Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Published: March 22, 2016 doi: 10.3791/53840

Abstract

الفيروسات القهقرية معرض تفضيلات التكامل التوقيع على كل من المستويين المحلي والعالمي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل ل(1) جيل من مكتبات متنوعة من مواقع التكامل فيروسات باستخدام PCR (LM-PCR) والتضخيم بوساطة ربط وتسلسل الجيل التالي (خ ع)، (2) رسم خرائط الموقع الجيني لكل virus- تستضيف ملتقى باستخدام BEDTools، و (3) تحليل البيانات الإحصائية لأهميتها. تجزئة الحمض النووي الجيني المستخرجة من الخلايا المصابة عن طريق الهضم مع الانزيمات تقييد أو صوتنة. بعد مناسبة الحمض النووي نهاية إصلاح، و تربط linkers المزدوج تقطعت بهم السبل على نهايات الحمض النووي، ويجري شبه متداخلة PCR باستخدام بادئات التكميلية لكل من طويلة تكرار محطة (LTR) نهاية الفيروس والحمض النووي رابط ligated. الاشعال PCR تحمل متواليات اللازمة لتجميع الحمض النووي خلال NGS، يلغي الحاجة إلى ربط محول منفصل. وتجري مراقبة الجودة (QC) لتقييم تفتيت الحمض النووي حجم التوزيع والتكيفإيه التأسيس الحمض النووي قبل خ ع. يتم تصفيتها ملفات الإخراج تسلسل LTR التي تحتوي يقرأ، وتسلسل تحديد LTR ورابط واقتصاص بعيدا. يتم تعيين قلص تسلسل الخلية المضيفة لجينوم مرجع باستخدام بلاط ويتم تصفيتها عن الهوية الحد الأدنى 97٪ إلى نقطة وحيدة في الجينوم المرجعية. هي تمحيص مواقع التكامل فريدة من نوعها لالنوكليوتيدات المجاورة (الإقليم الشمالي) تسلسل والتوزيع النسبي لمختلف الخصائص الجينومية. باستخدام هذا البروتوكول، مكتبات موقع تكامل عالية التعقيد يمكن بناؤها من الحمض النووي الجيني في ثلاثة أيام. وبالتالي يمكن إجراء بروتوكول بأكمله الذي يشمل التهاب فيروسي خارجي من خلايا نسيج الثقافة عرضة للتحليل الموقع التكامل في ما يقرب من 1-2 أسابيع. التطبيقات الحديثة لهذه التكنولوجيا تتعلق التحليل الطولي للمواقع التكامل من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

دمج الحمض النووي الفيروسي (vDNA) في الجينوم الخلية المضيفة خطوة أساسية في دورة حياة فيروس. ويتم إنجاز التكامل من إنزيم مدمج الإنزيم الفيروسي (IN)، التي تنفذ عمليتين الحفازة متميزة تؤدي إلى إنشاء طليعة الفيروس إدراج مستقر 1. في مفارز إشراك طرفي vDNA الخطية التي يتم إنشاؤها من خلال النسخ العكسي، وتشكيل intasome العليا مع vDNA ينتهي عقد معا من قبل في متعدد القسيمات 2-4. في يشق 'ينتهي من vDNA المصب من 5'-CA-3 ثابتة "3 تسلسل في عملية تعرف باسم 3'معالجة تاركة راحة 3" ينتهي مع مجموعة الهيدروكسيل على رد الفعل في كل vDNA النهاية 5-8. يتم استيراد intasome في وقت لاحق الى نواة كجزء من التجمع كبيرة من المضيف والبروتينات الفيروسية المعروفة باسم مجمع preintegration (PIC) 9-11. بعد أن واجهت الهدف الخلوي الحمض النووي (tDNA)، يستخدم في vDNA 3'-الهيدروكسيل غروشكا ليلتصق الجزء العلوي tDNA وخيوط أسفل بطريقة متداخلة في وقت واحد ينضم إلى vDNA للمجموعات الفوسفات tDNA 5 "خلال عملية نقل حبلا 12،13.

الفيروسات القهقرية تفضيلات المواقع التكامل المعرض على المستويين المحلي والعالمي. محليا، مواقع التكامل إجماع تتكون من تسلسل tDNA المتناوب الحفاظ ضعيفة التي تمتد من حوالي 5-10 سنة مضت المنبع والمصب من المواقع الإدراج vDNA 14،15. وعلى الصعيد العالمي، الفيروسات تستهدف الشروح لونين محددة 16. هناك سبعة أجناس فيروسات مختلفة - ألفا خلال إبسيلون، lenti، وspuma. وlentiviruses، والتي تشمل HIV-1، لصالح التكامل داخل الهيئات الجينات كتب بنشاط 17، في حين أن gammaretroviruses دمج تفضيلي إلى المواقع النسخي بداية (TSSs) والمناطق محسن النشطة 18-20. في تناقض حاد، منحازة بقوة spumavirus نحو heterochromالمناطق آتيك، مثل المجالات المرتبطة الصفيحة الفقراء الجينات 21. تفضيلات قاعدة tDNA المحلية هي في جزء كبير منه تمليه شبكات معينة من أسماء البروتين النووي بين في وtDNA 13،22،23. لlentiviruses وgammaretroviruses، والتكامل بالنسبة لشروح الجينوم هو في جزء كبير تحكمه التفاعلات بين في والعوامل الخلوية وما شابه 24-27. تغيير تفاصيل شبكة التفاعل IN-tDNA 13،22،23،28 وتعطيل أو إعادة الهندسة في استضافة التفاعلات عامل 25-27،29-32 ثبت استراتيجيات لإعادة التوجيه التكامل على المستويين المحلي والعالمي، على التوالي.

وزادت قوة الإجراءات تسلسل الحمض النووي يستخدم لفهرسة مواقع التكامل فيروسات بشكل كبير على مدى العقود الماضية. تم انتشال المواقع التكامل في العمل الرائد باستخدام تنقية شاقة وتقنيات الاستنساخ اليدوية لانتاج عدد قليل من المواقع الفريدة في 33،34 الدراسة.الجمع بين LM-PCR التضخيم من تقاطعات الحمض النووي LTR المضيفة مع القدرة على الخريطة مواقع التكامل الفردية لجينوم مشروع الماوس الإنسان وتحول الميدان، مع عدد من المواقع تعافى من الإصابة خلية زراعة الأنسجة الخارجية المتزايدة إلى عدة مئات إلى آلاف 17 18. وقد ارسلت مزيج أحدث من LM-PCR مع منهجية خ ع ​​عمق مكتبة تقفز. على وجه التحديد، أسفرت سلسلة البايرو بناء على أمر من عشرات الآلاف من المواقع التكامل فريدة 30،35-38، في حين المكتبات التسلسل من خلال استخدام تجميع الحمض النووي يمكن أن تسفر الملايين من تسلسل فريد 19-21،39. نحن هنا وصف بروتوكول LM-PCR الأمثل لتضخيم وتسلسل مواقع التكامل فيروسات باستخدام خ ع الحمض النووي المجموعات. طريقة يدمج يتطلب تسلسل محول الى الاشعال PCR، وبالتالي مباشرة إلى جزيئات تضخيم الحمض النووي، مما يحول دون الحاجة إلى خطوة إضافية محول ربط قبل sequenالوراثة 40. خط أنابيب تحليل بيوينفورمتيك، من إعراب تسلسل البيانات الخام للتقاطعات الحمض النووي LTR المضيفة لرسم خرائط لمواقع التكامل فريدة من نوعها لصلة بالموضوع ميزات الجينومية، كما وصفها بشكل عام. وفقا لأسبقية أنشئت من بروتوكولات المنهجية السابقة في هذا المجال 36،38،41-43، ويمكن تطوير البرامج النصية المخصصة لمساعدة الانتهاء من الخطوات المحددة في خط أنابيب المعلوماتية الحيوية. وتتجلى فائدة وحساسية بروتوكول مع بيانات تمثيلية عن طريق تضخيم، والتسلسل، ورسم خرائط HIV-1 مواقع التكامل من الخلايا زراعة الأنسجة المصابة في تعدد التقريبي للعدوى (وزارة الداخلية) من 1.0، فضلا عن سلسلة المعايرة من هذا الحمض النووي المخفف من خلال الحمض النووي الخلوي غير مصاب في 5 أضعاف خطوات لتخفيف الحد الأقصى من 1: 15625 لانتاج ما يعادل وزارة الداخلية التقريبية 6.4 × 10 -5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. توليد مخزونات فيروس

ملاحظة: وصفت مخطط تدفق الجانب مقاعد البدلاء الرطب من هذا البروتوكول في الشكل 1 وتفاصيل إنتاج الأسهم الفيروسية والعدوى لاحق من خلايا نسيج الثقافة ينطبق عموما على أنواع مختلفة من الفيروسات. بالنسبة لبعض التجارب، والخلية المستهدفة قد لا تعبر عن مستقبلات الفيروسية الذاتية (ق)، وفي مثل هذه الحالات بناء جزيئات فيروس pseudotyped إيواء مغاير الفيروسي بروتين سكري مغلف، مثل بروتين سكري G من فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)، سيكون مطلوب للعدوى 44،45.

ملاحظة: يجب أن تؤخذ الاحتياطات عند العمل مع HIV-1. على الرغم من مبادئ توجيهية محددة تختلف من مؤسسة لأخرى، ينبغي أن تتم جميع الأعمال القائمة على الفيروس في مخصص، مشغل تقتصر خزانة السلامة البيولوجية (عادة يشار إلى نسيج الثقافة هود). معدات الوقاية الشخصية المناسبةيتضمن حماية الوجه، ويغطي الحذاء، وطبقة قفاز مزدوجة، ودعوى المعطف كامل الجسم يجب أن ترتديه في جميع الأوقات. وينبغي العمل جميع النفايات السائلة الناتجة من التجارب ذات الصلة الفيروس مع التبييض (تركيز النهائي 10٪)، وجميع النفايات بما في ذلك المواد الصلبة يجب تعقيمها قبل التخلص منها.

  1. قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، لوحة 3.3 × 10 6 خلايا HEK293T في 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني و 1٪ (ت / ت) البنسلين / الستربتومايسين (10000 U / مل الأسهم) في كل من خمسة أطباق 100 ملم.
    ملاحظة: تستكمل-DMEM ويشار إلى DMEM-FPS من هذه النقطة.
  2. وفي اليوم اللاحق، transfect الخلايا مع 10 ميكروغرام البلازميد تحمل كامل طول استنساخ الجزيئية فيروسات أو 9 ميكروغرام من ناقلات جولة واحدة في حذف المغلف مع 1 ميكروغرام من التعبير بناء VSV-G باستخدام الكواشف ترنسفكأيشن المتاحة تجاريا أو فوسفات الكالسيوم.
    1. احتضان جملتعلمي اللغة اإلنكليزية عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة خلية ترطيب مع 5٪ CO 2 (هذا الشرط الآخرة المشار إليها باسم "نسيج الثقافة الحاضنة"). بعد ما يقرب من 48 ساعة، حصاد وسائل الإعلام الخلية التي تحتوي على الفيروس باستخدام ماصة حجمية وتمر من خلال 0.45 ميكرون تصفية حسب تدفق الجاذبية.
    2. تركيز الفيروس عن طريق تنبيذ فائق في 200000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. resuspend الكرية الفيروس في 500 ميكرولتر DMEM-FPS تحتوي على 20 U الدناز، واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الخطوة الدناز يساعد على الحد من استعادة تسلسل البلازميد غير المرغوب فيها من قبل القضاء وطأة DNA البلازميد الذي لا يزال قائما من الإجراء ترنسفكأيشن.
  3. تحديد تركيز P24 46 باستخدام HIV-1 P24 مستضد عدة أسر حسب تعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: يمكن أيضا تركيز الفيروسات يحددها النشاط الناسخ العكسي فحص 47،48. بدلا من ذلك، مستوى الفيروس وظيفية يمكنيتحدد من خلال قياس وزارة الداخلية. ويتم ذلك بسهولة أكبر باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز مع الفيروسات التي تعبر عن الجينات مراسل الفلورسنت مثل تعزيز البروتين الفلوري الأخضر. قد يكون تقرير وزارة الداخلية مفيدة بشكل خاص عند العمل مع الخلايا الأولية التي قد لا تدعم نفس المستوى من العدوى كما خطوط الخلايا الأمثل.

2. الخلايا تعدى مع الفيروسات

  1. لوحة 3.0 × 10 5 خلايا HEK293T لكل بئر في لوحة 6 جيدا في 2.5 مل DMEM-FPS واحتضان بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة الحاضنة.
    ملاحظة: عدد من المواقع التكامل فريدة تعافى مع هذا البروتوكول يتناسب طرديا مع عدد الخلايا وكمية الفيروس النشط المستخدمة في العدوى.
  2. تصيب الخلايا مع تركيز P24 الفيروسي النهائي من 500 نانوغرام / مل في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر الطازجة DMEM-FPS لمدة 2 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة، ثم يضاف 2 مل DMEM-FPS قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية لكل بئر و تستمر الحضانة.
  3. في48 ساعة بعد العدوى، وإزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع 2 مخزنة المالحة الفوسفات مل (PBS). إضافة 0.5 مل التربسين-EDTA قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، وبعد عدد قليل من ثانية تفقد البصر الآبار للالخلع الخلية.
  4. إضافة 2 مل قبل تحسنت DMEM-FPS و resuspend الخلايا عن طريق لطيف أعلى / أسفل pipetting لمع ماصة حجمية ~ 10 مرات. نقل الحل إلى 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة التي تحتوي على 18 مل قبل تحسنت DMEM-FPS، واحتضان الخلايا في نسيج الثقافة الحاضنة.
  5. بعد الحد الأدنى خمسة أيام من بداية العدوى، وجمع الخلايا عن طريق إزالة وسائل الإعلام، ويغسل مع 5 مل برنامج تلفزيوني، إضافة 2 مل قبل تحسنت التربسين-EDTA، و resuspend مع 5 مل قبل تحسنت DMEM-FPS قبل pipetting. أجهزة الطرد المركزي في حل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 2500 x ج، وتجاهل طاف.
    ملاحظة: على الرغم من التكامل في ظل هذه الظروف الهضاب في حوالي 48 ساعة بعد العدوى 49،50، يطلب من 3 أيام إضافية من ثقافة إلى ذلك كافياذ تخفيف تركيز جزيئات الحمض النووي غير متكاملة التي تنتج عن خلية القاعدة إعادة التركيب الحمض النووي أو autointegration الفيروسية التي تتوسط فيها.
  6. استخراج الحمض النووي الجيني من بيليه الخلية باستخدام مجموعة المتاحة تجاريا (على سبيل المثال، انظر 51). أزل الحمض النووي من العمود التبادل الأيوني المتوفرة مع 200 ميكرولتر من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5.
    ملاحظة: قسامة من الخلايا يجب أن توزع في 48 ساعة بعد العدوى (الخطوة 2.3) لفحص العدوى لضمان عدوى فيروس الصحيح قبل خ ع.

3. جزء الجينوم الحمض النووي عن طريق صوتنة أو تقييد انزيم دايجست

ملاحظة: شظايا صوتنة الحمض النووي الجيني بطريقة مستقلة عن التسلسل تقريبا، وبالتالي هو الوضع الأفضل للتجزئة عندما تسلسل العينات مع معدل الانتعاش المتوقع انخفاض (على سبيل المثال، الخلايا المصابة المريض أو التهابات بدأت في الانخفاض النسبي وزارة الداخلية). وعلاوة على ذلك، صوتنة يسمح احد لتمييز التكرارات PCR للحزبدائرية تسلسل موقع التكامل من التكامل فريدة من نوعها في نفس الموقع، وهو أمر حاسم للتمييز بين التوسع نسيلي من الخلايا التي تحتوي على طليعة الفيروس لدى المرضى المصابين (راجع الخطوة 11 أدناه) 39،52-54.
ملاحظة: يجب أن يكون المشقوق الحمض النووي فورا المصب من LTR المنبع لتقليل التضخيم من متواليات الفيروسية الداخلية خلال LM-PCR. الانزيم تقييد BglII التي تقع 43 نقطة أساس المصب من تسلسل U5 المنبع ويتعارض ذلك لربط لاحق مع الحمض النووي ولدت MseI-ينتهي يعمل بشكل جيد مع العديد من HIV-1 سلالات (الشكل 1B). عند إعداد الحمض النووي عن طريق صوتنة، ينبغي أن تطبق على انزيم التقييد الشق الداخلي بعد ربط رابط (انظر الشكل 1C - E والخطوة 4.3 أدناه).

  1. لصوتنة، خلط 10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني في nuclease خالية من المياه إلى الحجم النهائي من 120 ميكرولتر. يصوتن باستخدام معلمات لمتوسط ​​حجم كسر 500 سنة مضت (جولتين من الفقرة التاليةمتر: دورة العمل: 5٪. كثافة: 3؛ دورة في انفجار: 200. الوقت: 80 ثانية).
  2. تنقية الحمض النووي sonicated باستخدام طقم تنقية PCR. إصلاح الحمض النووي ينتهي باستخدام الحمض النووي عدة النهائي إصلاح وتنقية الحمض النووي باستخدام طقم تنقية PCR. A-ذيل الحمض النووي باستخدام Klenow إكسو - انزيم وتنقية الحمض النووي الذيل وباستخدام طقم تنقية PCR. الرجوع إلى 51،52 لمزيد من التفاصيل من استخدام عدة.
  3. لهضم تقييد نوكلياز داخلية، وقطع 10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حجم 100 ميكرولتر مع العازلة التي قدمتها الشركة المصنعة ومزيج من الأنزيمات (100 U لكل منهما) التي تولد يتدلى 5'-TA، فضلا عن انزيم يتعارض مثل BglII أن يشق مجرى النهر من المنبع LTR الفيروسي. تنقية الحمض النووي في اليوم التالي باستخدام طقم تنقية PCR.
    ملاحظة: أي من الانزيمات التقييد يجب أن تقطع داخل محطة ~ 30 نقطة أساس في نهاية الحمض النووي الفيروسي الذي يتم تضخيمه من قبل بروتوكول LM-PCR. هذا البروتوكول تضخيم تحديدا U5نهاية HIV-1 الحمض النووي.

4. يصلب رابط [أليغنوكليوتيد وLigate إلى تجزئتها الجينوم الحمض النووي

ملاحظة: إعداد لرابط غير المتماثلة التي تحتوي على المتراكمة والتي تتوافق مع شظايا الحمض النووي أعلاه (انظر الجدول رقم 1 لتسلسل أليغنوكليوتيد] المستخدمة في هذا البروتوكول). رابط ليتم استخدامها مع الحمض النووي sonicated يجب أن يحتوي على متوافق تي 3 "فيض، في حين رابط لالحمض النووي يهضم MseI-يجب أن يحتوي على متوافق 5'-TA تراكم (الشكل 1). يجب أن تحتوي على حبلا رابط قصير بالإضافة إلى تعديل الكيميائية غير قابلة للتمديد، مثل 3'-أمين، لكبح ردود الفعل التضخيم لاحقة نحو الحمض النووي من الفائدة.
ملاحظة: عند إعداد عدة مكتبات موقع التكامل المختلفة بصورة متوازية و / أو عندما عينات فريدة مضاعفة على نفس المدى التسلسل، فمن المستحسن استخدام linkers فريدة لكل عينة للحد من إمكانية عينة عبر كونتامانأوجه خلال PCR. وهذا يعني بالإضافة إلى استخدام بادئات رابط فريدة لكل عينة خلال شبه متداخلة PCR (هو موضح أدناه). يمكن تصميم مسارات رابط فريدة من نوعها والاشعال رابط من قبل الهرولة متواليات النوكليوتيد رابط المدرجة في الجدول 1 مع الحفاظ مماثل العام المحتوى٪ GC والمواقف المتراكمة المعمول بها.

  1. يصلب فروع رابط قصيرة وطويلة في 35 ميكرولتر من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8،0-0،1 مم EDTA (تركيز النهائي من 10 ميكرومتر من كل النوكليوتيد) عن طريق التسخين إلى 90 درجة مئوية والتبريد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة في الخطوات من 1 ° C لكل دقيقة.
  2. إعداد أربعة على الأقل ردود الفعل ربط موازية لكل عينة الحمض النووي الجيني، والتي تحتوي على 1.5 ميكرومتر ligated رابط، 1 ميكروغرام الحمض النووي مجزأة، و 800 يغاز U T4 الحمض النووي في 50 ميكرولتر. Ligate بين عشية وضحاها في 12 درجة مئوية. تنقية اليوم التالي مع عدة تنقية PCR.
  3. للحصول على عينات من صوتنة أعدت، هضم رد فعل ربط تنقيته مع 100 U من restricانزيم نشوئها أن يشق مجرى النهر من المنبع LTR (على سبيل المثال، BglII لHIV-1) تحت الشركة المصنعة أوصت الظروف بين عشية وضحاها. تنقية الحمض النووي باستخدام طقم تنقية PCR.

5. أسهب الفيروسية LTR-المضيف الجينوم المفارق الحمض النووي عن طريق PCR متداخلة نصف

ملاحظة: لضمان التنوع مكتبة الأمثل، 4-8 على الأقل تقارير إنجاز المشروعات موازية، اعتمادا على تركيز الحمض النووي للتفاعل ربط استردادها، يجب أن تكون مستعدة لكل عينة لالجولتين PCR. يجب أن يكون كميا تركيز قالب الحمض النووي عن طريق القياس الطيفي. في هذا البروتوكول في الجولتين الأولى والثانية من PCR تستخدم بادئات LTR محددة متداخلة، ولكن يتم استخدام نفس التمهيدي رابط معين لالجولتين (الجدول 1). والثاني التمهيدي LTR محددة مستديرة وتسلسل محول التمهيدي ترميز رابط معين لتجميع الحمض النووي وكذلك التسلسل مواقع ملزم التمهيدي. أيضا بترميز التمهيدي LTR محددة متداخلة تسلسل المؤشر 6 الإقليم الشمالي، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي يمكن أن تختلف بين الاشعال مختلفة للمكتبات المتنوعة داخل نفس المدى التسلسل.

  1. إعداد تقارير إنجاز المشروعات الجولة الاولى التي تحتوي على المكونات في أنبوب كما هو موضح في الجدول رقم (2).
    ملاحظة: التمهيدي رابط معين المرافئ 22 الإقليم الشمالي التكامل على رابط، ودرجة حرارة انصهار من 53 درجة مئوية، وهو GC-المحتوى من 45٪، ولها 3 'نهاية يقع 15-16 سنة مضت المنبع من 3' ترميني من فروع رابط مختلفة طويلة (الجدول 1). الجولة الأولى 27 الإقليم الشمالي LTR التمهيدي لديه درجة حرارة انصهار من 59 درجة مئوية، وهو GC-المحتوى من 48٪، ويقع "نهايته 3 34 سنة مضت المنبع من U5 محطة HIV-1. منطقة الدور الثاني التمهيدي 26 الإقليم الشمالي LTR التي هي مكملة لHIV-1 LTR لديها درجة حرارة انصهار 60 درجة مئوية، وهو GC-المحتوى من 50٪، ونهايته 3 "يقع 18 سنة مضت المنبع من U5 الفيروسي محطة. فمن المستحسن أن درجة الحرارة النوكليوتيد ذوبان وGC-المحتوى يجب أن تحاكي هذه المعايير إذا المستخدمينالاشعال تصميم PCR مع تسلسل المتغيرة (بما في ذلك للاستخدام مع الفيروسات الأخرى) 21.
  2. تشغيل أول جولة PCR تحت المعلمات thermocycler التالية: دورة واحدة: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 30 دورات: 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ دورة واحدة: 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. تجميع ردود الفعل وتنقية باستخدام طقم تنقية PCR. إعداد تقارير إنجاز المشروعات الدور الثاني يحتوي على المكونات في أنبوب كما في الجدول 3. تشغيل الجولة الثانية من PCR باستخدام المعلمات thermocycler هو موضح في الخطوة 5.2. تجميع ردود الفعل وتنقية الحمض النووي باستخدام PCR عدة تنقية التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: مجموعة متنوعة من متواليات مؤشر أوصى متوافقة مع خ ع الحمض النووي تجميع تتوفر 71.

6. تنفيذ مراقبة الجودة وخ ع (مكتمل عادة من قبل مرفق التسلسل)

  1. (QC فحص رقم 1) تأكيد الخطوة 5.3 تركيز الحمض النووي المكتبة باستخدام الفلوريةمتر 55. لفترة وجيزة، وإعداد معايير ونماذج تجريبية في الحجم النهائي من 200 nuclease خالية من المياه ميكرولتر. أنابيب دوامة لمدة 2-3 ثانية، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، ثم قراءة العينات في التألق.
    ملاحظة: يجب أن العينات تحتوي على الحد الأدنى من تركيز 2 نانومتر الحمض النووي مكتبة في حد أدنى لحجم 15 ميكرولتر.
  2. (QC فحص رقم 2) تأكيد توزيع حجم تفتيت الحمض النووي باستخدام الفحص القائمة على الشريط 56.
    ملاحظة: إن التوزيع المثالي هو ذروة DNA واسعة نسبيا تتمحور حول 500 شركة بريتيش بتروليوم في طول. إذا كمية كبيرة من المواد أكبر من 1 كيلو بايت، ثم فمن المستحسن أن تتضمن إجراء الحجم اختيار للقضاء على الأنواع الحمض النووي لفترة أطول، والتي سوف تعيق جسر التضخيم خلال المجموعات. على النقيض من ذلك، إذا كان ذروة كبيرة هو واضح حول 100-200 نقطة أساس، وهو ديمر التمهيدي قد شكلت خلال PCR. في هذه الحالة يجب أن يكون الأمثل الإجراء للحد من تشكيل dimers التمهيدي.
  3. (QC فحص رقم 3) شركةnfirm التأسيس السليم للمحولات في مكتبة الحمض النووي عن طريق الكمي PCR 57.
  4. أداء خ ع التالية الأدب تطبيق الشركة المصنعة. الاستفادة من ارتفاع في ومن 10٪ (ث / ث) ΦX174 الحمض النووي، والتي سوف تحسين مقاييس الجودة في الوقت الحقيقي من خلال توفير تكوين قاعدة متوازنة لتشغيل التسلسل.
    ملاحظة: عادة ما يتعرضون تجارب موقع التكامل التسلسل إلى واحد نهاية 150 سنة مضت (SE150) أو إقران نهاية 150 سنة مضت (PE150) التسلسل. PE150 مفيدة بشكل خاص للقبض على نقطة التعلق رابط على كل جزيء الحمض النووي (على سبيل المثال، عند التدقيق في مواقع التكامل عن أدلة على التوسع نسيلي الخلية المضيفة).

7. استخدام بيثون أو برل مخصص لتحليل البيانات تسلسل لاحتواء LTR-متواليات، والمحاصيل بعيدا LTR و رابط متواليات، وتعيين إلى المرجعي الجينوم مع BLAT

  1. ملفات FASTA المسح الضوئي لLTR التي تحتوي على تسلسل يقرأ، LTR المحاصيل وتسلسل رابط بعيدا عن المضيف تسلسل الحمض النووي الجيني، وتصدير هذه السلاسل إلى ملف FASTA الجديد. خريطة اقتصاص يقرأ على كل من الجينوم المرجعية (مثل الإصدارات الجينوم البشري hg19 أو GRCh38) والجينوم الفيروسي باستخدام بلاط 58، مع موقع التكامل الناتج إحداثيات تصديرها إلى ملف txt منفصل، وذلك باستخدام الإعدادات التالية:
    stepSize = 6، minIdentity = 97، وmaxIntron = 0
  2. تحليل الإخراج BLAT. TXT الملف، إزالة autointegrations (أي أدلة على أن نهاية LTR وإدماجها في المنطقة الداخلية للجينوم الحمض النووي الفيروسي) ورسم تسلسل الأخرى لجينوم HIV-1، وإنشاء الناتج منفصل. TXT الملف الذي تم تكثيف جميع المواقع التكامل مكررة في واحدة، وتنسيق الزيارات فريدة من نوعها.

8. إنشاء ملفات .bed يحتوي على فترات 15-NT التكاملات المحيطة، تحويل هذه الملفات إلى FASTA، وإنشاء تسلسل شعارات لعرض تفضيلات قاعدة محيطة مواقع التكامل

  1. إنشاء ملفات .bed تلك القائمة فاصل من قواعد لكل موقع التكامل. واقترح لا يقل عن 15 قواعد (5 المنبع والمصب 10) لتوليد تسلسل الشعار. إنشاء ملف FASTA من هذه الملفات .bed باستخدام الدالة fastaFromBed من BEDTools 59 وهذا الأمر:
    fastaFromBed -فاي / الدليل / إلى / إشارة / الجينوم / -اسم -s -bed 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    ملاحظة: انضم ثابتة الفيروسي 5'-CA-3 "ثنائي النوكليوتيد لاستضافة الحمض النووي خلال التكامل، والتحقق من تقاطع محطة LTR إلى الحمض النووي الخلوي هو مرشح الأولي المهم تحديد بحسن نية مواقع التكامل. نحن بالإضافة إلى تجميع الشعارات تسلسل من هذا المضيف تسلسل الحمض النووي السكان للتحقق من النتائج التجريبية. كما تعرض الفيروسات القهقرية تفضيلات قاعدة توقيع المحيطة المواقع اندماجهم 14،15، والشعارات تسلسل تعمل على التحقق من أن المواقع الجينومية معين نشأت من خلال التكامل بوساطة IN-بالمقارنة مع آليات إعادة التركيب أخرى مثل الحمض النووي غير المتجانسإنهاء الانضمام 60،61.
  2. استخدام WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) لإنشاء الشعارات تسلسل من ملفات FASTA. انقر على "اختيار ملف" لتحميل ملف FASTA، واستخدام الإعدادات التالية: تنسيق الإخراج وقوات الدفاع الشعبي (ناقلات)؛ حجم الشعار، عموما؛ عدد المركز الأول، -5. مجموعة الشعار، -5 إلى 5؛ على نطاق والعمودي، 0.1، Y-محور تباعد عرة، 0.5، نظام الألوان الكلاسيكية (NA).

9. خلق الوسطى قاعدة زوج .bed الملفات، التحقق من وجود نموذج عبر التلوث، وخريطة توزيع مواقع تكامل فريد نسبة إلى ذات الصلة الجينوم الميزات

  1. منذ يحدث التكامل فيروسات بطريقة متداخلة في الفروع tDNA، وضبط الإحداثيات الدقيقة للمواقع التكامل لتعكس بي بي المركزي للازدواجية لرسم الخرائط الصحيح لتوزيع الجينومية بالنسبة للميزات الجينومية الموقع المستهدف.
    1. لذلك، لمدة 5 بي بي بتكرار الفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية-1، إنشاء ملف .bed مع شركة بريتيش بتروليوم المركزي تعويض من أناموقع ntegration من قبل اثنين من قواعد المصب لرسم الخرائط التكامل إلى زائد حبلا، وقاعدتين المنبع لرسم الخرائط التكامل لحبلا ناقص.
  2. للتحقق من عينة انتقال التلوث، وحساب عدد من المواقع التكامل المشتركة بين المكتبات المختلفة باستخدام BEDTools تتقاطع وظيفة لتتقاطع بي بي المركزي .bed الملفات لمدة عينات مختلفة وباتباع هذا الأمر:
    bedtools تتقاطع -a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1.00 -r -s> overlap1v2.txt
  3. حساب عدد خطوط داخل ملف الإخراج overlap1v2.txt من أجل تحديد العدد الدقيق للمواقع المشتركة بين المكتبتين باستخدام الأمر التالي:
    مرحاض -l overlap1v2.txt
  4. تحميل ملف .bed RefSeq الشرح لإصدار الجينوم المرجعية التي تم استخدامها لرسم خرائط الموقع التكامل من قاعدة بيانات UCSC الجينوم الشرح (على سبيل المثال http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database) 62.
    1. حساب عدد من المواقع التكامل التي تقع ضمن الجينات RefSeq باستخدام BEDTools تتقاطع وظيفة لتتقاطع الملف .bed زوج قاعدة المركزي التي تم إنشاؤها للعينة مع RefSeq .bed الملف التالي هذا الأمر:
      bedtools تتقاطع -a central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
  5. حساب عدد خطوط داخل ملف الإخراج RefSeq_sample1.bed من أجل تحديد العدد الدقيق للمواقع التي تقع في الجينات RefSeq باستخدام الأمر التالي:
    مرحاض -l RefSeq_sample1.bed
  6. كرر الخطوات من 9.3 و 9.4 لمواقع التكامل رسم الخرائط إلى أي شرح آخر من الفائدة التي فاصل .bed يتوفر الملف. تحميل الدليل السياسي الشامل ملف .bed الشرح أكثر الجزر الحالي للجينوم إشارة من الاهتمام من قاعدة البيانات UCSC الجينوم الشرح كما هو مشروح في الخطوة 9.4.
    1. حساب عدد من المواقع التكامل التي تقع ضمن دي معينموقف (موضح في هذا المثال هو نافذة 5 كيلو بايت) من الجزر الدليل السياسي الشامل باستخدام وظيفة BEDTools النافذة وبعد هذا الأمر:
      bedtools نافذة -w 2500 central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed
  7. حساب عدد خطوط داخل ملف الإخراج CpG_sample1.bed من أجل تحديد العدد الدقيق للمواقع التي تدخل في نطاق 2.5 كيلوبايت المنبع أو المصب من الجزر الدليل السياسي الشامل باستخدام الأمر التالي:
    مرحاض -l CpG_sample1.bed
  8. كرر الخطوات من 9.6 و 9.7 لمواقع التكامل رسم الخرائط TSSs قريب. توليد صيغة بديلة للملف RefSeq.bed، حيث ينسق الجينومية رسم الخرائط لأكثر من جين واحد قد تم تعديلها لتعكس فقط هدية جين واحد في هذا الموقف. هذا يمنع المبالغة في تقدير كثافة الجينات المحيطة مواقع التكامل. حساب كثافة الجينات في المنطقة ميجا بايت 1 المحيطة بكل موقع التكامل باستخدام الدالة BEDTools النافذة وبعد هذا الأمر:
  9. حساب متوسط ​​كثافة الجينات لجميع التكامل في مجموعة البيانات باتباع هذا الأمر:
    AWK '(المبلغ + = 7 $) END (المطبوعة "متوسط ​​=" مبلغ / NR) "GeneDensity_sample1.bed

10. قارن إحصائيا التكامل الموقع التوزيعات بين العينات عن طريق اثنين من الذيل اختبار دقيق فيشر والذيل اثنين من يلكوكسون الرتبة مجموع اختبار في R

ملاحظة: اختبار استخدام فيشر الدقيق لمقارنة نسبة المواقع التكامل داخل الجينات RefSeq أو ضمن إطار من الجزر الدليل السياسي الشامل أو TSSs، ولكن استخدام يلكوكسون رتبة اختبار مبلغ لمقارنة التوزيع في كثافة الجينات المحيطة مواقع التكامل. يتوفر برنامج R في http://www.r-project.org/.
اثنين من الذيل اختبار فيشر بالضبط:

  1. باستخدام الأرقام محسوبة وفقا للتعليمات في خطوات 9.4 و 9.7، كرeate المصفوفات لكل المقارنة في مجال البحث من الحوادث لاحظ (التكامل ضمن الشرح أو ضمن إطار المحيطة تعليق توضيحي) مقابل المتبقية المواقع عن طريق تتبع هذا الأمر:
    (annotation_of_interest <- مصفوفة (ج (SampleA # في، SampleA # المتبقي، SampleB # في، SampleB # المتبقي)، nrow = 2، dimnames = قائمة (ج ( 'المركز'، 'الباقي')، ج ( 'SampleA، "SampleB '))))
  2. حساب قيمة P للمقارنة من قبل ثنائي الطرف اختبار فيشر بالضبط مع الأمر التالي:
    fisher.test (annotation_of_interest، بديل = 'two.sided') $ p.value
    اثنين من الذيل اختبار Wilcoxon رتبة المبلغ:
  3. إنشاء ملف txt المفصول فيها كل عمود يحتوي على اسم عينة في الخلية الأولى، تليها أقل من القيم كثافة الجينات لجميع المواقع التكامل في تلك المكتبة (تم الحصول عليها من ملف .bed ولدت في الخطوة 9.9). استيراد هذا الملف txt المفصول إلى R باستخدام الأمر التالي وغvigating إلى الدليل الملف الصحيح:
    FILENAME <- as.data.frame (read.delim (file.choose ()، رأس = T، check.names = FALSE، وملء = TRUE، سبتمبر = ' ر'))
  4. حساب قيمة P للمقارنة من قبل اختبار Wilcoxon رتبة مبلغ ثنائي الطرف مع الأمر التالي:
    wilcox.test (FILENAME $ SampleA، FILENAME $ SampleB، = البديلة "two.sided"، وإرفاقها = F، بالضبط = T) $ p.value
    ملاحظة: يمكن حساب قيم P فقط لتصل إلى (منخفضة للغاية) حد معين في سيتم إرجاع بواسطة برنامج بعدها الصفر. للحصول على عينات مختلفة على نطاق واسع أن تسفر عن P = 0 في البحث، وتقدير قيمة ف ك <2.2 × 10 -308.

11. دراسة أولية البيانات التسلسل لدليل على توسع نسيلي من الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الفيروسي المتكاملة

ملاحظة: هناك إمكانية صغيرة لدمج أكثر من واحد في نفس الإقليم الشمالي المحدد في الجينوم المرجعية. بدلا من ذلك، واحدة فيقد يصبح الحدث tegration الحالي بوفرة في تسلسل البيانات نتيجة لاستخدام PCR خلال إعداد مكتبة و / أو عن طريق خلية الازدواجية قبل إعداد الحمض النووي. وقد تميز التحليلات الأخيرة من الحمض النووي الجيني من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية هذه الاحتمالات من خلال تحديد نقاط صوتنة القص / رابط مرفق فريدة من نوعها (والتي يمكن أن تنشأ إلا قبل PCR) ضمن تسلسل الحمض النووي التي تحتوي على مواقع التكامل متطابقة 52-54. حاليا هناك نقاش حول ما إذا كان proviruses آوى داخل الخلايا توسيع متطابق بسلالة تساهم في الخزان الفيروسي الكامنة، وبالتالي فإنه من الأهمية الخاصة للتميز مستواها من التوسع عند دراسة مواقع التكامل في المرضى من البشر.

  1. على غرار الإجراء المذكورة في الخطوة 8.1، إنشاء ملفات .bed إدراج فاصل من قواعد تمتد، في هذه الحالة، 25 الإقليم الشمالي المصب من كل موقع التكامل الفريد (قواعد المنبع ليست ضرورية هنا). إنشاء ملف FASTA من هذه الملفات .bed (كما أشرنا فيالخطوة 8.1) باستخدام وظيفة fastaFromBed من BEDTools وبعد هذا الأمر:
    fastaFromBed -فاي / الدليل / إلى / إشارة / الجينوم / -اسم -s -bed 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    ملاحظة: لتحسين خصوصية كل بحث فمن المستحسن لاستخراج لا يقل عن 25 الإقليم الشمالي المصب من كل موقع التكامل ليحلل التوسع نسيلي.
  2. ويفضل استخدام برنامج نصي حسب الطلب، بحث ملف FASTA تسلسل البيانات الخام لجميع السلاسل التي تحتوي على تطابق تام إلى 25 الإقليم الشمالي المصب من كل موقع التكامل فريدة من نوعها، وتودع هذه المتتاليات في ملف جديد. تقليم LTR وتسلسل رابط من السلاسل الخام. دمج سلسلة PE يقرأ عن طريق تحويل يقرأ لتكملة العكسي، وتقليم LTR ورابط متواليات، ومن ثم تعيين سلاسل read2 إلى زوج من read1 إذا تشترك في سلاسل لا يقل عن 20 متداخلة الإقليم الشمالي.
  3. مسح نقاط التعلق رابط كل كتلة موقع التكامل. تصنيف كل التكامل ب "توسيع متطابق بسلالة و# 34؛ إذا نقاط التعلق رابط هي ≥3 بي بي بعيدا.
    ملاحظة: يقرأ وقد وصفت بروتوكول للتحليل توسع نسيلي دون دمج تسلسل 52.
    ملاحظة: تجزئة من الجينوم في نفس المكان المحدد من قبل صوتنة يؤدي إلى التقليل من مدى توسع نسيلي، وأساليب لتصحيح وقد وصفت 63،64 التحيز التجريبي الناتج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الجدول 4 قوائم نتائج تجربة تمثيلية لتوضيح حساسية خ ع لاستعادة مواقع التكامل من ثقافة الخلايا المصابة. تم استخدام الحمض النووي الخلوي غير مصاب لتمييع متسلسل الحمض النووي الجيني من عدوى فيه كل خلية في المتوسط ​​تحتوي على التكامل واحد 40. تم إعداد التخفيفات في الخطوات من خمس إلى التخفيف إلى أقصى حد من 1: 15625. الحمض النووي الجيني في سلسلة المعايرة ثم تجزئة صوتنة أو عن طريق الهضم مع تقييد نوكلياز داخلي MseI وBglII، تليها LM-PCR. حسبت أعداد مواقع التكامل فريدة من نوعها، فضلا عن عدد من الأقرب خرائط المواقع لشروح الجينومية المحدد، وفقا لبروتوكول أعلاه. وكشف تحليل البيانات عشرات المواقع التكامل فريدة (1-2٪ من المبلغ المسترد من الحمض النووي الجيني أنيق) تعافى من المكتبات التي أعدت من الخلايا حيث في نظرية واحدة فقط في 15625 مصابا. عند تحليل مجموعات البيانات موقع التكامل، فمن الأهمية بمكان لمقارنة البيانات إلى مجموعة مطابقة من المواقع الجينومية عشوائية، وهو ما يسمى السيطرة العشوائية مطابقة أو MRC. كما المنفصمة نتائج تمثيلية الحمض النووي الجيني عن طريق تقييد انزيم الهضم أو صوتنة، شيدت مجموعتين من البيانات MRC مختلفة. MRC ENZ الواردة 50،000 المواقع الجينومية الفريدة التي تولدها اختيار عشوائي مواقع من hg19 في القرب من مواقع MseI وBglII تقييد انزيم الهضم، في حين ولدت MRC عشوائية آوى 10،000 المواقع دون تطبيع لمسافة من وضع علامات الجينوم. فقط المواقع التي يمكن تعيينها مرة أخرى إلى موقع الجيني فريد ينبغي أن تستخدم في مجموعات البيانات MRC. كما المقصات صوتنة الحمض النووي الجيني الحر أساسا من تسلسل التحيز، MRC عشوائي قد ينظر إليها على أنها أكثر قابلية للتطبيق على مجموعات البيانات التي تنتجها تفتيت الحمض النووي عن طريق صوتنة. أسلوب بديل للمراقبة التكامليمكن إنشاء موقع مجموعة البيانات في المختبر عن طريق تفاعل المؤتلف في البروتين، intasome مجمع البروتين النووي 21، أو بلدان جزر المحيط الهادئ المستخرجة من الخلايا المصابة تماما 17 مع الحمض النووي الجيني deproteinized، ثم بعد LM-PCR وخ ع البروتوكولات 21.

قيم P للمقارنة بين توزيع مواقع التكامل استردادها عن طريق صوتنة مقابل تقييد هضم (المقارنة بين عينات أنيق)، وكذلك للمقارنة إلى لجنة نهر الميكونج ENZ وMRC عشوائي، يتم عرضها في الشكل 2، وتوزيع مواقع التكامل استردادها وبعد صوتنة مماثلة لتلك استردادها عن طريق تقييد هضم انزيم لجميع الشروح فحصها، مع أكبر الفرق واضحا من حيث قربها من الجزر الدليل السياسي الشامل. كما اختلفت المتوقع 18،65 كلا قواعد البيانات بشكل ملحوظ من جمعية الصليب الأحمر من حيث التكامل ضمن الجينات RefSeq والجينات دensity المحيطة موقع متوسط ​​التكامل، في حين أن كل من مجموعات البيانات مماثلة لجمعية الصليب الأحمر من حيث التوزيع النسبي لجزر الدليل السياسي الشامل وTSSs. منذ قليل نسبيا HIV-1 مواقع التكامل خريطة على مسافة 2.5 كيلو بايت من جزيرة الدليل السياسي الشامل أو خدمات الدعم التقني، وزيادة العدد الإجمالي للمواقع تعافى من المرجح أن ينخفض ​​التغير التي يمكن أن تنشأ بين مجموعات البيانات (الجدول 4) والشكل (2). وتظهر الشعارات تسلسل لتأكيد صحة بيانات الموقع التكامل في الشكل (3). الاجماع HIV-1 موقع التكامل 14،22 (-3) المعنية بنقل البضائع الخطرة (G / V) TWA (C / B) CHA (+7) ( مكتوبة باستخدام الاتحاد الدولي للرموز قاعدة الكيمياء الحيوية، ومائل يشير إلى موقف vDNA زائد حبلا الانضمام، وتسطير يشير تسلسل 5-BP تكرار التالية HIV-1 التكامل وإصلاح الحمض النووي) هو واضح للمكتبات من قبل كل من تقنيات تجزئة أعد، على الرغم من أن درجة من اليقين تتناقص مع زيادة التخفيف من الخلية المصابةالحمض النووي. فشلت مواقع عشوائية الانحياز من مجموعة البيانات MRC على النقيض من ذلك لتوليد كميات كافية من تفضيلات قاعدة.

الشكل 1
الشكل 1: مخطط التدفق توضيحي من الاستعدادات مكتبة الموقع التكامل (أ) توليد مخزونات فيروس من قبل transfecting الخلايا HEK293T والحصاد وتصفية طاف بعد 48 ساعة، مع التركيز من قبل تنبيذ فائق، وإصابة الخلايا المستهدفة مع التركيز المناسب من الفيروس. خمسة أيام على الأقل بعد الإصابة، استخراج الحمض النووي الجيني. الرجوع إلى البندين 1 و 2 من النص الرئيسي للحصول على تفاصيل إضافية التجريبية. (B و C) جزء تنقية الحمض النووي الجيني عن طريق الهضم مع الانزيمات تقييد أو صوتنة. وينبغي أن تشمل كوكتيل انزيم تقييد انزيم (على سبيل المثال BglII) أن يشق مجرى النهر من المنبع LTR الفيروسي لمكافحة حدد لLM-PCR التضخيم من متواليات vDNA الداخلية. النجمة الخضراء والسهم تشعبت في (C) للدلالة على أن BglII ينبغي أن تطبق بعد ربط رابط. الضوء الأحمر تسلسل الفيروسي، في حين يبرز السوداء استضافة تسلسل الخلوي. يتم وضع علامة نقاط ضمني كسر الحمض النووي (لا لتوسيع نطاق) من خلال "اكس" يحتوي HIV-1 العديد من المواقع MseI وBglII. فقط يتم عرض تلك المتصلة البروتوكول. أقواس فوق خرائط للدلالة على المناطق الحمض النووي الخلوي U5 تضخيمها بشكل تفضيلي من قبل LM-PCR. (D) تنقية الحمض النووي مجزأة (ثم انهاء-إصلاح وA-الذيل في حالة صوتنة) وligate إلى (E) المتوافقة مع جزيئات رابط غير المتماثلة (اللون الأزرق). الدوائر الأرجوانى (D) تدل على موقع التكامل التي سيتم تضخيمها. العلامات النجمية على طرفي 3 'من خيوط قصيرة رابط دلالة الأمينية منع التعديلات. (F) إجراء الجولة الأولى من شبه متداخلة PCR باستخدام أول LTR التمهيدي الجولة (الحمراء)، والتمهيدي رابط (الأزرق). في تيجولة PCR له، التمهيدي رابط بترميز لتجميع الحمض النووي وخ ع التمهيدي متواليات (مجمعة على أنه ملحق الأخضر لالتمهيدي رابط الأزرق) ملزم، في حين أن التمهيدي LTR يفتقر إلى مثل هذه النتائج. (G) تنقية الجولة الاولى المنتج PCR وإجراء الجولة الثانية من شبه متداخلة PCR. في هذه الجولة من PCR، استخدام نفس رابط التمهيدي كما هو الحال في الجولة الأولى (أزرق + ملحق الأخضر)، جنبا إلى جنب مع الثاني التمهيدي الجولة LTR (الأحمر) الذي يحمل تجميع الحمض النووي وخ ع تسلسل ملزمة التمهيدي وكذلك الباركود لمضاعفة ( تجميعها على النحو أطرافهم الأخضر لالتمهيدي LTR الأحمر). (H) تنقية الدور الثاني منتج PCR كمكتبة موقع التكامل النهائية (محاصر في أرجواني، مع موقع التكامل تميزت دائرة أرجواني). إرسال قسامة إلى مرفق التسلسل لمراقبة الجودة وخ ع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وترد القيم P للمقارنة بين مواقع التكامل أسهب في أعقاب الحمض النووي تجزئة من قبل صوتنة أو تقييد انزيم الهضم مقابل جمعية الصليب الأحمر الخاصة بكل أرقام من مواقع التكامل داخل الجينات RefSeq والجزر الدليل السياسي الشامل القريبة وTSSs، فضلا عن ملفات إقليمية كثافة الجينات، في: الرقم 2. الجدول 4 القيم ف ≥0.05 وبالخط العريض والمائل والقيم ف حساب قبل الاختبار ب ف القيم بالضبط فيشر تحسب اختبار Wilcoxon رتبة المبلغ ج MRC ENZ:... المتطابقة السيطرة عشوائية؛ وقد أنتج مجموعة من 50،000 موقع التكامل فريدة من نوعها من خلال اختيار عشوائي مواقع في القرب من مواقع تقييد MseI / BglII في الزئبق بناء 19. د MRC عشوائي: يقابل السيطرة العشوائية التي تحتوي على 10000 مواقع التكامل الفريدة التي تنتجها selecti عشوائيامواقف نانوغرام في hg19 دون تطبيع لقرب الموقع قيود. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تسلسل شعارات تصور HIV-1 تفضيلات قاعدة من المكتبات تجربة تمثيلية مواقع التكامل من المكتبات التي كتبها (A) الهضم مع الانزيمات تقييد أو (ب) صوتنة إعداد والانحياز باستخدام برنامج WebLogo. ويصور كل تخفيف في سلسلة المعايرة، من الحمض النووي أنيق في الجزء العلوي من الشكل إلى تخفيف الحد الأقصى من 1: 15،625 في القاع. شعار (C) تسلسل لجنة نهر الميكونج من 50،000 المواقع الجينومية فريدة من نوعها. أشرطة الخطأ تمثل أساسا الانحراف المعياري في تأسيس قاعدة في أي موقف معين. وبشكل أكثر تحديدا، رارتفاع املجموع من كل شريط خطأ ما يعادل ضعف عينة تصحيح صغير 66، التي تسيطر على التقليل من الكون موجود في مجموعات البيانات الصغيرة نسبيا. يمثل محور س الخلية المضيفة الجينوم مواقف الحمض النووي الشمالي نسبة إلى موقع التكامل في نقطة الصفر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: جولة التمهيدي قليل النوكليوتيد متواليات لبناء رابط وPCR التضخيم رابط محددة والثانية LTR ترميز الحمض النووي تسلسل محول المجموعات، وهي على النحو التالي مرمزة: أسود، قواعد مكملة لرابط أو إلى HIV-1 LTR. الأحمر، فهرس فريد أو الباركود. الأخضر، والتسلسل التمهيدي مواقع الربط. الزرقاء، متواليات محول لتجميع الحمض النووي. واحدة نهاية (SE) التسلسل الجرميةسوف ctions الاستفادة من التمهيدي تسلسل أن anneals إلى الجولة LTR التمهيدي read1 (الأخضر) تسلسل الثاني، في حين يقترن نهاية (PE) ردود الفعل سوف تستخدم على حد سواء (read1 وread2) الاشعال التسلسل. ورابط خيوط قصيرة تحتوي على 3 "الأمينية منع التعديل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

كاشف إضافة في رد الفعل
الأول التمهيدي جولة LTR (15 ميكرومتر): 2.5 ميكرولتر
رابط معين التمهيدي (15 ميكرومتر): 0.5 ميكرولتر
العازلة 10X PCR: 2.5 ميكرولتر
dNTPs (2.5 ملم لكل منهما) 0.5 ميكرولتر
الحمض النووي مزيج البلمرة: 0.5 ميكرولتر
رد فعل الربط: 100 نانوغرام
Nuclease خالية من المياه: ما يصل إلى 25 ميكرولتر

. التي يمكن ان تضاف وصفة لأول جولة PCR مبلغ كل الكاشف المحدد لتتم الإشارة إلى كل أنبوب PCR الفردية: الجدول 2.

كاشف إضافة في رد الفعل
التمهيدي جولة LTR الثاني (15 ميكرومتر): 2.5 ميكرولتر
رابط معين التمهيدي (15 ميكرومتر): 0.5 ميكرولتر
العازلة 10X PCR: 2.5 ميكرولتر
dNTPs (2.5 ملم لكل منهما) 0.5 ميكرولتر
الحمض النووي مزيج البلمرة: 0.5 ميكرولتر
أول PCR الجولة: 100 نانوغرام
Nuclease خالية من المياه: ما يصل إلى 25 ميكرولتر

الجدول 3: الجولة الثانية PCR وصفة مبلغ كل كاشف تضاف إلى كل أنبوب PCR هو مبين.

<td> دايجست، 1: 125
مكتبة مواقع #Unique ٪ RefSeq ل ٪ الدليل السياسي الشامل +/- 2.5 كيلوبايت ب ٪ TSS +/- 2.5 كيلوبايت ج متوسط الجينات الكثافة +/- 500 كيلوبايت د
صوتنة، أنيق 3169 71.2 5.1 3.7 15.8
صوتنة، 1: 5 366 75.1 2.7 3 16.3
254 74 7.1 5.1 16.7
صوتنة، 1: 125 430 69.8 6.9 6 14.6
صوتنة، 1: 625 314 65.6 5.6 6.7 13.5
صوتنة، 1: 3125 116 73.6 3.5 2.5 13.1
صوتنة، 1: 15625 72 62.5 0 1.4 14.7
دايجست، أنيق 7428 69.8 3.6 2.9 15.2
دايجست، 1: 5 1460 71.4 4.4 3.4 14.9
دايجست، 01:25 394 68.8 4.3 3.3 15.8
172 71 0 3 14
دايجست، 1: 625 134 73.9 3.7 3.7 14.1
دايجست، 1: 3125 100 83.1 6.4 5.2 19.1
دايجست، 1: 15625 73 74 4.1 1.4 9.7
MRC ENZ ه 50000 44.7 4.2 4 8.7
MRC و العشوائية 10000 41.3 5.3 4.2 8.6

الجدول 4: توزيع الجينوم من مواقع التكامل من الممثل المعايرة سلسلة نسبة من إجمالي المواقع التكامل عشر.في الخريف ضمن الجينات RefSeq، ب مسافة 2.5 كيلو من الجزر الدليل السياسي الشامل، ومئوية في غضون 2.5 كيلوبايت من TSSs د كثافة الجينات داخل 1 ميغابايت المحيطة متوسط ​​موقع التكامل الإلكتروني MRC ENZ:. المتطابقة السيطرة عشوائية؛ وقد أنتج مجموعة من 50،000 موقع التكامل فريدة من نوعها من خلال اختيار عشوائي مواقع في القرب من مواقع تقييد MseI / BglII في hg19 و MRC عشوائية: السيطرة العشوائية المتطابقة التي تحتوي على 10000 مواقع التكامل الفريدة التي تنتجها اختيار عشوائي مواقع في hg19 دون تطبيع للمواقع ثابتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بروتوكول لتحليل مواقع التكامل فيروسات، من الخطوة عدوى فيروس الأولية من خلال رسم خرائط لأنماط توزيع الجينومية، وصفت. هذا البروتوكول ينطبق على أي الارتجاعي وأي نوع من الخلايا مصابة. وعلاوة على ذلك، فإن خط الأنابيب فحص حساس جدا، مع القدرة على استعادة عدد كاف من مواقع التكامل فريدة من التخفيفات المسلسل يعادل الحمض النووي الجيني إلى أن عدوى بدأت مع وزارة الداخلية من 6.4 × 10 -5. هذه الحساسية يجعل بروتوكول مفيدة بشكل خاص عند تطبيقه على عينات من المرضى المصابين التي قد تحتوي على الحمل الفيروسي منخفضة، حيث لا يوجد سوى جزء صغير من الخلايا والمرفأ وطليعة الفيروس متكاملة. وتمشيا مع أوراق المنهجية السابقة في هذا المجال 36،38،41-43، وخطوات متعددة في الجزء المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول الاستفادة من تطوير البرامج النصية المخصصة لمعالجة الملفات الكبيرة من البيانات التسلسل. في حين BLAT 58 هو أماهpping فائدة الموصوفة في هذا البروتوكول، يمكن للمستخدمين العثور على ربطة 67 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) ليكون البديل المناسب.

وذكر خط أنابيب المعلوماتية الحيوية البديل مؤخرا لتحديد مولوني الفئران فيروس اللوكيميا (MoMLV) مواقع التكامل 19. هذا الخط هو مفيد في هذا أنها وضعت في برنامج مستقل غير متاحة للجمهور، وهي قوية جدا في ذلك انه كان يستخدم في الأصل لخريطة مئات الآلاف من المواقع التكامل MoMLV فريدة من نوعها. ومع ذلك، تم تصميم البرمجيات المتاحة أصلا لوجه التحديد إعادة تحليل وMoMLV بيانات عنها، وحتى إعادة برمجة سيكون من الضروري تخصيص خط أنابيب بالتناوب تصاميم تجريبية (وظيفة الأداة وتوسعت مؤخرا لتشمل فيروس الغدة المرتبطة وTol2 و ميلان / التاءات ينقول ناقلات 68). وعلاوة على ذلك، ووصف ذلك البروتوكول الجيل من موقع التكامل الأولي .bedملف، لكنها لم تضع من الخطوات المحددة اللازمة لمواقع الخريطة لصلة بالموضوع الشروح الجينوم. القراء قد تجد "ناقلات التكامل تحليل الموقع" الخادم 69، الذي صدر خلال استعراض مخطوطة الحالية، من المفيد تحليل تسلسل خ ع إنشاؤها باستخدام بروتوكول صفها هنا.

وينبغي التأكيد على بعض النقاط عند استخدام أي بروتوكول لتحليل فيروس قواعد البيانات موقع التكامل. عند إعداد مكتبات متعددة جنبا إلى جنب، وجود إمكانية كبيرة لعينة انتقال التلوث. حتى على مستوى صغير جدا من عينة الحديث المتبادل يمكن أن تحجب النتائج على مستوى تقديم شوط خ ع و غير صالحة للاستعمال. ولذلك، ينبغي الانتهاء من جميع أعمال الرطب مقعد في تعقيمها، مكرسة غطاء تدفق الصفحي أو PCR محطة العمل. وهناك مجموعة من الماصات والكواشف مثل nuclease خالية من المياه يجب أن تكون مخصصة فقط لتضخيم موقع التكامل. استخدام linkers فريدة لكل إعداد مكتبة يمكن أن تحد من إمكاناتلعبر والتضخيم، وتسمح أيضا لتحديد كروس يقرأ في كل مكتبة في ملفات FASTA الخام.

ومن المهم النظر في إيجابيات وسلبيات استخدام صوتنة مقابل تقييد نوكلياز داخلية الهضم إلى تفتيت الحمض النووي الجيني. من ناحية، ويوفر صوتنة توزيع عشوائي نسبيا من النقاط القص، ولكن المطلوب في وقت لاحق إصلاح الحمض النووي وA-المخلفات خطوات تقلل باستمرار العائد من المنتجات ربط رابط بالمقارنة مع عملية ربط تنفيذها مع نهايات لزجة ولدت انزيم قيود. من ناحية أخرى، يوفر الانزيم تقييد الهضم يبلغ عدد سكانها أقل المصروفة من نقاط القص، والذي سوف يعرض دائما بعض التحيز في البيانات المستردة. الاستفادة من نوكلياز داخلية تقييد لتجاهل تسلسل LTR المنبع وفي كلتا الحالتين (الشكل 1) يؤدي إلى فقدان جزء صغير من المواقع التكامل التي تقع المنبع من هذا الموقع في الجينوم. أي بيانات التحيز التي قد تنجم يمكن أن يكون الإعلانيرتدي بحذف الهضم الأنزيمي من البروتوكول خلال إعداد مكتبة وتصفية وافر من الناتج تسلسل LTR المنبع من تسلسل البيانات.

على الرغم من أن البروتوكول الحالي حساس جدا وقادر على توليد الملايين من المواقع التكامل فريدة 21،40، فقط حوالي ثلث جميع التكامل المتاحة قد يكون من المتوقع أن يتم تضخيمه في تجربة معينة حتى مع أفضل مكتبة الاستعدادات (المرجع 70. والملاحظات غير منشورة). هذا يمكن أن يسبب مضاعفات عند تحليل عينات من الالتهابات وزارة الداخلية منخفضة أو المرضى التي تأوي انخفاض الحمل الفيروسي. هذا القيد يمكن التغلب جزئيا تسلسل مرارا وتكرارا نفس إعداد مكتبة و / أو تسلسل مكتبات متعددة مشتقة من نفس عينة من الحمض النووي في نفس الوقت. والزيادات المستقبلية في حساسية الفحص وفقا لذلك أن يكون مفيدا جدا لتطبيقات متعدية تعزيز من فيروسات موقع التكامل التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لزملائنا ستيفن هيوز وهنري ليفين للحصول على المشورة التي كانت حاسمة لوضع بروتوكول NGS للفيروسات موقع التكامل التسلسل في المختبر Engelman. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح AI039394 وAI052014 (لمتفجرات نترات الأمونيوم) وAI060354 (مركز جامعة هارفارد للأبحاث الإيدز).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 11965-084 Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH 30088.03 Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-Cl Antibiotics to be added to DMEM
Phosphate-Buffered saline Mediatech 21-040-CV Used to wash cells
Trypsin EDTA Corning 25-053-CI Used to detach adherent cells from tissue culture plates
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688 DNA transfection reagent
0.45 µm Filters Thermo Scientific 09-740-35B Used to filter virus particle-containing cell culture media
Turbo DNase Ambion AM2239 Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay ABL Inc. 5447 Used to quantify yield of virus production
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 Used to purify genomic DNA from cells
Sonicator Covaris S2 With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec
Nuclease-Free Water GeneMate G-3250-125 Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Used to purify DNA during library construction
End-It DNA End-Repair Kit Epicentre ER81050 Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples
Klenow Fragment (3'-5' exo–) New England Biolabs (NEB) M0212S Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments
dATP Thermo Scientific R0141 Deoxyadenosine triphosphate
MseI NEB R0525L Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage
BglII NEB R0144L Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence
T4 DNA Ligase NEB M0202L/6218 Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends
DNA Oligonucleotides Integrated DNA Technologies custom Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs 
Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 639202 Commercial mix containing DNA polymerase for PCR
dNTPs (100 mM solutions) Thermo Scientific R0181 Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP
NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometer for determination of DNA concentration
Qubit Fluorimeter Life Technologies Qubit® 3.0 Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration
2200 TapeStation System Agilent G2964AA Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution
MiSeq Illumina SY-410-1003 Used for NGS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890 (2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464, 232-236 (2010).
  4. Hare, S., Maertens, G. N., Cherepanov, P. 3'-processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo. EMBO J. 31, 3020-3028 (2012).
  5. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54, 497-504 (1988).
  6. Roth, M. J., Schwartzberg, P. L., Goff, S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence. Cell. 58, 47-54 (1989).
  7. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Retroviral integration: structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2525-2529 (1989).
  8. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179, 886-889 (1990).
  9. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3, 469-478 (1989).
  10. Bukrinsky, M. I., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6580-6584 (1992).
  11. Miller, M. D., Farnet, C. M., Bushman, F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390 (1997).
  12. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  13. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468, 326-329 (2010).
  14. Holman, A. G., Coffin, J. M. Symmetrical base preferences surrounding HIV-1, avian sarcoma/leukosis virus, and murine leukemia virus integration sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6103-6107 (2005).
  15. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M., Munroe, D. J. Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J. Virol. 79, 5211-5214 (2005).
  16. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42, 10209-10225 (2014).
  17. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  18. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  19. LaFave, M. C., et al. MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42, 4257-4269 (2014).
  20. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J. Virol. 88, 4504-4513 (2014).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523, 366-369 (2015).
  22. Serrao, E., et al. Integrase residues that determine nucleotide preferences at sites of HIV-1 integration: implications for the mechanism of target DNA binding. Nucleic Acids Res. 42, 5164-5176 (2014).
  23. Aiyer, S., et al. Structural and sequencing analysis of local target DNA recognition by MLV integrase. Nucleic Acids Res. 43, 5647-5663 (2015).
  24. Ciuffi, A., et al. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat. Med. 11, 1287-1289 (2005).
  25. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12036-12041 (2013).
  26. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J. Virol. 87, 12721-12736 (2013).
  27. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell Rep. 5, 886-894 (2013).
  28. Demeulemeester, J., et al. HIV-1 integrase variants retarget viral integration and are associated with disease progression in a chronic infection cohort. Cell Host Microbe. 16, 651-662 (2014).
  29. Meehan, A. M., et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog. 5, e1000522 (2009).
  30. Ferris, A. L., et al. Lens epithelium-derived growth factor fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3135-3140 (2010).
  31. Gijsbers, R., et al. LEDGF hybrids efficiently retarget lentiviral integration into heterochromatin. Mol. Ther. 18, 552-560 (2010).
  32. Aiyer, S., et al. Altering murine leukemia virus integration through disruption of the integrase and BET protein family interaction. Nucleic Acids Res. 42, 5917-5928 (2014).
  33. Jahner, D., Jaenisch, R. Integration of Moloney leukaemia virus into the germ line of mice: correlation between site of integration and virus activation. Nature. 287, 456-458 (1980).
  34. Stevens, S. W., Griffith, J. D. Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5557-5561 (1994).
  35. Wang, G. P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C. C., Bushman, F. D. HIV integration site selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic modifications. Genome Res. 17, 1186-1194 (2007).
  36. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. 36, e49 (2008).
  37. Roth, S. L., Malani, N., Bushman, F. D. Gammaretroviral integration into nucleosomal target DNA in vivo. J. Virol. 85, 7393-7401 (2011).
  38. Ciuffi, A., Barr, S. D. Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA. Methods. 53, 39-46 (2011).
  39. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117, 3113-3122 (2011).
  40. Matreyek, K. A., et al. Host and viral determinants for MxB restriction of HIV-1 infection. Retrovirology. 11, 90 (2014).
  41. Ciuffi, A., et al. Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes. Methods. 47, 261-268 (2009).
  42. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39, e72 (2011).
  43. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol. Biol. 1185, 321-344 (2014).
  44. Page, K. A., Landau, N. R., Littman, D. R. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270-5276 (1990).
  45. Emi, N., Friedmann, T., Yee, J. K. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65, 1202-1207 (1991).
  46. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  47. Goff, S., Traktman, P., Baltimore, D. Isolation and properties of Moloney murine leukemia virus mutants: use of a rapid assay for release of virion reverse transcriptase. J. Virol. 38, 239-248 (1981).
  48. Willey, R. L., et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of the human immunodeficiency virus that is critical for infectivity. J. Virol. 62, 139-147 (1988).
  49. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  50. Brussel, A., Sonigo, P. Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77, 10119-10124 (2003).
  51. Serrao, E., Ballandras-Colas, A., Cherepanov, P., Maertens, G. N., Engelman, A. N. Key determinants of target DNA recognition by retroviral intasomes. Retrovirology. 12, 39 (2015).
  52. Maldarelli, F., et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345, 179-183 (2014).
  53. Wagner, T. A., et al. HIV latency. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345, 570-573 (2014).
  54. Cohn, L. B., et al. HIV-1 integration landscape during latent and active infection. Cell. 160, 420-432 (2015).
  55. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the QubitTM RNA HS assay using RNA spike-in. BMC Mol. Biol. 16, 9 (2015).
  56. Padmanaban, A., Walker, D. M. Analysis of high molecular weight genomic DNA using the Agilent 2200 TapeStation and genomic DNA ScreenTape. Publication number 5991-1797EN Agilent Technologies. Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA. (2013).
  57. Kapa library quantification technical guide version v1.14. KapaBiosystems. Boston, MA. (2014).
  58. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 12, 656-664 (2002).
  59. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  60. Gaur, M., Leavitt, A. D. Mutations in the human immunodeficiency virus type 1 integrase D,D(35)E motif do not eliminate provirus formation. J. Virol. 72, 4678-4685 (1998).
  61. Varadarajan, J., McWilliams, M. J., Hughes, S. H. Treatment with suboptimal doses of raltegravir leads to aberrant HIV-1 integrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 14747-14752 (2013).
  62. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, 996-1006 (2002).
  63. Berry, C. C., et al. Estimating abundances of retroviral insertion sites from DNA fragment length data. Bioinformatics. 28, 755-762 (2012).
  64. Firouzi, S., et al. Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites. Genomic Med. 6, 46 (2014).
  65. Mitchell, R. S., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2, E234 (2004).
  66. Schneider, T. D., Stormo, G. D., Gold, L., Ehrenfeucht, A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 188, 415-431 (1986).
  67. Langmead, B. Chapter 11, Unit 11. 17, Aligning sort sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics. (2010).
  68. LaFave, M. C., Varshney, G. K., Burgess, S. M. GeIST: a pipeline for mapping integrated DNA elements. Bioinformatics. 31, 3219-3221 (2015).
  69. Hocum, J. D., et al. VISA - Vector Integration Site Analysis server: a web-based server to rapidly identify retroviral integration sites from next-generation sequencing. BMC Bioinformatics. 16, 212 (2015).
  70. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15, 1431-1436 (2009).
  71. TruSeq Library Prep Pooling Guide. Guidelines for pooling TruSeq libraries for Illumina sequencing systems that require balanced index combinations. Source: https://support.illumina.com/downloads/truseq-library-prep-pooling-guide-15042173.html (2015).
التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Serrao, E., Cherepanov, P., Engelman, A. N. Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (109), e53840, doi:10.3791/53840 (2016).More

Serrao, E., Cherepanov, P., Engelman, A. N. Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (109), e53840, doi:10.3791/53840 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter