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Biology

रेट्रोवायरल एकता स्थलों की प्रवर्धन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और जीनोमिक डीएनए का मिलान

Published: March 22, 2016 doi: 10.3791/53840

Abstract

दोनों को स्थानीय और वैश्विक पैमाने पर रेट्रोवायरस प्रदर्शनी हस्ताक्षर एकीकरण वरीयताओं। यहाँ, हम (1) बंधाव की मध्यस्थता पीसीआर (एलएम पीसीआर) प्रवर्धन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) का उपयोग रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों की विभिन्न पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, (2) प्रत्येक वायरस के जीनोमिक स्थान मानचित्रण पेश BEDTools का उपयोग कर जंक्शन, और (3) सांख्यिकीय प्रासंगिकता के लिए डेटा का विश्लेषण करने की मेजबानी। जीनोमिक डीएनए संक्रमित कोशिकाओं से निकाले गए प्रतिबंध एंजाइमों के साथ या sonication द्वारा पाचन द्वारा खंडित है। उपयुक्त डीएनए अंत मरम्मत के बाद, डबल असहाय linkers ligated हैं पर डीएनए समाप्त होता है, और अर्द्ध नेस्टेड पीसीआर वायरस के दोनों लंबे टर्मिनल दोहराने (लीटर) अंत और ligated लिंकर डीएनए के पूरक प्राइमरों का उपयोग किया जाता है। पीसीआर प्राइमरों NGS के दौरान डीएनए क्लस्टरिंग के लिए आवश्यक दृश्यों ले, अलग अनुकूलक बंधाव के लिए आवश्यकता को नकार। गुणवत्ता नियंत्रण (QC) में डीएनए टुकड़ा आकार के वितरण का आकलन और अनुकूल करने के लिए आयोजित किया जाता हैएर डीएनए समावेश NGS से पहले। अनुक्रम आउटपुट फाइल लीटर युक्त पढ़ता के लिए छान रहे हैं, और लीटर और लिंकर परिभाषित दृश्यों दूर उत्पन्न होते हैं। छंटनी की मेजबान सेल दृश्यों BLAT का उपयोग कर एक संदर्भ जीनोम मैप किए गए हैं और संदर्भ के जीनोम में एक अनूठी बात करने के लिए न्यूनतम 97% पहचान के लिए छान रहे हैं। अनोखा एकीकरण साइटों विभिन्न जीनोमिक सुविधाओं से सटे न्यूक्लियोटाइड (एनटी) अनुक्रम और वितरण रिश्तेदार के लिए छानबीन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग, उच्च जटिलता के एकीकरण साइट पुस्तकालयों तीन दिनों में जीनोमिक डीएनए से निर्माण किया जा सकता है। पूरे प्रोटोकॉल है कि एकीकरण साइट विश्लेषण करने के लिए अतिसंवेदनशील टिशू कल्चर कोशिकाओं के बहिर्जात वायरल संक्रमण शामिल हैं इसलिए लगभग एक से दो सप्ताह में आयोजित किया जा सकता है। इस प्रौद्योगिकी के हाल के अनुप्रयोगों एचआईवी संक्रमित रोगियों से एकीकरण साइटों के अनुदैर्ध्य विश्लेषण से संबंधित हैं।

Introduction

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वायरल डीएनए (vDNA) मेजबान सेल जीनोम में की एकता रेट्रोवायरल जीवन चक्र में एक आवश्यक कदम है। एकता वायरल एंजाइम इंटिग्रेस (IN), दो अलग उत्प्रेरक प्रक्रियाओं है कि स्थिरतापूर्वक डाला provirus 1 की स्थापना करने के लिए नेतृत्व के बाहर किया जाता है जिसके द्वारा पूरा किया है। सब यूनिटों में रेखीय vDNA कि रिवर्स प्रतिलेखन के माध्यम से उत्पन्न होता है की छोर संलग्न, एक में multimer 2-4 से एक साथ आयोजित समाप्त होता है vDNA साथ उच्च आदेश intasome के गठन। Cleaves में के रूप में 3'-प्रसंस्करण में जाना प्रक्रिया में दृश्यों 3 'vDNA अपरिवर्तनीय 5'-CA-3 से नीचे की ओर की छोर', recessed 3 'प्रत्येक vDNA टर्मिनस 5-8 से प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ समाप्त होता है छोड़कर। Intasome बाद में मेजबान की एक बड़ी विधानसभा का हिस्सा है और वायरल preintegration जटिल (पीआईसी) 9-11 रूप में जाना जाता प्रोटीन के रूप में नाभिक में आयात किया जाता है। सेलुलर लक्ष्य डीएनए (tDNA) का सामना करने के बाद, में vDNA 3'-हाइड्रॉक्सिल gro का उपयोग करता हैउतार tDNA ऊपर और एक कंपित फैशन में नीचे किस्में फोड़ना और एक साथ कतरा हस्तांतरण 12,13 की प्रक्रिया के माध्यम tDNA 5 'फॉस्फेट समूहों को vDNA मिलती है।

स्थानीय और वैश्विक पैमाने पर रेट्रोवायरस प्रदर्शनी एकीकरण साइट प्राथमिकताएं। स्थानीय स्तर पर, आम सहमति के एकीकरण साइटों दुर्बलता से संरक्षित मुरजबंध संबंधी tDNA दृश्यों कि लगभग पांच से दस vDNA प्रविष्टि साइटों 14,15 से बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम करने से अवधि से मिलकर बनता है। विश्व स्तर पर, रेट्रोवायरस विशिष्ट क्रोमेटिन एनोटेशन 16 लक्ष्य। के माध्यम से एप्सिलॉन, Lenti, और spuma अल्फा - सात विभिन्न रेट्रोवायरल पीढ़ी रहे हैं। Lentiviruses है, जो एचआईवी -1 में शामिल हैं, जबकि gammaretroviruses preferentially ट्रांसक्रिप्शनल प्रारंभ साइटों (TSSs) और सक्रिय बढ़ाने क्षेत्रों 18-20 में एकीकृत, सक्रिय रूप से लिखित जीन 17 से शरीर के भीतर एकीकरण के पक्ष में। इसके विपरीत, spumavirus जोरदार heterochrom ओर झुका हुआ हैइस तरह के जीन-गरीब पटल जुड़े डोमेन के 21 के रूप में atic क्षेत्रों,। स्थानीय tDNA आधार वरीयताओं में और tDNA 13,22,23 के बीच nucleoprotein संपर्कों के विशिष्ट नेटवर्क से तय बड़े हिस्से में हैं। Lentiviruses और gammaretroviruses के लिए, जीनोमिक एनोटेशन के लिए एकीकरण के सापेक्ष में और आत्मीय सेलुलर कारकों 24-27 के बीच बातचीत द्वारा शासित बड़े हिस्से में है। IN-tDNA बातचीत नेटवर्क 13,22,23,28 की बारीकियों में फेरबदल और खलल न डालें या फिर इंजीनियरिंग में मेजबान कारक बातचीत 25-27,29-32 रणनीतियों साबित कर रहे हैं क्रमशः, स्थानीय और वैश्विक स्तर पर एकीकरण retarget करने के लिए।

डीएनए अनुक्रमण रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों सूची को इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं की शक्ति पिछले दशकों में काफी बढ़ गई है। एकता साइटों श्रमसाध्य शुद्धि और मैनुअल क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर अध्ययन 33,34 प्रति अद्वितीय साइटों का सिर्फ एक मुट्ठी उपज के लिए अग्रणी काम में बरामद किए गए।हजारों 17 के लिए कई सौ करने के लिए बढ़ रही है बहिर्जात टिशू कल्चर सेल संक्रमण से बरामद साइटों की संख्या के साथ मैदान में तब्दील मानव और माउस मसौदा जीनोम के लिए अलग-अलग एकीकरण साइटों नक्शा करने के लिए, की क्षमता के साथ लीटर मेजबान डीएनए जंक्शनों के एलएम पीसीआर प्रवर्धन का संयोजन 18। NGS पद्धति के साथ एलएम पीसीआर की और अधिक हाल के संयोजन पुस्तकालय गहराई आसमान छू भेजा है। विशेष रूप से, pyrosequencing, अद्वितीय एकीकरण साइटों 30,35-38 के हजारों के दसियों के आदेश पर सामने आए, जबकि पुस्तकालयों डीएनए क्लस्टरिंग के उपयोग के माध्यम अनुक्रम अद्वितीय दृश्यों 19-21,39 के लाखों लोगों की प्राप्ति कर सकते हैं। यहाँ हम amplifying और डीएनए क्लस्टरिंग NGS का उपयोग कर रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों क्रमबद्ध करने के लिए एक अनुकूलित एलएम पीसीआर प्रोटोकॉल का वर्णन। विधि प्रवर्धित डीएनए अणु में पीसीआर प्राइमरों में एडाप्टर दृश्यों की आवश्यकता है और इसलिए सीधे को शामिल किया जिससे एक अतिरिक्त एडाप्टर बंधाव कदम sequen से पहले के लिए आवश्यकता precluding40 cing। bioinformatic विश्लेषण पाइपलाइन, अद्वितीय एकीकरण साइटों की मैपिंग जीनोमिक सुविधाओं उचित करने के लिए लीटर मेजबान डीएनए जंक्शनों के लिए कच्चे अनुक्रमण डेटा की पार्स करने से भी आम तौर पर वर्णित है। पूर्वता इस क्षेत्र 36,38,41-43 में पूर्व पद्धति प्रोटोकॉल से स्थापित के अनुसार, कस्टम स्क्रिप्ट जैव सूचना विज्ञान पाइप लाइन में विशेष कदम के पूरा होने सहायता करने के लिए विकसित किया जा सकता है। उपयोगिता और प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता, amplifying अनुक्रमण, और मानचित्रण संक्रमण की अनुमानित बहुलता 1.0 (MOI), साथ ही यह डीएनए के एक अनुमापन श्रृंखला में संक्रमित ऊतक संस्कृति कोशिकाओं से एचआईवी -1 एकीकरण साइटों द्वारा प्रतिनिधि डेटा के साथ सचित्र है 1 के एक अधिकतम कमजोर पड़ने के लिए कदम गुना 5 में असंक्रमित सेलुलर डीएनए के माध्यम से पतला: 15,625 6.4 x 10 -5 की अनुमानित बराबर MOI उपज के लिए।

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Protocol

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1. वायरस स्टॉक्स उत्पन्न

नोट: इस प्रोटोकॉल के गीला बेंच पहलू का प्रवाह चार्ट चित्रा 1 में दिखाया गया है वायरल शेयर उत्पादन और टिशू कल्चर कोशिकाओं के बाद संक्रमण का ब्यौरा आम तौर पर रेट्रोवायरस के विभिन्न प्रकार के लिए लागू होगी।। कुछ प्रयोगों के लिए, लक्ष्य सेल अंतर्जात वायरल रिसेप्टर (ओं) को व्यक्त नहीं कर सकता है, और इस तरह के मामलों में छद्म रेट्रोवायरल heterologous वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन को शरण देने के कणों का निर्माण, जैसे vesicular stomatitis वायरस (VSV जी) से जी ग्लाइकोप्रोटीन हो जाएगा संक्रमण 44,45 लिए जरूरी है।

नोट: एहतियात लिया जाना चाहिए जब एचआईवी -1 के साथ काम कर रहे। हालांकि विशेष दिशा निर्देश संस्था से संस्था के लिए अलग-अलग होगा, सभी वायरस के आधार पर काम एक समर्पित, ऑपरेटर प्रतिबंधित जैविक सुरक्षा कैबिनेट (आमतौर पर एक टिशू कल्चर हुड के रूप में) में आयोजित किया जाना चाहिए। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणउस चेहरे संरक्षण, जूते शामिल हैं, एक डबल दस्ताने परत, और एक पूरे शरीर coverall सूट हर समय पहना जाना चाहिए शामिल है। वायरस से संबंधित प्रयोगों से उत्पन्न सभी तरल अपशिष्ट ब्लीच (10% अंतिम एकाग्रता) के साथ निष्क्रिय किया जाना चाहिए, और ठोस सहित सभी अपशिष्ट निपटान से पहले autoclaved किया जाना चाहिए।

  1. एक दिन अभिकर्मक के लिए पहले, थाली 3.3 x 10 6 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 10 मिलीलीटर में HEK293T कोशिकाओं 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% के साथ पूरक (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / पांच 100 मिमी बर्तन में से प्रत्येक में मिलीलीटर शेयर)।
    नोट: पूरक-DMEM के रूप में DMEM-एफपीएस इस बात से पर जाना जाता है।
  2. बाद में दिन पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मकों या कैल्शियम फास्फेट का उपयोग कर एक VSV जी अभिव्यक्ति का निर्माण की 1 ग्राम के साथ पूर्ण लंबाई रेट्रोवायरल आणविक क्लोन ले जाने प्लाज्मिड के 10 माइक्रोग्राम या 9 माइक्रोग्राम लिफाफा हटाए एकल दौर वैक्टर के साथ कोशिकाओं transfect।
    1. सेते ग5% सीओ 2 के साथ एक humidified सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एल (इस हालत इसके बाद "के रूप में टिशू कल्चर इनक्यूबेटर" कहा जाता है)। बाद लगभग 48 घंटा, एक बड़ा पिपेट का उपयोग वायरस युक्त मीडिया सेल फसल और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से इसे पारित।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 200,000 XG पर ultracentrifugation द्वारा वायरस ध्यान लगाओ। में 500 μl DMEM-एफपीएस वायरस गोली युक्त 20 यू DNase Resuspend, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: DNase कदम प्लास्मिड डीएनए कि अभिकर्मक प्रक्रिया से बनी रहती का खामियाजा को नष्ट करने से अवांछित प्लाज्मिड दृश्यों की वसूली को कम करने में मदद करता है।
  3. पी 24 एकाग्रता 46 निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक एचआईवी -1 पी 24 प्रतिजन कब्जा किट का उपयोग कर का निर्धारण करते हैं।
    नोट: वायरस एकाग्रता भी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि परख 47,48 द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कार्यात्मक वायरस के स्तर पर कर सकते हैंMOI को मापने के द्वारा निर्धारित किया। यह सबसे आसानी से प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल वायरस है कि इस तरह बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के साथ छँटाई का उपयोग किया जाता है। MOI दृढ़ संकल्प विशेष रूप से उपयोगी है जब प्राथमिक कोशिकाओं है कि अनुकूलित सेल लाइनों के रूप में संक्रमण का एक ही स्तर का समर्थन नहीं कर सकते हैं के साथ काम हो सकता है।

2. वायरस से संक्रमित कोशिकाओं

  1. प्लेट में 2.5 मिलीलीटर DMEM-एफपीएस एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 3.0 x 10 5 HEK293T कोशिकाओं और एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के साथ बरामद अद्वितीय एकीकरण साइटों की संख्या सीधे कोशिकाओं और सक्रिय वायरस के संक्रमण की मात्रा में इस्तेमाल की संख्या के अनुपात में होती है।
  2. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए 500 μl ताजा DMEM-एफपीएस के अंतिम मात्रा में 500 एनजी / एमएल के अंतिम वायरल पी 24 एकाग्रता के साथ कोशिकाओं को संक्रमित है, तो 2 मिलीलीटर DMEM-एफपीएस प्रति अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म जोड़ सकते हैं और ऊष्मायन जारी है।
  3. पर48 घंटा के बाद संक्रमण, मीडिया को हटाने और 2 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें। जोड़ें 0.5 मिलीलीटर trypsin EDTA के 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म, और कुछ ही सेकंड बाद नेत्रहीन सेल dislodgement के लिए कुओं का निरीक्षण किया।
  4. 2 मिलीलीटर पूर्व गरम DMEM-एफपीएस जोड़ें और 10 बार एक बड़ा पिपेट के साथ कोमल ऊपर / नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend ~। एक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर 18 मिलीलीटर पूर्व गर्म DMEM-एफपीएस युक्त कुप्पी का हल स्थानांतरण, और एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. संक्रमण की शुरुआत से न्यूनतम पांच दिनों के बाद, मीडिया को हटाने के द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोने के 2 मिलीलीटर पूर्व गर्म trypsin-EDTA जोड़ने के लिए, और pipetting द्वारा के साथ 5 मिलीलीटर पूर्व गर्म DMEM-एफपीएस resuspend। 2500 XG पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: यद्यपि के बारे में 48 घंटा के बाद संक्रमण 49,50 पर इन शर्तों के पठारों के तहत एकीकरण, संस्कृति के अतिरिक्त 3 दिनों sufficientl के लिए आवश्यक हैंY unintegrated डीएनए अणु है कि सेल आधारित डीएनए पुनर्संयोजन या वायरल की मध्यस्थता autointegration से परिणाम की एकाग्रता पतला।
  6. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (जैसे, 51 देखें) का उपयोग सेल गोली से जीनोमिक डीएनए निकालें। 10 मिमी Tris एचसीएल के 200 μl, पीएच 8.5 के साथ आपूर्ति की आयन एक्सचेंज स्तंभ से डीएनए Elute।
    नोट: कोशिकाओं के एक विभाज्य एक संक्रामकता परख NGS करने से पहले उचित वायरस के संक्रमण को सुनिश्चित करने के लिए 48 घंटे के बाद संक्रमण (2.3 कदम) में विभाजित किया जाना चाहिए।

Sonication द्वारा या प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट द्वारा 3. टुकड़ा जीनोमिक डीएनए

नोट: Sonication टुकड़े एक लगभग अनुक्रम स्वतंत्र ढंग से जीनोमिक डीएनए और इस तरह विखंडन का बेहतर साधन है जब एक कम होने की उम्मीद वसूली दर के साथ अनुक्रमण के नमूने (जैसे, संक्रमित मरीज ​​की कोशिकाओं या संक्रमण अपेक्षाकृत कम MOI में शुरू किया)। इसके अलावा, sonication के एक एक पार्टी की पीसीआर डुप्लिकेट भेद करने के लिए अनुमति देता हैएक ही स्थल पर अद्वितीय एकीकरण से cular एकीकरण साइट दृश्य है, जो महत्वपूर्ण है संक्रमित रोगियों (नीचे चरण 11 देखें) 39,52-54 में provirus युक्त कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार भेद करने के लिए।
नोट: डीएनए एलएम पीसीआर के दौरान आंतरिक वायरल दृश्यों के प्रवर्धन कम करने के लिए नदी के ऊपर लीटर से तुरंत नीचे की ओर cleaved किया जाना चाहिए। प्रतिबंध एंजाइम BglII कि नदी के ऊपर U5 अनुक्रम से 43 बीपी नीचे की ओर स्थित है और उस MseI जनित डीएनए के साथ बाद में बंधाव के लिए असंगत है कई एचआईवी -1 उपभेदों (चित्रा 1 बी) के साथ अच्छी तरह से काम होता है। जब sonication द्वारा डीएनए की तैयारी, आंतरिक cleaving प्रतिबंध एंजाइम लिंकर बंधाव के बाद लागू किया जाना चाहिए (देखें चित्र -1 सी - और नीचे 4.3 चरण)।

  1. sonication के लिए, nuclease मुक्त पानी में जीनोमिक डीएनए के 10 माइक्रोग्राम मिश्रण 120 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए। 500 बीपी के एक औसत आकार के लिए ब्रेक के मापदंडों का उपयोग Sonicate (निम्नलिखित पैरा के दो दौरमीटर: शुल्क साइकिल: 5%; तीव्रता: 3; फट प्रति चक्र: 200; समय: 80 सेकंड)।
  2. sonicated डीएनए एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध। डीएनए की मरम्मत एक डीएनए अंत मरम्मत किट का उपयोग कर समाप्त होता है और डीएनए एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध। एक-पूंछ डीएनए Klenow EXO का उपयोग कर - एंजाइम और एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर एक-पुच्छ डीएनए शुद्ध। किट उपयोग के अतिरिक्त जानकारी के लिए 51,52 को देखें।
  3. प्रतिबंध endonuclease पाचन के लिए, निर्माता और (प्रत्येक 100 यू) एंजाइमों के एक कॉकटेल कि 5'-टीए overhangs उत्पन्न द्वारा आपूर्ति बफर के साथ 100 μl की मात्रा में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जीनोमिक डीएनए के 10 माइक्रोग्राम कटौती एक के रूप में भी ऐसे BglII के रूप में असंगत एंजाइम है कि cleaves नदी के ऊपर वायरल लीटर से नीचे की ओर। डीएनए अगले दिन शुद्ध एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग।
    नोट: प्रतिबंध एंजाइमों से कोई भी टर्मिनल के भीतर कटौती करनी चाहिए ~ वायरल डीएनए अंत कि एलएम पीसीआर प्रोटोकॉल से परिलक्षित होता है के 30 बीपी। इस प्रोटोकॉल विशेष U5 amplifiesएचआईवी -1 डीएनए के अंत।

4. पानी रखना लिंकर oligonucleotides और खंडित जीनोमिक डीएनए के लिए Ligate

नोट: एक की अधिकता है कि ऊपर डीएनए टुकड़े (oligonucleotides के दृश्यों इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए 1 टेबल देखें) के साथ संगत है जिसमें एक असममित लिंकर तैयार करें। लिंकर, sonicated डीएनए के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक संगत टी 3 'की अधिकता शामिल होना चाहिए, जबकि MseI पचा डीएनए के लिए लिंकर एक संगत 5'-टीए की अधिकता (चित्रा 1) होना चाहिए। लघु लिंकर कतरा इसके अतिरिक्त ऐसे 3'-एमाइन के रूप में एक गैर बढ़ाई रासायनिक संशोधन शामिल होना चाहिए, ब्याज के डीएनए की ओर बाद में प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं विवश करने के लिए।
नोट: जब समानांतर में कई अलग अलग एकीकरण साइट पुस्तकालयों की तैयारी कर रहा है और / या एक ही अनुक्रमण रन पर बहुसंकेतन अद्वितीय नमूने, यह नमूना पार contamin के लिए क्षमता की सीमा को प्रत्येक नमूना के लिए अद्वितीय linkers का उपयोग करने की सिफारिश की है जबपीसीआर के दौरान समझना। यह अतिरिक्त अर्द्ध नेस्टेड पीसीआर (नीचे वर्णित) के दौरान प्रत्येक नमूना के लिए अद्वितीय लिंकर प्राइमरों के उपयोग का तात्पर्य। अनोखा लिंकर किस्में और लिंकर प्राइमरों 1 टेबल में सूचीबद्ध समान समग्र% जीसी सामग्री और लागू की अधिकता पदों को बनाए रखते हुए लिंकर oligonucleotide दृश्यों पांव मार से डिजाइन किया जा सकता है।

  1. 90 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0-0.1 मिमी EDTA (10 माइक्रोन के प्रत्येक oligonucleotide के अंतिम एकाग्रता) हीटिंग द्वारा 35 μl में छोटी और लंबी लिंकर किस्में पानी रखना और धीरे धीरे 1 ° के चरणों में कमरे के तापमान को ठंडा प्रति मिनट सी।
  2. प्रति जीनोमिक डीएनए नमूना कम से कम चार समानांतर बंधाव प्रतिक्रियाओं, जो 1.5 माइक्रोन ligated लिंकर, 1 माइक्रोग्राम खंडित डीएनए, और 800 50 μl में यू टी -4 डीएनए ligase शामिल तैयार करें। 12 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ligate। एक पीसीआर शुद्धि किट के साथ अगले दिन शुद्ध।
  3. sonication द्वारा तैयार नमूनों के लिए, एक प्रतिबंधित की 100 यू के साथ शुद्ध बंधाव प्रतिक्रिया पचानेtion एंजाइम है कि नीचे की ओर नदी के ऊपर लीटर (जैसे, एचआईवी -1 के लिए BglII) से cleaves निर्माता के तहत की स्थिति में रात भर की सिफारिश की। डीएनए एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध।

5. बढ़ाना वायरल लीटर होस्ट जीनोमिक डीएनए अर्द्ध नेस्ट पीसीआर द्वारा जंक्शनों

नोट: बरामद बंधाव प्रतिक्रिया के डीएनए एकाग्रता पर निर्भर करता है इष्टतम पुस्तकालय विविधता के लिए सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 4-8 समानांतर PCRs, दोनों पीसीआर राउंड के लिए प्रत्येक नमूना के लिए तैयार रहना चाहिए। डीएनए टेम्पलेट एकाग्रता spectrophotometry द्वारा मात्रा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में पीसीआर के पहले और दूसरे दौर नेस्ट लीटर विशिष्ट प्राइमरों को रोजगार, लेकिन एक ही लिंकर विशिष्ट प्राइमर दोनों राउंड (तालिका 1) के लिए प्रयोग किया जाता है। दूसरे दौर लीटर विशिष्ट प्राइमर और डीएनए क्लस्टरिंग के साथ ही अनुक्रमण प्राइमर बाध्यकारी साइटों के लिए लिंकर विशिष्ट प्राइमर सांकेतिक शब्दों में बदलना एडाप्टर दृश्यों। नेस्ट लीटर विशिष्ट प्राइमर भी एक 6 NT सूचकांक अनुक्रम को कूटबद्ध, कजहाँ एक ही अनुक्रमण रन के भीतर बहुसंकेतन पुस्तकालयों के लिए अलग प्राइमरों के बीच अलग किया जा सकता है।

  1. पहले दौर तालिका 2 में सूचीबद्ध के रूप में ट्यूब प्रति अवयवों से युक्त PCRs तैयार करें।
    नोट: लिंकर विशिष्ट प्राइमर लिंकर, 53 डिग्री सेल्सियस, 45% की एक जीसी सामग्री, और अपनी 3 के एक पिघलने के तापमान की Termini 'अंत 3 से 15-16 बीपी नदी के ऊपर स्थित है' के लिए पूरकता के 22 NT बंदरगाहों अलग लिंकर लंबे किस्में (तालिका 1)। पहले दौर के 27 NT लीटर प्राइमर 59 डिग्री सेल्सियस, 48% की एक जीसी सामग्री की एक पिघलने तापमान है, और इसके 3 'के अंत एचआईवी -1 U5 टर्मिनस से 34 बीपी नदी के ऊपर स्थित है। दूसरे दौर में 26 NT लीटर प्राइमर का क्षेत्र है कि एचआईवी -1 लीटर के लिए पूरक है 60 डिग्री सेल्सियस, 50% की एक जीसी सामग्री, और अपनी 3 'के अंत की एक पिघलने तापमान है वायरल U5 से 18 बीपी नदी के ऊपर स्थित है टर्मिनस। यह सिफारिश की है कि oligonucleotide पिघलने के तापमान और जीसी सामग्री उपयोगकर्ताओं यदि इन मानकों की नकल करना चाहिए21 (अन्य रेट्रोवायरस साथ प्रयोग के लिए सहित) बदल दृश्यों के साथ डिजाइन पीसीआर प्राइमरों।
  2. निम्नलिखित thermocycler मापदंडों के तहत पहले पीसीआर दौर चला: एक चक्र: 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 30 चक्रों: 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड, 45 सेकंड के लिए 68 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस; एक चक्र: 10 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस।
  3. प्रतिक्रियाओं पूल और एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध। दूसरे दौर प्रति 3 टेबल के रूप में ट्यूब प्रति अवयवों से युक्त PCRs तैयार करें। चरण 5.2 में वर्णित thermocycler मापदंडों का उपयोग पीसीआर के दूसरे दौर चला। प्रतिक्रियाओं पूल और एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि निर्माता के निर्देशों का पालन किट का उपयोग डीएनए शुद्ध।
    नोट: डीएनए क्लस्टरिंग NGS के साथ संगत की सिफारिश सूचकांक दृश्यों की एक किस्म उपलब्ध 71 हैं।

6. प्रदर्शन करना QC और NGS (आमतौर पर एक अनुक्रमण सुविधा द्वारा पूर्ण)

  1. (क्यूसी परख # 1) की पुष्टि चरण 5.3 पुस्तकालय डीएनए एकाग्रता एक फ्लोरो का उपयोग करमीटर 55। संक्षेप में, 200 μl nuclease मुक्त पानी के अंतिम मात्रा में मानकों और प्रयोगात्मक नमूने तैयार करते हैं। भंवर ट्यूब 2-3 सेकंड के लिए, 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, और उसके बाद fluorometer में नमूने पढ़ें।
    नोट: नमूने 15 μl की एक न्यूनतम मात्रा में 2 एनएम पुस्तकालय डीएनए की एक न्यूनतम एकाग्रता को शामिल करना चाहिए।
  2. (क्यूसी परख # 2) एक टेप आधारित परख 56 का उपयोग करते हुए डीएनए टुकड़ा आकार के वितरण की पुष्टि करें।
    नोट: एक आदर्श वितरण एक अपेक्षाकृत व्यापक डीएनए लंबाई में लगभग 500 बीपी केंद्रित चोटी है। सामग्री का एक महत्वपूर्ण राशि 1 केबी से बड़ा है, तो यह लंबे समय तक डीएनए प्रजाति है, जो क्लस्टरिंग दौरान पुल प्रवर्धन रोकना होगा समाप्त करने के लिए एक आकार चयन प्रक्रिया को शामिल करने की सिफारिश की है। इसके विपरीत, यदि एक महत्वपूर्ण चोटी के चारों ओर 100 से 200 बीपी के लिए स्पष्ट है, एक प्राइमर डिमर पीसीआर के दौरान गठन हो सकता है। इस मामले में प्रक्रिया प्राइमर dimers के गठन को कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  3. (क्यूसी परख # 3) सहमात्रात्मक पीसीआर 57 से डीएनए पुस्तकालय में एडेप्टर का उचित समावेश nfirm।
  4. निर्माता के आवेदन साहित्य निम्नलिखित NGS प्रदर्शन करना। 10% की एक कील में उपयोग (डब्ल्यू / डब्ल्यू) ΦX174 डीएनए, जो अनुक्रमण रन के लिए संतुलित आधार संरचना प्रदान करके वास्तविक समय गुणवत्ता मैट्रिक्स अनुकूलन होगा।
    नोट: एकीकरण साइट अनुक्रमण प्रयोगों आम तौर पर एकल अंत में 150 बीपी (SE150) या बनती अंत 150 बीपी (PE150) अनुक्रमण के अधीन हैं। PE150 प्रत्येक डीएनए अणु पर लिंकर लगाव बिंदु पर कब्जा करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है (उदाहरण के लिए, जब मेजबान सेल क्लोनल विस्तार के सबूत के लिए एकीकरण साइटों की छानबीन)।

7. लीटर युक्त दृश्यों, फसल दूर लीटर और लिंकर दृश्यों के लिए अनुक्रमण डेटा पार्स करने के लिए एक स्वनिर्धारित अजगर या पर्ल स्क्रिप्ट का प्रयोग करें, और BLAT के साथ संदर्भ जीनोम के लिए नक्शे

  1. , लीटर युक्त अनुक्रम पढ़ता फसल लीटर और लिंकर दृश्यों मेजबान जीनोमिक डीएनए अनुक्रम से दूर है, और के लिए स्कैन FASTA फ़ाइलेंएक नए FASTA फाइल करने के लिए इन दृश्यों निर्यात। मानचित्र फसली दोनों एक संदर्भ जीनोम को पढ़ता है (जैसे मानव जीनोम संस्करणों hg19 या GRCh38) और वायरल जीनोम BLAT 58 का उपयोग कर, उत्पादन एकीकरण साइट के साथ एक अलग .txt फ़ाइल को निर्यात निर्देशांक, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग:
    stepsize = 6, minIdentity = 97, और maxIntron = 0
  2. फ़ाइल .txt BLAT उत्पादन को पार्स, autointegrations हटाने के लिए (यानी सबूत है कि लीटर अंत वायरल डीएनए जीनोम की एक आंतरिक क्षेत्र में एकीकृत किया गया है) एचआईवी -1 जीनोम के लिए और अन्य दृश्यों मानचित्रण, और फ़ाइल .txt एक अलग उत्पादन बनाने जिसमें सभी डुप्लिकेट एकीकरण साइटों एकल, अनूठा समन्वय के हिट में सघन किया गया है।

8. युक्त एकीकरण आसपास के 15-NT अंतराल .bed फ़ाइलें बनाएँ, FASTA फ़ाइलें करने के लिए इन बदलने, और अनुक्रम लोगो का निर्माण प्रदर्शित करने के लिए बेस प्राथमिकताएं आसपास एकता साइटें

  1. इसके लिए अड्डों में से एक अंतराल सूची .bed फ़ाइलें बनाएँप्रत्येक एकीकरण साइट। कम से कम 15 ठिकानों (5 नदी के ऊपर और नीचे की ओर 10) अनुक्रम लोगो पीढ़ी के लिए सुझाव दिया है। BEDTools 59 से fastaFromBed समारोह और इस आदेश का उपयोग करके इन .bed फाइलों से एक FASTA फ़ाइल उत्पन्न:
    fastaFromBed -fi / निर्देशिका / to / संदर्भ / जीनोम / चाहिए- -s बिस्तर 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    नोट: अपरिवर्तनीय वायरल 5'-CA-3 'डाईन्यूक्लियोटाइड एकीकरण के दौरान डीएनए की मेजबानी के लिए शामिल हो गए है, और सेलुलर डीएनए के लिए लीटर टर्मिनस के जंक्शन की पुष्टि करने के सदाशयी एकीकरण साइटों की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक फिल्टर है। हम इसके अतिरिक्त प्रयोगात्मक परिणामों की पुष्टि करने के लिए इस मेजबान डीएनए अनुक्रम आबादी से अनुक्रम लोगो संकलन। रेट्रोवायरस हस्ताक्षर के आधार पर उनके एकीकरण साइटों 14,15 आसपास के वरीयताओं प्रदर्शन के रूप में, अनुक्रम लोगो इस तरह के गैर मुताबिक़ डीएनए के रूप में अन्य पुनर्संयोजन तंत्र की तुलना में मान्य करने के लिए मध्यस्थता एकीकरण के माध्यम से मैप जीनोमिक साइटों उठी की सेवा60,61 में शामिल होने से खत्म होता है।
  2. उपयोग WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) FASTA फाइलों से अनुक्रम लोगो बनाने के लिए। क्लिक करें FASTA फ़ाइल अपलोड करने के लिए 'फ़ाइल चुनें', और निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: आउटपुट स्वरूप, पीडीएफ (वेक्टर); लोगो आकार, बड़े; प्रथम स्थान संख्या -5; लोगो रेंज, -5 से 5; वाई अक्ष पैमाने पर, 0.1, वाई अक्ष टिक रिक्ति, 0.5, रंग योजना, क्लासिक (एनए)।

9. बनाएं केंद्रीय आधार जोड़ी .bed फ़ाइलें, नमूना पार संदूषण के लिए जाँच करें, और रिश्तेदार अद्वितीय एकीकरण स्थलों की वितरण के लिए प्रासंगिक जीनोमिक सुविधाएँ नक्शा

  1. रेट्रोवायरल एकीकरण tDNA किस्में भर में एक कंपित फैशन में होता है के बाद से, जीनोमिक सुविधाओं के लिए जीनोमिक वितरण रिश्तेदार की सही मानचित्रण के लिए लक्ष्य साइट दोहराव के केंद्रीय बीपी को प्रतिबिंबित करने के एकीकरण साइटों की सटीक निर्देशांक समायोजित करें।
    1. इसलिए, 5 बीपी एचआईवी -1 की तरह वायरस duplicating के लिए, मैं से ऑफसेट केंद्रीय बीपी के साथ एक फ़ाइल बनाने .bedएकीकरण मानचित्रण के लिए नीचे की ओर दो ठिकानों प्लस किनारा करने के लिए, और दो ठिकानों शून्य से किनारा करने के लिए एकीकरण मानचित्रण के लिए नदी के ऊपर से ntegration साइट।
  2. नमूना पार संदूषण के लिए जाँच करने के लिए, का उपयोग कर BEDTools समारोह एक दूसरे को काटना केंद्रीय बीपी दो अलग नमूने के लिए और इस आदेश का पालन करते हुए .bed फ़ाइलें एक दूसरे को काटना द्वारा एकीकरण विभिन्न पुस्तकालयों के बीच आम साइटों की संख्या की गणना:
    bedtools काटना -एक central_basepair_1.bed बी central_basepair_2.bed च 1.00 आर एस> overlap1v2.txt
  3. आदेश के बाद आदेश का उपयोग करके दो पुस्तकालयों के बीच आम साइटों की सही संख्या यों में उत्पादन overlap1v2.txt फ़ाइल में लाइनों की संख्या की गणना:
    WC -l overlap1v2.txt
  4. (है कि UCSC जीनोम एनोटेशन डाटाबेस से एकीकरण साइट मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था संदर्भ जीनोम के संस्करण के लिए RefSeq एनोटेशन .bed फाइल डाउनलोड जैसे http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database) 62।
    1. का उपयोग कर BEDTools समारोह एक दूसरे को काटना केंद्रीय आधार जोड़ी .bed फ़ाइल कि नमूने के लिए तैयार की गई थी साथ RefSeq इस आदेश निम्न फ़ाइल .bed एक दूसरे को काटना द्वारा RefSeq जीन के भीतर गिरने एकीकरण साइटों की संख्या की गणना:
      bedtools काटना -एक central_basepair_1.bed बी RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
  5. आदेश के बाद आदेश का उपयोग करके RefSeq जीन में गिरने साइटों की सही संख्या यों में उत्पादन RefSeq_sample1.bed फ़ाइल में लाइनों की संख्या की गणना:
    WC -l RefSeq_sample1.bed
  6. दोहराएँ हित के किसी भी अन्य एनोटेशन जिसके लिए एक अंतराल .bed फ़ाइल उपलब्ध है मानचित्रण एकीकरण साइटों के लिए 9.3 और 9.4 कदम। UCSC जीनोम एनोटेशन डाटाबेस से ब्याज की संदर्भ जीनोम के लिए सबसे वर्तमान सीपीजी द्वीप एनोटेशन .bed फ़ाइल के रूप में डाउनलोड चरण 9.4 में निर्देश दिया।
    1. एक निश्चित di भीतर गिरने एकीकरण साइटों की संख्या की गणनारुख BEDTools खिड़की समारोह का उपयोग और इस आदेश का पालन करते हुए सीपीजी द्वीपों में से (इस उदाहरण में सचित्र एक 5 केबी खिड़की है):
      bedtools खिड़की 2500 डब्ल्यू बी central_basepair_1.bed CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed
  7. आदेश के बाद आदेश का उपयोग करके नदी के ऊपर या नीचे की ओर सीपीजी द्वीपों में से 2.5 केबी के भीतर गिरने साइटों की सही संख्या यों में उत्पादन CpG_sample1.bed फ़ाइल में लाइनों की संख्या की गणना:
    WC -l CpG_sample1.bed
  8. दोहराएँ 9.6 और मानचित्रण एकीकरण साइटों के लिए 9.7 पास TSSs कदम। RefSeq.bed फ़ाइल, जहां जीनोमिक एक से अधिक जीन को मानचित्रण निर्देशांक का एक वैकल्पिक संस्करण उत्पन्न उस स्थिति में केवल एक ही जीन वर्तमान प्रतिबिंबित करने के लिए समायोजित किया गया है। इस जीन एकीकरण साइटों आसपास के घनत्व की overestimation से बचाता है। BEDTools खिड़की समारोह का उपयोग और इस आदेश का पालन करते हुए प्रत्येक एकीकरण साइट आसपास के 1 एमबी क्षेत्र में जीन घनत्व की गणना:
  9. इस आदेश का पालन करते हुए डाटासेट में सभी एकीकरण के लिए औसत जीन घनत्व की गणना:
    ऑक '(योग + = $ 7) अंत (प्रिंट "औसत =", योग / एनआर)' GeneDensity_sample1.bed

10 आंकड़ों की तुलना करें एकीकरण साइट वितरण उपयोग करते हुए दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण और अनुसंधान में दो पूंछ Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण नमूनों के बीच

नोट: उपयोग फिशर सटीक परीक्षण RefSeq जीन के भीतर या सीपीजी द्वीप या TSSs की एक खिड़की के भीतर एकीकरण साइटों के अनुपात में तुलना करने के लिए है, लेकिन जीन एकीकरण साइटों आसपास के घनत्व में वितरण की तुलना के लिए Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण का उपयोग करें। आर कार्यक्रम http://www.r-project.org/ पर उपलब्ध है।
दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण:

  1. संख्याओं की गणना के रूप में कदम 9.4 और 9.7 में निर्देश का प्रयोग, सीआरमनाया घटनाओं इस आदेश का पालन करते हुए साइटों शेष बनाम (एक एनोटेशन के भीतर या एक एनोटेशन आसपास एक खिड़की के भीतर एकीकरण) की आर में प्रत्येक तुलना के लिए matrices eate:
    (Annotation_of_interest <- में मैट्रिक्स (ग (SampleA #, SampleA # शेष, SampleB # शेष SampleB # में), Nrow = 2, dimnames = सूची (ग ( 'केंद्र', 'शेष'), सी ( 'SampleA' 'SampleB'))))
  2. द्वारा दो पूंछ निम्न कमांड के साथ फिशर सटीक परीक्षण की तुलना के लिए पी मूल्य की गणना:
    fisher.test (annotation_of_interest, वैकल्पिक = 'two.sided') $ p.value
    दो पूंछ Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण:
  3. जिसमें प्रत्येक स्तंभ शीर्ष सेल में नमूना नाम शामिल टैब-सीमांकित txt फ़ाइल बनाएँ, कि पुस्तकालय (.bed चरण 9.9 में उत्पन्न फ़ाइल से प्राप्त) में सभी एकीकरण साइटों के लिए जीन घनत्व मूल्यों से नीचे का पालन किया। निम्न आदेश का उपयोग आर में इस टैब-सीमांकित .txt फ़ाइल आयात और एनएसही फ़ाइल निर्देशिका करने के लिए vigating:
    FILENAME <- as.data.frame (read.delim (file.choose (), शीर्षक = टी, check.names = झूठी, भरने सही = सितम्बर = ' t'))
  4. निम्न कमांड के साथ दो पूंछ Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण से तुलना के लिए पी मूल्य की गणना:
    wilcox.test (FILENAME $ SampleA, FILENAME $ SampleB, वैकल्पिक = 'two.sided', बनती = एफ, सटीक = टी) $ p.value
    नोट: पी मूल्यों केवल अनुसंधान में एक निश्चित (अत्यंत कम) सीमित करने के लिए नीचे गणना की जा सकती है, शून्य जिसके बाद इस कार्यक्रम के द्वारा लौटा दी जाएगी। बड़े पैमाने पर विभिन्न नमूनों कि एक पी = 0 आर में उपज के लिए, <2.2 x 10 -308 के रूप में पी मूल्य का अनुमान है।

11. युक्त एकीकृत वायरल डीएनए प्रकोष्ठों के क्लोनल विस्तार के सबूत के लिए कच्चे अनुक्रमण डेटा की जांच

नोट: एक छोटी सी संभावना संदर्भ जीनोम में सटीक एक ही NT में एक से अधिक एकीकरण के लिए मौजूद है। वैकल्पिक रूप से, में एक भीtegration घटना पुस्तकालय तैयारी के दौरान और / या सेल दोहराव डीएनए की तैयारी के लिए पहले से पीसीआर के उपयोग के कारण अनुक्रमण डेटा में प्रचुरता से उपस्थित हो सकता है। एचआईवी संक्रमित रोगियों से जीनोमिक डीएनए के विश्लेषण हाल अद्वितीय sonication कतरनी अंक / लिंकर लगाव अंक डीएनए समान एकीकरण साइटों 52-54 युक्त दृश्यों के भीतर (जो केवल पीसीआर से पहले पैदा कर सकते हैं) की पहचान करके इन संभावनाओं को प्रतिष्ठित किया है। वर्तमान में करने के लिए है कि क्या clonally विस्तार कोशिकाओं के भीतर शरण proviruses अव्यक्त वायरल जलाशय के लिए योगदान है, और इस प्रकार यह जब मानव रोगियों में एकीकरण साइटों का अध्ययन विस्तार के अपने स्तर को चिह्नित करने के लिए विशेष ब्याज की है के रूप में एक बहस चल रही है।

  1. चरण 8.1 में सूचीबद्ध प्रक्रिया के लिए इसी प्रकार, .bed का विस्तार अड्डों में से एक अंतराल लिस्टिंग फ़ाइलें, इस मामले में उत्पन्न, 25 NT नीचे की ओर एक अद्वितीय एकीकरण साइट से (अपस्ट्रीम ठिकानों अनावश्यक यहाँ हैं)। के रूप में निर्देश दिए इन .bed फाइलों से एक FASTA फ़ाइल उत्पन्न (चरण 8.1) BEDTools से fastaFromBed समारोह का उपयोग और इस आदेश का पालन करते हुए:
    fastaFromBed -fi / निर्देशिका / to / संदर्भ / जीनोम / चाहिए- -s बिस्तर 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
    नोट: यह खोज क्लोनल विस्तार के लिए विश्लेषण करती है कम से कम 25 NT बहाव के प्रत्येक एकीकरण साइट से निकालने के लिए सिफारिश की है प्रत्येक की विशिष्टता में सुधार करना।
  2. अधिमानतः एक स्वनिर्धारित स्क्रिप्ट का उपयोग कर, प्रत्येक अद्वितीय एकीकरण साइट से NT नीचे की ओर से 25 एक सटीक मैच युक्त सभी तारों के लिए कच्चे अनुक्रम डेटा FASTA फ़ाइल खोज की है, और एक नई फ़ाइल में इन दृश्यों जमा। कच्चे तार से लीटर और लिंकर दृश्यों ट्रिम। मर्ज पीई अनुक्रम परिवर्तित करके पढ़ता है, रिवर्स पूरक करने के लिए पढ़ता लीटर और लिंकर दृश्यों trimming, और फिर उनके read1 जोड़ी को read2 तार तार बताए का हिस्सा कम से कम 20 NT ओवरलैपिंग है।
  3. प्रत्येक एकीकरण साइट ब्लॉक के लिंकर लगाव अंक स्कैन करें। प्रत्येक एकीकरण वर्गीकृत के रूप में "clonally का विस्तार और# 34; लिंकर लगाव अंक हैं, तो ≥3 अलावा बीपी।
    नोट: अनुक्रम विलय बिना क्लोनल विस्तार विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल पढ़ता 52 में वर्णित किया गया है।
    नोट: sonication द्वारा ठीक उसी स्थान पर जीनोम के विखंडन क्लोनल विस्तार की हद तक की एक मूल्यवान समझना की ओर जाता है, और तरीकों जिसके परिणामस्वरूप प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह 63,64 वर्णित किया गया है सही करने के लिए।

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Representative Results

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तालिका 4 सूचियों एक प्रतिनिधि प्रयोग के परिणाम संक्रमित कोशिकाओं की एक संस्कृति से एकीकरण साइटों उबरने के लिए NGS की संवेदनशीलता को वर्णन करने के लिए। असंक्रमित सेलुलर डीएनए क्रमानुसार एक संक्रमण है जिसमें औसतन हर कोशिका एक एकीकरण 40 निहित से जीनोमिक डीएनए को कमजोर करने के लिए उपयोग किया गया था। 15,625: dilutions 1 के एक अधिक से अधिक कमजोर पड़ने के लिए पांच के चरणों में तैयार किए गए थे। अनुमापन श्रृंखला में जीनोमिक डीएनए तो sonication द्वारा खंडित किया गया था या प्रतिबंध के साथ पाचन द्वारा MseI और BglII, एल एम पीसीआर द्वारा पीछा किया endonucleases। अद्वितीय एकीकरण साइटों की संख्या, के रूप में अच्छी तरह के रूप में चयनित जीनोमिक एनोटेशन के लिए साइटों मानचित्रण समीपस्थ की संख्या, ऊपर प्रोटोकॉल के अनुसार गणना की गई। डेटा विश्लेषण अनूठा एकीकरण साइटों (राशि का 1-2% स्वच्छ जीनोमिक डीएनए से बरामद) कोशिकाओं जहां सिद्धांत में केवल एक ही 15,625 में से संक्रमित किया गया था तैयार पुस्तकालयों से बरामद के दर्जनों का पता चला। जब एकीकरण साइट डेटासेट का विश्लेषण, यह यादृच्छिक जीनोमिक साइटों की एक मिलान सेट है, जो एक मेल यादृच्छिक नियंत्रण या एमआरसी कहा जाता है के लिए डेटा की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है। के रूप में प्रतिनिधि परिणाम प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा या sonication द्वारा जीनोमिक डीएनए sheared, दो अलग अलग एमआरसी डेटासेट का निर्माण किया गया। एमआरसी Enz 50,000 अद्वितीय जीनोमिक बेतरतीब ढंग से MseI और BglII प्रतिबंध एंजाइम पाचन की साइटों के लिए निकटता में hg19 से साइटों का चयन करके उत्पन्न साइटों निहित है, जबकि एमआरसी यादृच्छिक harbored 10,000 साइटों जीनोमिक मार्करों सेट से दूरी के लिए सामान्य बनाने के बिना उत्पन्न। केवल उन साइटों है कि एक अद्वितीय जीनोमिक स्थान पर वापस मैप किया जा सकता एमआरसी डेटासेट में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। Sonication कैंची जीनोमिक डीएनए अनुक्रम पूर्वाग्रह से अनिवार्य रूप से आज़ाद के रूप में, एमआरसी यादृच्छिक sonication द्वारा डीएनए के विखंडन द्वारा उत्पादित डेटासेट करने के लिए और अधिक लागू के रूप में देखा जा सकता है। नियंत्रण एकीकरण के लिए एक वैकल्पिक शैलीसाइट डाटासेट, प्रोटीन में पुनः संयोजक प्रतिक्रिया द्वारा इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता intasome nucleoprotein जटिल 21, या deproteinized जीनोमिक डीएनए के साथ तीव्रता से संक्रमित कोशिकाओं को 17 से निकाली गई तस्वीरें, और फिर एलएम पीसीआर के बाद और NGS प्रोटोकॉल 21।

Sonication बनाम प्रतिबंध डाइजेस्ट (तुलना में साफ नमूने के बीच है), और साथ ही एमआरसी Enz और एमआरसी यादृच्छिक की तुलना के लिए, चित्रा 2 में दिखाया जाता है। एकीकरण साइटों का वितरण बरामद द्वारा बरामद एकीकरण साइटों के वितरण की तुलना के लिए पी मूल्यों निम्नलिखित sonication सबसे बड़ी सीपीजी द्वीपों के लिए निकटता के संदर्भ में स्पष्ट विचरण के साथ प्रतिबंध से बरामद एंजाइम की जांच की सभी व्याख्या के लिए पचाने उन लोगों के लिए इसी तरह की थी। उम्मीद 18,65 दोनों डेटासेट RefSeq जीन और जीन डी के भीतर एकीकरण के मामले में MRCS से काफी मतभेद के रूप मेंensity औसत एकीकरण साइट के आस-पास है, जबकि दोनों डेटासेट सीपीजी द्वीपों और TSSs को वितरण के रिश्तेदार के मामले में MRCS के समान थे। चूंकि अपेक्षाकृत कुछ एचआईवी -1 एकीकरण साइटों को एक सीपीजी द्वीप या टीएसएस की 2.5 केबी के भीतर नक्शे, बढ़ती साइटों की कुल संख्या बरामद परिवर्तनशीलता कि डेटासेट (तालिका 4 और चित्रा 2) के बीच पैदा कर सकते कमी होने की संभावना है। अनुक्रम लोगो एकीकरण साइट डेटा की प्रामाणिकता की पुष्टि करने के लिए 3 चित्र में दिखाया जाता है। आम सहमति एचआईवी -1 एकीकरण साइट 14,22 (-3) TDG (जी / वी) TWA (सी / बी) चा (7) ( जैव रसायन आधार कोड के अंतर्राष्ट्रीय संघ का उपयोग कर लिखा; बैकस्लैश vDNA की स्थिति को इंगित करता है प्लस-कतरा में शामिल होने, और रेखांकन बताता 5-बीपी अनुक्रम के बाद एचआईवी -1 एकीकरण और डीएनए की मरम्मत) दोनों विखंडन तकनीक द्वारा तैयार पुस्तकालयों के लिए स्पष्ट है दोहराया, हालांकि निश्चितता की डिग्री संक्रमित कोशिका के कमजोर पड़ने में वृद्धि के साथ कम हो जाती हैडीएनए। यादृच्छिक इसके विपरीत द्वारा एमआरसी डाटासेट से गठबंधन साइटों आधार वरीयताओं की प्रशंसनीय स्तर उत्पन्न करने में विफल रहा।

आकृति 1
चित्रा 1:। एकीकरण साइट लाइब्रेरी की तैयारियों का फ्लो चार्ट चित्रण (ए) 48 घंटा बाद में HEK293T कोशिकाओं, संचयन और छानने के सतह पर तैरनेवाला परासंक्रमित, ultracentrifugation द्वारा ध्यान दे, और वायरस की उचित एकाग्रता के साथ लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित वायरस शेयरों उत्पन्न करता है। संक्रमण के बाद कम से कम पांच दिन, जीनोमिक डीएनए निकाल सकते हैं। और अतिरिक्त प्रयोगात्मक जानकारी के लिए मुख्य पाठ के 2 वर्गों 1 का संदर्भ लें। (बी और सी) टुकड़ा प्रतिबंध एंजाइमों के साथ या sonication द्वारा पाचन द्वारा जीनोमिक डीएनए शुद्ध। प्रतिबंध एंजाइम कॉकटेल एक एंजाइम (जैसे BglII) नीचे की ओर नदी के ऊपर वायरल लीटर से cleaves जवाबी का चयन करने के लिए है कि एलएम-P के लिए शामिल करना चाहिएआंतरिक vDNA दृश्यों की सीआर प्रवर्धन। ग्रीन तारा चिह्न और (सी) में branched तीर निरूपित कि BglII लिंकर बंधाव के बाद लागू किया जाना चाहिए। लाल प्रकाश डाला गया वायरल अनुक्रम, जबकि काले प्रकाश डाला गया मेजबानी सेलुलर अनुक्रम। गर्भित डीएनए ब्रेक प्वाइंट (पैमाने पर नहीं) "एक्स" द्वारा चिह्नित कर रहे हैं एचआईवी -1 कई MseI और BglII साइटों होता है; केवल उन लोगों के प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक दिखाए जाते हैं। नक्शे के ऊपर कोष्ठक preferentially एलएम पीसीआर से परिलक्षित U5 सेलुलर डीएनए क्षेत्रों निरूपित। (डी) शुद्ध खंडित डीएनए (तब अंत मरम्मत और sonication के मामले में एक-पूंछ) और (ई) संगत विषम लिंकर अणुओं (नीले रंग) को ligate। (डी) में मैजेंटा हलकों एकीकरण साइट है कि परिलक्षित हो जाएगा संकेत मिलता है। लिंकर कम किस्में के 3 'सिरों पर तारों के अमीनो अवरुद्ध संशोधनों निरूपित। अर्द्ध नेस्टेड पीसीआर (एफ) आचार पहले दौर के पहले दौर लीटर प्राइमर (लाल) और लिंकर प्राइमर (ब्लू) का उपयोग। टी मेंउसकी पीसीआर दौर, लिंकर प्राइमर, डीएनए क्लस्टरिंग और NGS प्राइमर बाध्यकारी दृश्यों (नीले लिंकर प्राइमर के लिए एक हरे रंग की उपांग के रूप में वर्गीकृत किया है) के लिए encodes जबकि लीटर प्राइमर इस तरह के दृश्यों का अभाव है। (G) शुद्ध पहले दौर पीसीआर उत्पाद और अर्द्ध नेस्टेड पीसीआर के दूसरे दौर का आयोजन करेगा। पीसीआर के इस दौर में, पहले दौर (नीला + ग्रीन उपांग) के रूप में ही लिंकर किताब का उपयोग एक साथ दूसरे दौर लीटर प्राइमर (लाल) डीएनए क्लस्टरिंग और NGS प्राइमर बाध्यकारी दृश्यों किया जाता है कि रूप में अच्छी तरह बहुसंकेतन के लिए एक बारकोड (साथ लाल लीटर प्राइमर के लिए एक हरे रंग की उपांग) के रूप में वर्गीकृत किया है। (एच) (, मैजेंटा में बॉक्सिंग एकीकरण साइट मैजेंटा वृत्त द्वारा चिह्नित) के साथ अंतिम एकीकरण साइट पुस्तकालय के रूप में शुद्ध दूसरे दौर पीसीआर उत्पाद। क्यूसी और NGS के लिए अनुक्रमण की सुविधा के लिए विभाज्य जमा करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2:। पी मूल्यों संबंधित MRCS बनाम sonication द्वारा या प्रतिबंध से एंजाइम पाचन डीएनए विखंडन के बाद एकता साइटें प्रवर्धित की तुलना के लिए RefSeq जीन और आसपास के सीपीजी द्वीपों और TSSs भीतर एकीकरण साइटों, साथ ही क्षेत्रीय जीन घनत्व प्रोफाइल की संख्या में सूचीबद्ध हैं । तालिका 4 पी मूल्यों ≥0.05 बोल्ड और इटैलिक पाठ में डाला जाता है एक पी मूल्यों Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण द्वारा गणना फिशर सटीक परीक्षण बी पी मूल्यों से गणना की एमआरसी Enz:।।। यादृच्छिक नियंत्रण का मिलान नहीं हुआ; 50,000 अद्वितीय एकीकरण साइटों का एक सेट बेतरतीब ढंग से पारा निर्माण में MseI / BglII प्रतिबंध साइटों के लिए निकटता में पदों का चयन करके उत्पादन किया गया था 19. एमआरसी यादृच्छिक: रैंडम 10,000 अद्वितीय एकीकरण साइटों युक्त नियंत्रण से मिलान बेतरतीब ढंग से selecti द्वारा उत्पादितप्रतिबंध साइट निकटता को सामान्य बनाने के बिना hg19 में एनजी पदों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रतिनिधि प्रयोग पुस्तकालय से अनुक्रम लोगो चित्रण एचआईवी -1 बेस प्राथमिकताएं द्वारा (ए) प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पाचन या (बी) sonication तैयार WebLogo सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गठबंधन किया गया पुस्तकालयों से एकता साइटों।। नीचे में 15,625: अनुमापन श्रृंखला में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 1 अधिकतम कमजोर पड़ने के आंकड़ा के शीर्ष पर साफ डीएनए से दर्शाया गया है। 50,000 अद्वितीय जीनोमिक साइटों के एमआरसी के लिए (सी) अनुक्रम लोगो। त्रुटि सलाखों अनिवार्य रूप से किसी विशेष स्थिति में आधार समावेश में मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। अधिक विशेष रूप से, टीप्रत्येक त्रुटि पट्टी के otal ऊंचाई दो बार छोटा सा नमूना सुधार 66 है, जो अपेक्षाकृत छोटे डेटासेट में मौजूद एन्ट्रापी के मूल्यवान समझना के लिए नियंत्रित करने के लिए बराबर है। एक्स अक्ष मेजबान सेल जीनोमिक डीएनए NT बिंदु शून्य पर एकीकरण की साइट के सापेक्ष पदों का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
। तालिका 1: लिंकर निर्माण और पीसीआर प्रवर्धन के लिए Oligonucleotide दृश्यों लिंकर विशेष और दूसरे दौर लीटर प्राइमरों डीएनए क्लस्टरिंग एडाप्टर दृश्यों, जो कलर-कोडेड इस प्रकार हैं सांकेतिक शब्दों में बदलना: काले, लिंकर करने के लिए या एचआईवी -1 लीटर के पूरक ठिकानों; लाल, अद्वितीय सूचकांक या बारकोड; हरे, अनुक्रमण प्राइमर बाध्यकारी साइटों; नीले, डीएनए क्लस्टरिंग के लिए एडाप्टर दृश्यों। एकल-अंत (एसई) अनुक्रमण वजहctions, अनुक्रमण प्राइमर है कि दूसरे दौर लीटर प्राइमर read1 (हरा) अनुक्रम को anneals का उपयोग करते हुए बनती अंत (पीई) प्रतिक्रियाओं दोनों (read1 और read2) अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग होगा। एक लिंकर कम किस्में 3 'अमीनो संशोधन अवरुद्ध होते हैं। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति जोड़ें
पहले दौर लीटर प्राइमर (15 माइक्रोन) के: 2.5 μl
लिंकर विशिष्ट प्राइमर (15 माइक्रोन) के: 0.5 μl
10x पीसीआर बफर: 2.5 μl
dNTPs (2.5 मिमी प्रत्येक) 0.5 μl
डीएनए पोलीमरेज़ मिक्स: 0.5 μl
बंधाव प्रतिक्रिया: 100 एनजी
Nuclease मुक्त पानी: अप करने के लिए 25 μl

तालिका 2:। पहले दौर पीसीआर के लिए पकाने की विधि प्रत्येक निर्दिष्ट अभिकर्मक की राशि के लिए प्रत्येक व्यक्ति पीसीआर ट्यूब संकेत दिया है जोड़ा जाएगा।

अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति जोड़ें
दूसरे दौर लीटर प्राइमर (15 माइक्रोन) के: 2.5 μl
लिंकर विशिष्ट प्राइमर (15 माइक्रोन) के: 0.5 μl
10x पीसीआर बफर: 2.5 μl
dNTPs (2.5 मिमी प्रत्येक) 0.5 μl
डीएनए पोलीमरेज़ मिक्स: 0.5 μl
पहले दौर पीसीआर: 100 एनजी
Nuclease मुक्त पानी: अप करने के लिए 25 μl

तालिका 3:। दूसरे दौर पीसीआर पकाने की विधि प्रत्येक अभिकर्मक की राशि प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के लिए जोड़ा जा करने के लिए संकेत दिया है।

<टीडी> डाइजेस्ट, 1: 125
पुस्तकालय #Unique साइटें % RefSeq एक % सीपीजी +/- 2.5 केबी % टीएसएस +/- 2.5 केबी औसत। जीन घनत्व +/- 500 KB
Sonication, साफ 3169 71.2 5.1 3.7 15.8
Sonication, 1: 5 366 75.1 2.7 3 16.3
254 74 7.1 5.1 16.7
Sonication, 1: 125 430 69.8 6.9 6 14.6
Sonication, 1: 625 314 65.6 5.6 6.7 13.5
Sonication, 1: 3,125 116 73.6 3.5 2.5 13.1
Sonication, 1: 15,625 72 62.5 0 1.4 14.7
डाइजेस्ट, साफ 7428 69.8 3.6 2.9 15.2
डाइजेस्ट, 1: 5 1,460 71.4 4.4 3.4 14.9
डाइजेस्ट, 1:25 394 68.8 4.3 3.3 15.8
172 71 0 3 14
डाइजेस्ट, 1: 625 134 73.9 3.7 3.7 14.1
डाइजेस्ट, 1: 3,125 100 83.1 6.4 5.2 19.1
डाइजेस्ट, 1: 15,625 73 74 4.1 1.4 9.7
एमआरसी Enz 50,000 44.7 4.2 4 8.7
एमआरसी यादृच्छिक 10,000 41.3 5.3 4.2 8.6

तालिका 4: प्रतिनिधि अनुमापन सीरीज से एकता साइटें के जीनोमिक वितरण कुल एकीकरण साइटों का प्रतिशत वें।एक RefSeq जीन में आते हैं, सीपीजी द्वीपों में से 2.5 केबी के भीतर बी, और TSSs के 2.5 केबी के भीतर सेल्सियस पर डी 1 औसत एकीकरण साइट आसपास के एमबी के भीतर जीन घनत्व एमआरसी Enz:।। यादृच्छिक नियंत्रण का मिलान नहीं हुआ; 50,000 अद्वितीय एकीकरण साइटों का एक सेट बेतरतीब ढंग से hg19 में MseI / BglII प्रतिबंध साइटों के लिए निकटता में पदों का चयन करके तैयार की गई थी एफ एमआरसी रैंडम:। मिलान किया यादृच्छिक 10,000 अद्वितीय एकीकरण बेतरतीब ढंग से निर्धारित स्थान को सामान्य बनाने के बिना hg19 में पदों के चयन के द्वारा उत्पादित साइटों युक्त नियंत्रण।

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Discussion

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रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल, जीनोमिक वितरण पैटर्न के मानचित्रण के माध्यम से प्रारंभिक वायरस के संक्रमण से कदम, वर्णित है। इस प्रोटोकॉल किसी भी रेट्रोवायरस और किसी भी infectable सेल प्रकार के लिए लागू है। इसके अलावा, परख पाइपलाइन 6.4 x 10 -5 के MOI के साथ शुरू की एक संक्रमण की है कि जीनोमिक डीएनए बराबर के धारावाहिक dilutions से अद्वितीय एकीकरण साइटों की एक संतोषजनक नंबर ठीक करने के लिए क्षमता के साथ काफी संवेदनशील है। इस संवेदनशीलता जब संक्रमित रोगियों है कि एक कम वायरल लोड है, जहां केवल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश एक एकीकृत provirus बंदरगाह होगा शामिल हो सकता से नमूने के लिए लागू प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी बनाता है। इस क्षेत्र 36,38,41-43 में पूर्व कार्यप्रणाली कागजात के साथ संगत, इस प्रोटोकॉल के जैव सूचना विज्ञान हिस्से में कई कदम अनुक्रम डेटा की बड़ी फ़ाइलें प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित लिपियों के विकास से लाभ होगा। जबकि BLAT 58 मा हैइस प्रोटोकॉल में वर्णित उपयोगिता pping, उपयोगकर्ताओं को एक उपयुक्त विकल्प हो Bowtie 67 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) मिल सकता है।

एक वैकल्पिक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन हाल ही में Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस (MoMLV) एकीकरण साइटों 19 के निर्धारण के लिए सूचित किया गया। में है कि यह स्टैंडअलोन सॉफ्टवेयर है कि सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है, और है कि यह मूल रूप से अद्वितीय MoMLV एकीकरण साइटों के हजारों की सैकड़ों नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था काफी शक्तिशाली है में विकसित किया गया था कि पाइपलाइन उपयोगी है। हालांकि, उपलब्ध सॉफ्टवेयर मूल रूप से विशेष रूप से फिर से विश्लेषण करने के लिए सूचना MoMLV डाटासेट डिजाइन किया गया था, और इसलिए reprogramming प्रयोगात्मक डिजाइन (उपकरण की कार्यक्षमता को वैकल्पिक करने के लिए पाइप लाइन अनुकूलित करने के लिए आवश्यक होगा हाल ही में एडिनो से जुड़े वायरस और Tol2 शामिल करने के लिए विस्तार किया गया था और एसी / डी एस transposon वैक्टर 68)। इसके अलावा, कि प्रोटोकॉल प्रारंभिक एकीकरण साइट की पीढ़ी वर्णित .bedफ़ाइल, लेकिन जीनोमिक एनोटेशन उचित करने के लिए नक्शे साइट्स के लिए आवश्यक विशेष कदम बाहर नहीं करना था। पाठकों "वेक्टर एकीकरण साइट विश्लेषण" सर्वर 69 है, जो वर्तमान पांडुलिपि की समीक्षा के दौरान जारी किया गया था, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न NGS दृश्यों का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी मिल सकता है।

जब किसी भी प्रोटोकॉल का उपयोग रेट्रोवायरल एकीकरण साइट डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए कुछ बिंदुओं पर जोर दिया जाना चाहिए। जब मिलकर में कई पुस्तकालयों की तैयारी कर रहा है, एक महत्वपूर्ण क्षमता नमूना पार संदूषण के लिए मौजूद है। भी नमूना crosstalk के एक बहुत छोटे स्तर पर एक NGS रन अनुपयोगी बताते हुए के स्तर पर परिणाम अस्पष्ट कर सकते हैं। इसलिए, सभी गीला बेंच काम एक निष्फल, समर्पित लामिना का प्रवाह हुड या पीसीआर कार्य केंद्र में पूरा किया जाना चाहिए। pipettes और ऐसे nuclease मुक्त पानी के रूप में अभिकर्मकों का एक सेट एकीकरण साइट प्रवर्धन करने के लिए पूरी तरह समर्पित किया जाना चाहिए। प्रत्येक पुस्तकालय तैयारी के लिए अद्वितीय linkers के उपयोग के संभावित सीमित कर सकते हैंपार प्रवर्धन के लिए और भी विदेशी की पहचान के लिए अनुमति कच्चे FASTA फाइलों में प्रत्येक पुस्तकालय के भीतर पढ़ता है।

यह पेशेवरों और बनाम प्रतिबंध endonuclease पाचन sonication का उपयोग जीनोमिक डीएनए टुकड़ा करने की विपक्ष पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक तरफ, sonication कतरनी अंक की एक अपेक्षाकृत यादृच्छिक वितरण प्रदान करता है, लेकिन बाद में आवश्यक डीएनए की मरम्मत और ए-टेलिंग कदम लगातार लिंकर बंधाव उत्पादों की उपज कम प्रतिबंध एंजाइम जनित चिपचिपा समाप्त होता है के साथ प्रदर्शन किया ligations की तुलना में। दूसरी ओर, प्रतिबंध एंजाइम पाचन कतरनी कहते हैं, जो सदा ही बरामद डेटा में कुछ पूर्वाग्रह को लागू करेगा की एक कम से वितरित की आबादी है। (चित्रा 1) दोनों ही मामलों में नदी के ऊपर लीटर दृश्यों त्यागने के लिए एक प्रतिबंध endonuclease का उपयोग होगा एकीकरण साइटों है कि जीनोम में है कि साइट के अपस्ट्रीम झूठ का एक छोटा सा अंश के नुकसान में परिणाम। कोई डेटा पूर्वाग्रह है कि विज्ञापन हो सकता है परिणाम हो सकता हैपुस्तकालय तैयारी के दौरान प्रोटोकॉल से enzymatic पाचन को छोड़ते हुए और अनुक्रमण डेटा से नदी के ऊपर लीटर दृश्यों के परिणामस्वरूप भीड़ को छान कर कपड़े पहने।

हालांकि मौजूदा प्रोटोकॉल काफी संवेदनशील और, अद्वितीय एकीकरण साइटों 21,40 के लाखों पैदा सभी उपलब्ध एकीकरण के बारे में केवल एक तिहाई के लिए सक्षम है भी पुस्तकालय की तैयारी (रेफरी का सबसे अच्छा के साथ एक भी प्रयोग में परिलक्षित हो जाने की उम्मीद की जा सकती है। 70 और अप्रकाशित टिप्पणियों)। इस जटिलताओं जब कम MOI संक्रमण या रोगियों है कि कम वायरल लोड बंदरगाह से नमूनों का विश्लेषण हो सकता है। इस सीमा को बार-बार एक ही पुस्तकालय तैयारी अनुक्रमण और / या समानांतर में एक ही डीएनए नमूने से निकाली गई कई पुस्तकालयों अनुक्रमण के हिस्से में दूर किया जा सकता है। परख संवेदनशीलता में भविष्य बढ़ जाती है तदनुसार रेट्रोवायरल एकीकरण साइट अनुक्रमण को आगे बढ़ाने translational आवेदन करने के लिए बहुत फायदेमंद होगा।

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Acknowledgments

हम अपने सहयोगियों स्टीफन ह्यूजेस और सलाह के लिए हेनरी लेविन कि Engelman प्रयोगशाला में रेट्रोवायरल एकीकरण साइट अनुक्रमण के लिए NGS प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण था के लिए आभारी हैं। इस काम अनुदान स्वास्थ्य के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया AI039394 और AI052014 (ANE) और AI060354 (एड्स अनुसंधान के लिए हार्वर्ड विश्वविद्यालय के सेंटर)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 11965-084 Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH 30088.03 Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-Cl Antibiotics to be added to DMEM
Phosphate-Buffered saline Mediatech 21-040-CV Used to wash cells
Trypsin EDTA Corning 25-053-CI Used to detach adherent cells from tissue culture plates
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688 DNA transfection reagent
0.45 µm Filters Thermo Scientific 09-740-35B Used to filter virus particle-containing cell culture media
Turbo DNase Ambion AM2239 Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay ABL Inc. 5447 Used to quantify yield of virus production
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 Used to purify genomic DNA from cells
Sonicator Covaris S2 With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec
Nuclease-Free Water GeneMate G-3250-125 Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Used to purify DNA during library construction
End-It DNA End-Repair Kit Epicentre ER81050 Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples
Klenow Fragment (3'-5' exo–) New England Biolabs (NEB) M0212S Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments
dATP Thermo Scientific R0141 Deoxyadenosine triphosphate
MseI NEB R0525L Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage
BglII NEB R0144L Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence
T4 DNA Ligase NEB M0202L/6218 Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends
DNA Oligonucleotides Integrated DNA Technologies custom Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs 
Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 639202 Commercial mix containing DNA polymerase for PCR
dNTPs (100 mM solutions) Thermo Scientific R0181 Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP
NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometer for determination of DNA concentration
Qubit Fluorimeter Life Technologies Qubit® 3.0 Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration
2200 TapeStation System Agilent G2964AA Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution
MiSeq Illumina SY-410-1003 Used for NGS

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रेट्रोवायरल एकता स्थलों की प्रवर्धन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और जीनोमिक डीएनए का मिलान
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Serrao, E., Cherepanov, P., Engelman, A. N. Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (109), e53840, doi:10.3791/53840 (2016).More

Serrao, E., Cherepanov, P., Engelman, A. N. Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (109), e53840, doi:10.3791/53840 (2016).

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