, redigera eller ta bort vävnad utbildningsområden. Använd "trim kanter" om pixlar sträcker sig på kanterna av en mjukpapperskategorin till en annan. Om små grupper av pixlar felklassificeras, justera tröskeln om minimisegmentstorlek.
  12. När ändringar är klara, välj "Segment bilder", kommer detta att omskola vävnadssegmente att skapa en ny algoritm för vävnadssegmentering. Den tidigare algoritmensparas automatiskt och kan återföras till om det behövs.
  13. När trygg med vävnadssegmenteringsalgoritm resultat, avancera till cellsegmente genom att välja "Advance" -knappen.

4. Cell Segmente

  1. Välj den subcellulära fack som ska ingå i cellsegmentering. Se till att "Kärnor" redan är vald för att välja "Cytoplasma" eller "membran".
    OBS: "Membrane" segmente bör endast väljas när en membranspecifikt protein markör ingick i IHC, såsom E-cadherin.
  2. Inom "Kärnor" -fliken, finns det flera alternativ. Börja med att välja lämpliga inställningar för kärnsegmente (se steg 4,3). Välj om enskilda eller alla vävnadskategorier kommer att ingå i segmentering.
  3. Välj en metod för kärnsegmente
    1. Välj motfärg "pixelbaserad (Threshold)" strategi för en förenklad metod för att erhålla godresultat utan att veta mycket om inställningar bildbehandling.
      OBS: Detta gör ofta ett bra första val. När du väljer en strategi, "pixelbaserad (Threshold)" är lämpligare när det finns en pålitlig nukleär motfärgning, medan "objektbaserad" ska användas om det finns en brist på konsekvent nukleär motfärg.
    2. Välj "pixelbaserad (Threshold)" -metoden när det finns en pålitlig nukleär motfärg.
      OBS: Detta tillvägagångssätt är helt pixelbaserad. Detta tillvägagångssätt kan också användas för andra behov bildanalys som kan vara nöjda med en enkel tröskel, såsom detektering av alla pixlar i en vävnad kategori som färgas positivt för en IHC fläck.
    3. Välj objektbaserade tillvägagångssättet om nukleär motfärg inte ger konsekvent och specifik färgning av kärnobjekt och mer avancerade morfometri baserade strategier behövs för att upptäcka kärnor.
    4. Välj "Komponenter för Nuclear segmentering", "Nuclöra Size "och" Clean-up "om användaren vill att ytterligare definiera kärnor segmente inställningar.
  4. Välj cytoplasma formparametrar
    1. Välj "Advance" för att gå till cytoplasman segmentering.
      OBS: Det finns flera alternativ inom cytoplasman segmente att välja mellan. Alternativet kallas "inre avstånd till kärnan" är pixelbaserade. Den reflekterar avståndet mellan utsidan av kärnan och insidan av cytoplasman. Öka detta värde minskar sannolikheten att kärn signal korsar över in i cytoplasman utrymmet.
    2. Därefter väljer "yttre avstånd till kärnan".
      OBS: Detta är också pixelbaserad. Det yttre avståndet till nucleus avspeglar avståndet mellan utsidan av kärnan och utsidan av cellen. Detta värde kan ställas in stora eller tillräckligt liten för att inkludera eller exkludera membran signaler om så önskas.
    3. Nästa välj "minimistorlek".
      OBS: Den minsta storlek, PIXEl baserad speglar den minsta cytoplasman provstorleken som ska ingå i analysen. Om cytoplasman storleken är mindre i en viss cell, såsom när cellerna är tätt sammanpackade, är detta cytoplasman segmente undantas från analys.
    4. Välj nästa alternativ, "Component" med "Primär", "Sekundär" och välj "tertiär" som sekundära alternativ.
      OBS: Här kan man välja en specifik cytoplasma markör. I likhet med kärnsegmentering, om en specifik cytoplasmisk IHC markör har använts, denna komponent kan användas för att definiera cytoplasman genom att hitta en minsta tröskelvärde. Detta hjälper till att definiera cytoplasman men är inte nödvändigt för acceptabel noggrannhet.
    5. Flytta till den sista av de tre flikar alternativen är "membran". Här, definierar användaren membranavdelningen med en proteinmarkör. Välj "Primär", "Sekundär" och / eller "tertiär" för varje membran specifik markör som används. Justera "Full Scale OD "för att hitta en minimitröskel eller en positiv för varje markör på cellmembran.
    6. Fortsätter under "Membrane" -fliken och välj alternativet "maximal cellstorlek".
      OBS: Detta är avståndet till membran värde, i pixlar, som anger den maximala storleken på cellerna. Ett värde på 12 är normalt lämpligt för bilder tagna vid 20X förstoring.
    7. När du har valt alla alternativ, välj "Segment bild" eller "Segment All". Tillämpa inställningarna på bilderna och observera dem "individuellt" eller i "Galleri" -läge.
      OBS: Justera inställningar och trösklar vid behov och åter etapper tills nöjd med cellsegmenteresulterar i träningsmängden bilder.

5. fenotypning av celler

OBS: Exakt cell segmente krävs för att få exakt cell fenotypning och fenotypning funktionen är följsam.

  1. Använd "Lägg till &# 34; knappen för att lägga fenotyper till "Fenotyper" -listan. Användare kan välja en färg för fenotypen.
  2. Klicka på "Redigera fenotyper" att tilldela en fenotyp till en cell. Klicka på en särskild cell för att få upp en rullgardinsmeny, så att användaren kan välja fenotypen och sedan gå vidare. Identifiera åtminstone fem (5) celler i varje fenotyp för att fortsätta. Det behövs att välja 25 eller fler celler av varje fenotyp för att uppnå optimala resultat.

6. Scoring IHC och samlokalisering

  1. Välj "Advance" för att gå till "Score IHC eller OM" steg. Välj en "Tissue kategori" att göra mål.
    OBS: Endast en vävnad kategori kan görs under en viss analys, men om poängresulterar i en annan kategori vävnad önskas kan analysen upprepas senare med olika inställningar.
  2. Välj en önskad "Scoring" typ.
    OBS: Positivitet skapar två fack (positiva och negativa) för en komponent av intresse, Medan dubbel positivitet används för samlokalisering analys. Andra alternativ är 4-bin, 10-bin, och 50-bin-analyser för en markör för val.
  3. Välja den cell "Fack" som skall användas i scoring analys.
  4. I likhet med att hitta en minimigräns för den primära kärnkomponenten, välj "Visa Component Data" och flytta markören över träningsbilder för att hitta lämpliga optiska densitet miniminivåerna för färgning för positiva celler för komponent (er) av intresse.
  5. Om intensivt färgade celler ska uteslutas, sänka tröskeln max till en lämplig nivå. Annars använder auto-knappen för att välja ett tröskelvärde för analys.
  6. Välj utbildning bilder att göra mål för att validera tröskelvärdena.
    OBS: Procentandelen celler inom ett visst fack returneras och kan jämföras genom visuell inspektion eller manuell räkning. När du är klar, välj "Advance" för att fortsätta till "Export" steg.
<p class = "jove_title"> 7. Tillämpning av algoritm och Batch Analysis

  1. Testa algoritm skapad genom vävnad segmentering, cellsegmentering, och poängvärden genom att exportera data för övningsuppsättningen. Följ anvisningarna för att skapa en ny mapp för export katalog. Välj bilder och tabeller skapas och inkluderas i analysen. Utför analysen genom att välja "Export för alla".
  2. Tabeller exporteras i tabbavgränsade textfiler och kan öppnas i de flesta dataanalys program.
  3. När analysen är klar, se cell segmentering och poängdata för bilder med både hög och låg färgning att utvärdera noggrannhet inställningar.
  4. När du är nöjd med inställningarna, tillämpa algoritm skapad från träningsmängden av bilder till hela uppsättningen av bilder via parti analys. Klicka på "Batch Analysis" fliken och den öppnade algoritmen kommer att kopieras från det aktiva projektet.
  5. Välj en ny export katalog och välj vilka bilder och tables ska ingå i analysen. Under alternativet indatafiler, välj "Lägg till bilder" och välj alla bilder som ska ingå i parti analys.
  6. Utför analysen genom att välja "Kör" alternativet. Som med analys av träningsmängden, kommer detta steg kräver en varierande mängd tid, beroende på särskilda inställningar och antal bilder som ingår i analysen.
  7. När det är klart, avancera till "Review / Merge" -fliken. Satskatalog standard exportkatalog från satsanalys och kan ändras om så önskas. Välj "Inkludera alla" och välj "Slå ihop" för att skapa datablad med sammanfattande data för analys.

8. Analys av exporterade data

  1. Öppna exporterade tabeller i dataanalys programvara och ta bort eller dölja datakolumner som är irrelevanta för analys, såsom lägsta och högsta värden för varje komponent. Den primära data som används i analysen är i medel optisk densitet column för varje komponent.
  2. Granska exporterade segmente kartor och råbilder för att avgöra vilka prover eller TMA kärnor ska undantas från analys. Vävnadsprocentvärden bistå med att fastställa huruvida ett prov ska tas med eller inte, med en godtycklig cutoff av <5% används oftast för uteslutningskriterier.
  3. Ta bort irrelevanta uppgifter eller rader som innehåller prover som ska undantas från analys av data.
  4. Använd protein kvantifiering data för att undersöka förändringar i sjukdomstillstånd eller relationen med klinisk-patologiska egenskaperna hos sjukdomen 12,18-21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I figur 1, är utbildning som genomförts på prostatavävnad till bilder segment i epiteliala och stromala delar, tillsammans med den icke-vävnadsrummet. Genom att använda epitelmembranet markör E-cadherin, var cellsegmente utföras för att separera nucleus, cytoplasman och membrandelar, som visas i figur 2.

I ett experiment använde vi multiplexerade IHC att undersöka uttrycket och lokalisering av AR, ERa, E-cadherin, och CD147, såsom visas i figur 3. Med användning av dessa tekniker, har vi möjlighet att identifiera celler som är positiva för nukleär expression av både ERa och AR (Figur 3B - 3C) trots överlappande kolorimetriska signaler, såsom visas med gröna pilar i figur 3A. Vi hittade markanta skillnader i andelen dubbla positiva stromaceller inom olika tillstånd av prostate sjukdom (figur 3D). Vi kvantifierade cellmembranspecifikt uttryck av CD147 med E-cadherin som ett markörprotein (röda pilar i figur 3A), och vi var den första gruppen att undersöka membran specifik CD147 uttryck i prostatavävnad. Vi fann en signifikant minskning av CD147-uttryck i association med prostatacancer progression (figur 3E) och fann en viktig förening med postkirurgisk prognosis 19.

Det finns fall där dålig experiment design kan leda till felaktig vävnadssegmentering. I figur 4, den algoritm som tillämpas på en uppsättning av vävnader inte exakt segment epitel- och stromala fack (Figur 4C). I detta experiment var α-glattmuskelaktin (α-SMA) som används för att markera det stromala utrymmet. Eftersom α-SMA och glatt muskulatur minskas eller förloras i vissa tumörer (Figure 4A), algoritmen skapas genom vävnadssegmente (Figur 4B) var inte exakt skilja mellan epiteliala och stromala fack från morfometriska uppgifter enbart. Försiktighet bör iakttas när man väljer proteinmarkörer för vävnads- eller cellavdelningar.

Figur 1
Figur 1: Tissue Segmente Använda multispektrala Software. En prostatavävnad microarray färgades med användning av multiplex immunohistokemi för androgenreceptorn (AR), östrogenreceptor-alfa (ERa), E-cadherin, och CD147. En uppsättning av utbildnings bilder importerades till multispektrala bildbehandlingsprogram representerar vävnadstyper och sjukdomstillstånd i hela uppsättningen av bilder (A). Vävnads kategorier skapades inklusive stroma (grön), epitel (röd), och icke-vävnad (blå), och kategorier definierades genom att manuellt dra på toppenutbildning bilder (B). Efter att dra på träningsbilder, var en algoritm för vävnadssegmente skapas och tillämpas på övningsuppsättningen av bilder (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Cell Segmente in Nuclear, cytoplasmatisk och membran fack. Kärnkrafts fack definierades för cellsegmente genom att sätta en minimigräns för hematoxylin motfärgning (A). Cytoplasman definierades i förhållande till kärnan med hjälp av förinställda algoritmer i mjukvaran (B). E-cadherin användes som en membranmarkör och en minsta genomsnittliga OD-tröskel applicerades för att definiera membranavdelningen (C). Denna teknik allaöden samtidig kvantifiering av proteinuttryck i alla subcellulära fack (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Analys av samlokalisering och membranspecifikt protein Expression. Multiplexerade IHC användes för att undersöka uttrycket och lokalisering av androgenreceptorn (AR), östrogenreceptor-alfa (ERa), E-cadherin, och CD147 (A). DAB (brun kromogen) användes för att markera AR (B) och en röd kromogen som användes för att markera ERa (C). Vi kunde identifiera rumsligt överlappande biomarkörer (gröna pilar i A) och kvantifiera (D) andelen celler med nukleär samlokalisering av ERa och ARinom prostata stroma. Genom att använda e-cadherin (svart kromogen) att definiera plasmamembranet (röda pilar i A), kvantifieras vi membranspecifikt uttryck av CD147 inom prostatavävnad (E) 19. Envägs variansanalys (ANOVA) användes för statistisk analys, felstaplar speglar standardfel av medelvärdet, och asterisker representerar p <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Otillräcklig Tissue Segmente Till följd av experimentell design. Benigna och maligna prostatavävnad färgades för α-glatt muskulatur aktin (α-SMA, grön kromogen), androgenreceptorn (röd kromogen) och androgenreceptor variant 7 (DAB kromogen). a-SMA användes somen markör av stroma och minskas i vissa tumörer, inklusive prostata (A). När utbildning genomfördes (B) och vävnadssegmenteringsalgoritm applicerades den stromala och epiteliala fack var otillräckligt segmenterade på grund av avsaknaden av α-SMA färgning (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Användning av traditionella immunohistokemi för utvärdering proteinuttryck är begränsat av subjektiva, halv kvantitativa analysmetoder 22,23. Advance plattformar har skapats för hög genomströmning analys av biomarkörer uttryck och lokalisering. Detaljerad segmentering av både vävnad och subcellulära fack tillåter användare att studera biomarkör uttryck, lokalisering, och samlokalisering med andra markörer av intresse. I tidigare studier har vi visat användbarheten av IHC och multispektral avbildning, i synnerhet vid användning för att studera proteiner lokaliserade till samma cellulära fack 18,20,21. I kombination med vävnads mikroarrayer 24, dessa tekniker möjliggör snabbare och mer objektiv kvantifiering av proteinuttryck än vad som tillåts av manuell analys av en patolog.

En fråga med användning av immunohistokemi för protein kvantifiering är reproducerbarhet av resultaten på grund av subjectiv karaktär analys och inneboende skillnader i teknik och reagens. En betydande fördel med att använda plattformar som multispektral avbildning för mätning av proteinuttryck är reproducerbarheten av resultaten. Data från datoriserade patologi plattformar korrelerar starkt med manuell analys av en patolog medan återvänder data i en kontinuerlig format och avsevärt minska arbetstid, särskilt när man arbetar med stora provstorlekar 12,16,25. Studier har visat hög total samstämmighet i resultaten mellan olika multispektrala plattformar 14. Vidare har vi tidigare visat att färgningsresultat är mycket reproducerbara även när det finns variabilitet i antal proteiner undersöktes 12. Användningen av automatiska patologi plattformar för både färgning och analys kommer inte att eliminera alla avvikelser i resultat, såsom de som härrör från antikroppar som skapats mot olika epitoper, men dessa plattformar gör avsevärt minska fördomar och irreproducerbarhet vanligen förknippas med immunohistokemi.

Det finns särskilda åtgärder inom det protokoll som är nödvändiga för att returnera korrekta, reproducerbara resultat. Lämplig experimentell design genom val av proteiner som skall ingå som vävnad eller subcellulära markörer är viktiga för en korrekt segmentering. När du utför positivitet analys, val av en lägre tröskel för positiv färgning har en stor inverkan på slutresultatet. Samtidigt välja en tröskel för "on / off" proteiner såsom nukleära transkriptionsfaktorer är ganska enkelt, att hitta en tröskel för mer heterogent uttryckta proteiner är svårt. Detta bör helst ske i samarbete med en styrelse-certifierad genitourinary patolog eller som en genomsnittlig poäng på flera observatörer för att hitta den perfekta tröskel för analys.

Det är viktigt att känna igen vissa begränsningar i aktuella versioner av denna teknik. när frånklarnings cytoplasman utrymmet, kan tre tillvägagångssätt användas: (1) färgning med en cytoplasma-specifik markör, (2) färgning med ett membran-specifik markör och använda kärnan-till-membran markör avstånd som cytoplasma, och (3) med användning av en ritning tillvägagångssätt att manuellt definiera gränserna för cytoplasman i förhållande till kärnan. Från vår erfarenhet, användning av ett membran-specifik markör är den mest exakta tekniken. Den manuella ritning tillvägagångssätt är normalt korrekt om kärnor är centralt belägna eller om biomarkör av intresse är jämnt fördelade över hela cytoplasman. Noggrant definiera cytoplasman av stromaceller som fibroblaster och glatta muskelceller är fortfarande svårt och bör tas i beaktande vid utformningen ett experiment.

En annan begränsning av tekniken är beroende av kärnor för cellsegmentering. Om sektionsplanet utesluter kärnan i en viss cell, kommer denna cell inte ingå i analysen. Om det inte finns någonsynlig cytoplasma mellan intilliggande kärnor eller klumpar av kärnor, dessa ofta erkänd som en stor kärnkrafts klump, snarare än distinkta kärnor. Generellt sett är hematoxylin kontrast normalt tillräckligt för acceptabel kärnsegmentering, och manipulation av programvaruinställningar som högsta gräns för kärnan storlek kan åtgärda de flesta problem med kärnsegmentering.

En slutlig begränsning av automatiserade patologi plattformar är opålitlig segmentering av vävnader till följd av dålig experimentell design. Vikten av att välja lämpliga vävnads- och cell biomarkörer för att besvara frågan om intresse kan inte överskattas. Som vi visat i våra representativa resultat, kan en epitelial eller stromal markör som väsentligt ändrar uttryck mellan sjukdomstillstånd innebära problem när du skapar en algoritm för vävnadssegmentering. Det är värt att notera att det finns alternativ när svårt analyser som här uppstår. Till exempel, individuell images kan analyseras genom att manuellt dra alla vävnads fack, snarare än genom att tillämpa en algoritm från en träningsuppsättning av bilder. Detta ger fördelen av segmentering som är helt i linje med vad användaren önskar, men det införs också subjektivitet och kan avsevärt öka den tid som krävs för att avsluta en analys. Lämplig experimentell design är det enklaste sättet att påskynda analys och maximera noggrannheten hos vävnader och celler segmentering.

Denna teknik och protokoll har många framtida tillämpningar. Ett flertal biomarkörer för särskilda sjukdomstillstånd har identifierats men inte valideras. Hög genomströmning objektiv analys med multispektrala plattformar underlättar validering av dessa biomarkörer. Vidare kan utvärderingen av uttryck och samlokalisering av flera proteiner ge insikter i dåligt förstådda signalvägar. Utan tvekan, att minska den inneboende subjektivitet i samband med analys av immunhistokemisk staining är värdefull för förståelse av uttryck och lokalisering av ett brett spektrum av proteinmarkörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar University of Wisconsin translationell forskning Initiativ i patologi laboratorium, delvis med stöd av UW Institutionen för patologi och laboratoriemedicin och UWCCC bidrag P30 CA014520, för användning av sina anläggningar och tjänster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3F1GAL NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
Ethyl Alcohol-200 proof Fisher Scientific 4355223 NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl Fisher Scientific BP153-1 NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tween 20 Chem-Impex 1512 NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0
Phosphate-buffered saline Fisher Scientific BP2944-100 NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0
Peroxidazed Biocare Medical PX968 Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage.
Estrogen Receptor alpha Thermo Fisher Scientific-Labvision RM9101 Not classified as hazardous
Androgen Receptor SCBT sc-816 Not classified as hazardous
CD147 Biodesign P87535M Not classified as hazardous
E-cadherin Dako M3612 Not classified as hazardous
Renoir Red Andibody Diluent Biocare Medical PD904 It is specially designed to work with Tris-based antibodies
DeCloaking Chamber  Biocare Medical Model DC2002 Take normal precautions for using a pressure cooker
Barrier pen-Immuno Edge  Vector Labs H-4000
Denaturing Kit-Elution step Biocare Medical DNS001H Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer Biocare Medical RHRP520 Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer Biocare Medical RALP525 Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer Biocare Medical M3M530 Not classified as hazardous
Betazoid DAB Chromogen Kit Biocare Medical BDB2004 1. DAB is known to be a suspected carcinogen.
2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight.
3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing.
4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes.
5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal
Warp Red Chromogen Kit Biocare Medical WR806 Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. 
Vina Green Chromogen Kit Biocare Medical BRR807 Harmful if swallowed
Bajoran Purple Chromogen Kit Biocare Medical BJP807 Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation.
Cat Hematoxylin Biocare Medical CATHE Purple  solution  with  a  mild  acetic  acid  (vinegar)  scent.  May  be
 irritating  to  skin  or  eyes.  Avoid  contact  with  skin  and  eyes.  Avoid  ingestion.
XYL Mounting Media Richard Allen 8312-4 NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
1.5 Coverslips Fisher Brand 22266858 Sharp edges
Incubation (Humidity)Chamber obsolete obsolete Multiple vendors available
Convection Oven Stabil- Therm C-4008-Q
Background Punisher Blocking Reagent Biocare Medical BP974 This product is not classified as hazardous. 
inForm software PerkinElmer CLS135781 Primary multispectral imaging software used in manuscript
Nuance software PerkinElmer Nuance EX Software used for making spectral libraries within manuscript
Vectra microscope and slide scanner PerkinElmer VECTRA Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31, (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70, (3), 255-264 (2001).
  3. Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116, (6), 491-498 (2008).
  4. McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109, (8), 716-721 (1985).
  5. Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20, (11), 1172-1182 (2007).
  6. Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105, (7), 2916-2923 (2005).
  7. Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455, (4), 375-381 (2009).
  8. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14, (12), 929-931 (1966).
  9. Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34, (1), 1-12 (1981).
  10. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274, (5289), 998-1001 (1996).
  11. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185, (7), 1135-1148 (2009).
  12. Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44, (1), 29-38 (2013).
  13. Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3, (108), (2011).
  14. Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65, (6), 496-502 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  16. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
  17. Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9, (10), e109102 (2014).
  18. Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2, (4), 313-322 (2014).
  19. Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15, (1), 549 (2015).
  20. Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74, (9), 923-932 (2014).
  21. Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85, (4-5), 140-149 (2013).
  22. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, (4), 411-424 (2006).
  23. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  24. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  25. Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56, (4), 523-529 (2010).
Kvantifiering av proteinuttryck och samlokalisering Använda Multiplex Immuno-histokemisk färgning och multispektrala
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauman, T. M., Ricke, E. A., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53837, doi:10.3791/53837 (2016).More

Bauman, T. M., Ricke, E. A., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53837, doi:10.3791/53837 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter