Abstract
Retrovirus utstillingen signatur integrerings preferanser på både lokalt og globalt plan. Her presenterer vi en detaljert protokoll for (1) generasjon av ulike biblioteker av retrovirale integrasjons nettsteder som bruker ligation-mediert PCR (LM-PCR) forsterkning og neste generasjons sekvensering (NGS), (2) å kartlegge genomisk plasseringen av hver virus- vert knutepunkt ved hjelp av BEDTools, og (3) å analysere dataene for statistiske relevans. Genomisk DNA ble ekstrahert fra infiserte celler er fragmentert ved spaltning med restriksjonsenzymer eller ved ultralydbehandling. Etter passende DNA-ende-reparasjon, blir dobbelt-trådet linkere ligeres til DNA-endene, og delvis nestet PCR blir utført ved anvendelse av primere komplementære til både lang terminal gjentagelse (LTR) enden av viruset og ligert linker DNA. PCR-primere bære sekvenser som er nødvendig for DNA-clustering under NGS, nektende kravet til separat adapter ligation. Kvalitetskontroll (QC) blir utført for å vurdere DNA-fragment størrelsesfordeling og tilpasseer DNA inkorporert før NGS. Sekvens utdatafiler filtreres for LTR holdig leser, og sekvensene som definerer LTR og linker blir beskåret bort. Trimmet vertscelle sekvenser tilordnet et referansegenom ved hjelp BLAT og filtreres for minimalt 97% identitet til et unikt sted i referanse genomet. Unike integrasjons nettsteder er gransket for tilstøtende nucleotide (nt) sekvens og distribusjon i forhold til ulike genomiske funksjoner. Ved hjelp av denne protokollen, kan integrasjonssete biblioteker med høy kompleksitet være konstruert av genomisk DNA i tre dager. Hele protokollen som omfatter eksogen viral infeksjon av mottagelige vevskulturceller til integreringssete analyse kan derfor gjennomføres i omtrent en til to uker. Nye anvendelser av denne teknologien gjelder for langsgående analyse av integrasjons nettsteder fra HIV-infiserte pasienter.
Introduction
Integrasjon av viral DNA (vDNA) inn i vertscellegenomet er et viktig trinn i den retroviral livssyklus. Integrering oppnås ved viral enzymet integrase (IN), som utfører to forskjellige katalytiske prosesser som fører til opprettelsen av stabilt innsatt provirus 1. IN-subenheter i inngrep med endene av den lineære vDNA som er generert ved revers transkripsjon, som danner den høyere ordens intasome med vDNA ender holdt sammen av en IN multimer 2-4. IN spalter 3 'endene av vDNA nedstrøms fra invariante 5'-CA-3' sekvenser i en prosess kjent som 3'-behandling, og etterlater forsenket 3'-endene med reaktive hydroksylgrupper ved hver vDNA terminus 5-8. Den intasome blir deretter importeres inn i kjernen som en del av en stor samling av vert og virusproteiner som er kjent som den preintegration kompleks (PIC) 9-11. Etter møte med mobil target DNA (tDNA), bruker i vDNA 3'-hydroksyl groups for å spalte tDNA øverste og nederste tråder i en forskjøvet måte, og samtidig slutter seg til vDNA til tDNA 5 'fosfatgruppene gjennom prosessen fra å overføre 12,13.
Retrovirus utstillings integrering språk preferanser på lokalt og globalt plan. Lokalt, konsensus integrering nettsider består av svakt konserverte palindromic tDNA sekvenser som spenner fra omtrent fem til ti bp oppstrøms og nedstrøms fra vDNA innstikk 14,15. Globalt retrovirus målrette bestemte kromatin merknader 16. Det er sju forskjellige retroviral genera - alpha gjennom epsilon, Lenti, og spuma. De lentiviruses, som inkluderer HIV-1, favorisere integrasjon innenfor likene av aktivt transkriberte gener 17, mens gammaretroviruses fortrinnsvis integreres i transkripsjonsstartsider (TSSs) og aktive enhancer regioner 18-20. I skarp kontrast er spumavirus sterkt forutinntatt mot heterochromtiske regioner, slik som genet fattig lamina-forbundet domener 21. Lokale tDNA basis preferanser er i stor grad styrt av spesifikke nettverk av nucleoprotein kontakter mellom IN og tDNA 13,22,23. For lentiviruses og gammaretroviruses, integrasjon i forhold til genomisk merknader er i stor grad styrt av interaksjoner mellom IN og beslektede cellulære faktorer 24-27. Endre detaljene i IN-tDNA interaksjon nettverk 13,22,23,28 og forstyrre eller re-engineering IN-vert faktor interaksjoner 25-27,29-32 er påvist strategier for å målrette videre integrasjon på de lokale og globale nivåer, henholdsvis.
Kraften av DNA-sekvensering prosedyrer som brukes til å katalogisere retrovirale integrasjons nettsider har økt voldsomt de siste tiårene. Integrasjons steder ble gjenvunnet i banebrytende arbeid med arbeidskrevende rensing og manuelle kloningsteknikker for å gi bare en håndfull av unike nettsteder per studie 33,34.Kombinasjonen av LM-PCR forsterkning av LTR-verts DNA veikryss med evnen til å kartlegge individuelle integrerings områder som menneske mus utkast genomer forvandlet feltet, med antall steder utvinnes fra eksogene vev kultur celle infeksjoner øker til flere hundre til tusen 17 18. Den nyere kombinasjon av LM-PCR med NGS metodikken har sendt bibliotek dybde skyrocketing. Spesielt pyrosekvensering ga i størrelsesorden titusenvis av unike integrasjonssider 30,35-38, mens bibliotekene sekvensert ved bruk av DNA clustering kan gi millioner av unike sekvenser 19-21,39. Her beskriver vi en optimalisert LM-PCR protokoll for å forsterke og sekvenseretrovirale integrasjons nettsteder som bruker DNA clustering NGS. Fremgangsmåten inkorporerer kreves adaptersekvenser inn i PCR-primerne og dermed direkte inn i de amplifiserte DNA-molekyler, og derved utelukker behovet for en ytterligere adapter ligation trinn før Sekvenscing 40. Den bioinformatiske analyse rørledning fra analyseringen av rå sekvense data for LTR-vert DNA veikryss til kartlegging av unike integrasjons nettsider for å relevant genomiske funksjoner, er også generelt beskrevet. I henhold til prioritet etablert fra tidligere kjente metodeprotokoller på dette felt 36,38,41-43, kan definerte skript bli utviklet for å hjelpe til fullføring av spesifikke trinn i bioinformatikk rørledningen. Anvendeligheten og følsomheten til protokollen er illustrert med representative data, ved å forsterke, sekvensering, og kartlegging av HIV-1-integrasjons områder fra vevskultur-celler infisert med tilnærmet multiplisitet av infeksjon (MOI) på 1,0, så vel som en titrering serie av dette DNA fortynnet gjennom uinfiserte cellulært DNA i 5-ganger trinn til et maksimum fortynning på 1: 15625 for å gi den omtrentlige ekvivalente MOI på 6,4 x 10 -5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generer Virus Stocks
Merk: Et flytskjema av den våte benken aspekt av denne protokollen er vist i figur 1. Detaljene ved viral lager produksjon og påfølgende infeksjon av vevkulturceller vil generelt gjelde for forskjellige typer av retrovirus.. For noen eksperimenter, kan målcellen ikke uttrykker endogen viral reseptor (er), og i slike tilfeller konstruksjonen av pseudotyped retroviruspartikler som bærer heterologe virale kappe-glykoprotein, for eksempel G-glykoproteinet fra vesikulær stomatitt-virus (VSV-G), vil det bli kreves for infeksjon 44,45.
Merk: Forholdsregler bør tas når du arbeider med HIV-1. Selv om spesifikke retningslinjer vil variere fra institusjon til institusjon, bør alle virus basert arbeid utføres på en dedikert, operatør begrenset biologisk sikkerhetskabinett (vanligvis referert til som en vev kultur hette). Riktig personlig verneutstyrsom inkluderer ansiktsbeskyttelse, skoovertrekk, en dobbel hanske lag, og en full-body kjeledress drakt Det skal til enhver tid. Alt flytende avfall fra virusrelaterte eksperimenter bør bli inaktivert med blekemiddel (10% endelig konsentrasjon), og alt avfall inklusive faste stoffer skal autoklaveres før tømming.
- En dag før transfeksjon, plate 3.3 x 10 6 HEK293T celler i 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin (10000 U / ml stamløsning) i hver av fem 100 mm skåler.
Merk: Supplert-DMEM omtales som DMEM-FPS fra dette punktet. - På den påfølgende dag, transfektere cellene med 10 pg av plasmid som bærer full-lengde retrovirale molekylære kloner eller 9 ug konvolutt-slettede single-round vektorer med 1 ug av et VSV-G ekspresjonskonstruksjon anvendelse av kommersielt tilgjengelige transfeksjon reagenser eller kalsiumfosfat.
- Inkuber calen ved 37 ° C i en fuktig cellekulturinkubator med 5% CO 2 (denne tilstanden heretter referert til som "vevsdyrkningsinkubator"). Etter ca 48 timer, høste virusholdige cellemateriale ved hjelp av en volumetrisk pipette og passerer det gjennom et 0,45 mikrometer filter av tyngdekraften flyt.
- Konsentrer viruset ved ultrasentrifugering ved 200.000 xg i 1 time ved 4 ° C. Resuspender virus-pelleten i 500 pl DMEM-FPS inneholdende 20 U DNase, og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
Merk: DNase trinnet bidrar til å redusere utvinningen av uønskede plasmid-sekvenser ved å eliminere hovedtyngden av plasmid DNA som vedvarer fra transfeksjon prosedyren.
- Bestem p24 konsentrasjon 46 ved hjelp av en HIV-1 p24 antigenerobring kit i henhold til produsentens anvisninger.
Merk: Virus-konsentrasjonen kan også bestemmes ved revers transkriptaseaktivitet assay 47,48. Alternativt kan nivået av funksjonelle virus muligbestemmes ved å måle MOI. Dette blir lettest gjøres ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering med virus som uttrykker fluorescerende reportergener som forbedret grønt fluorescerende protein. MOI beslutning kan være spesielt nyttig når du arbeider med primærceller som ikke støtter den samme grad av infeksjon som er optimalisert cellelinjer.
2. infisere celler med virus
- Plate 3,0 x 10 5 HEK293T celler per brønn i en 6-brønns plate i 2,5 ml DMEM-FPS og inkuber over natten i en vevskulturinkubator.
Merk: Antall unike integrering områder utvinnes med denne protokollen er direkte proporsjonal med antall celler og mengden av aktivt virus som brukes i infeksjonen. - Infisere celler med en endelig viral p24 konsentrasjon på 500 ng / ml i et sluttvolum på 500 ul friskt DMEM-FPS i 2 timer i en vevskultur-inkubator, og deretter tilsett 2 ml DMEM-FPS forvarmet til 37 ° C per brønn og fortsette inkubasjon.
- På48 timer etter infeksjon, fjern mediet og vask av cellene med 2 ml fosfatbufret saltløsning (PBS). Tilsett 0,5 ml trypsin-EDTA forvarmet til 37 ° C, og etter noen sekunder visuelt inspisere brønner for celle løsner.
- Tilsett 2 ml forvarmes DMEM-FPS og resuspender cellene ved forsiktig opp / ned pipettering med en volumetrisk pipette ~ 10 ganger. Overfør løsningen til en 75 cm2 vevskulturkolbe inneholdende 18 ml forvarmet DMEM-FPS, og inkuberes cellene i en vevskulturinkubator.
- Etter minimalt fem dager fra starten av infeksjonen, samle cellene ved å fjerne media, vask med 5 ml PBS, tilsett 2 ml forvarmet trypsin-EDTA, og resuspender med 5 ml forvarmet DMEM-FPS ved pipettering. Sentrifuger løsningen i 5 min ved romtemperatur ved 2 500 xg, og supernatanten kastes.
Merk: Selv om integrering under disse forholdene platåer på ca 48 timer etter infeksjon 49,50, blir ytterligere 3 dager med kultur som kreves for å sufficiently fortynne konsentrasjonen av uintegrerte DNA-molekyler som følge av cellebasert DNA-rekombinasjon eller viral-mediert autointegration. - Utdrag genomisk DNA fra cellepelleten ved å bruke et kommersielt tilgjengelig kit (se for eksempel 51). Eluere DNA fra den medfølgende ionebytter-kolonne med 200 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.
Merk: En porsjon av cellene skal fordeles ved 48 timer etter infeksjon (trinn 2.3) til en infeksiøsitet assay for å sikre riktig virusinfeksjon før NGS.
3. Fragment Genomisk DNA ved ultralydbehandling eller ved restriksjonsenzym Digest
Merk: ultralyd fragmenter genomisk DNA i en tilnærmet sekvens-uavhengig måte og er dermed å foretrekke modus av fragmentering når sekvenserer prøver med en lav forventet utvinningsgrad (f.eks infiserte pasientceller eller infeksjoner initiert ved relativt lav MOI). Videre gir ultralyd en å skille PCR duplikater av et partisielt integrering nettstedet sekvens fra unike integrasjoner på samme sted, noe som er avgjørende for å skille klonal ekspansjon av provirus holdige celler i infiserte pasienter (se trinn 11 nedenfor) 39,52-54.
Merk: DNA må bli spaltet umiddelbart nedstrøms fra oppstrøms LTR for å minske amplifikasjon av interne virale sekvenser under LM-PCR. Restriksjonsenzymet Bglll som ligger 43 bp nedstrøms fra oppstrøms U5 sekvens, og som ikke er kompatibelt for etterfølgende ligering med Msel-genererte DNA-ender virker godt med mange HIV-1-stammer (figur 1B). Ved fremstilling av DNA ved hjelp av ultralydbehandling, bør den innvendige spalte-restriksjonsenzym påføres etter linker ligering (se figur 1C - E og trinn 4.3 nedenfor).
- For ultralydbehandling, bland 10 pg av genomisk DNA i nuklease-fritt vann til et sluttvolum på 120 ul. Sonicate ved hjelp av parametre for en gjennomsnittlig break størrelse på 500 bp (to runder med følgende paramålere: Driftssyklus: 5%; intensitet: 3; sykluser per burst: 200; tid: 80 sek).
- Rens lydbehandlet DNA ved hjelp av en PCR rensing kit. Reparere DNA ender ved hjelp av en DNA-end-reparasjonssett og rense DNA ved hjelp av en PCR rensing kit. A-hale av DNA ved hjelp av Klenow-ekso - enzym og rense den A-tailed DNA ved anvendelse av en PCR-rensesett. Henvis til 51,52 for ytterligere detaljer om kit bruk.
- For restriksjonsendonucleaseoppløsning, kuttet 10 pg av genomisk DNA over natten ved 37 ° C i et volum på 100 ml med buffer levert av produsenten, og en cocktail av enzymer (100 U hver) som genererer 5'-TA overheng, samt en uforenlig enzym slik som Bglll som spalter nedstrøms fra oppstrøms virale LTR. Rens det DNA som den neste dag ved hjelp av en PCR-rensesett.
Bemerk: Ingen av de restriksjonsenzymer skal kuttes i terminalen ~ 30 bp av det virale DNA-enden som er forsterket av LM-PCR protokoll. Denne protokollen forsterker spesielt U5slutten av HIV-1 DNA.
4. gløding Linker Oligonukleotider og ligere til Fragmentert Genomisk DNA
NB: Bland et asymmetrisk linker inneholdende et overheng som er kompatibelt med de ovenfor angitte DNA-fragmenter (se tabell 1 for sekvensene til oligonukleotidene anvendt i denne protokollen). Linkeren som skal brukes sammen med sonikert DNA må inneholde en kompatibel T-3 'overhenget, mens linkeren for Msel-spaltet DNA, må inneholde en kompatibel 5'-TA henget (figur 1). Den korte linker tråd må i tillegg inneholde et ikke-utvidbart kjemisk modifikasjon, slik som 3'-amin, for å begrense de etterfølgende amplifiseringsreaksjoner mot DNA av interesse.
Merk: Når du forbereder flere forskjellige integrasjons språk bibliotekene i parallell og / eller når multiplexing uavhengige utvalg, på samme sekvense løp, er det anbefalt å bruke unike linkere for hver prøve å begrense potensialet for prøvekryss contaminasjon i løpet av PCR. Dette medfører i tillegg bruk av unike linker primere for hver prøve i løpet av semi-nested PCR (beskrevet nedenfor). Unike linker tråder og linker primere kan bli konstruert ved å kryptere linker oligonukleotidsekvenser som er oppført i tabell 1, og samtidig opprettholde liknende total% GC-innhold og gjeldende overheng stillinger.
- Varmebehandlet kort og lang linker tråder i 35 pl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 til 0,1 mM EDTA (sluttkonsentrasjon på 10 pM av hvert oligonukleotid) ved oppvarming til 90 ° C og sakte avkjøling til romtemperatur i trinn på 1 ° C per min.
- Fremstille i det minste fire parallelle ligeringsreaksjoner pr genomisk DNA-prøve, som inneholder 1,5 uM ligert linker, 1 ug fragmentert DNA, og 800 U T4 DNA-ligase i 50 pl. Ligere over natten ved 12 ° C. Rens neste dag med en PCR rensing kit.
- For prøver utarbeidet av ultralydbehandling, fordøye renset ringsreaksjonen med 100 U av en RESTRICsjon enzym som spalter nedstrøms fra oppstrøms LTR (f.eks BglII for HIV-1) under produsentens anbefalte vilkår natten. Rense DNA ved hjelp av en PCR rensing kit.
5. forsterke Viral LTR-Host genomisk DNA trafikkmaskiner ved Semi-nestet PCR
Merk: For å sikre at for optimal bibliotek mangfold, minst 4-8 parallell PCR, avhengig av DNA-konsentrasjonen av den utvunnede ligeringsreaksjonen, bør være forberedt for hver prøve for begge PCR-runder. DNA-templat konsentrasjonen skal kvantifiseres ved hjelp av spektrofotometri. I denne protokollen de første og andre runden av PCR anvender nestede LTR-spesifikke primere, men det samme linker-spesifikk primer brukes for begge runder (tabell 1). Den andre runden LTR-spesifikk primer og linker-spesifikke primer kode adaptersekvenser for DNA-gruppering, så vel som sekvens primer-bindingsseter. Den nestede LTR-spesifikk primer koder også en 6 nt indeksen sekvens, which kan varieres mellom forskjellige primere for multipleksing biblioteker innenfor samme sekvense løp.
- Forbered første runde PCRs inneholder ingredienser per tube som er oppført i Tabell 2.
Merk: Den linker-spesifikke primer havner 22 nt av komplementaritet til linkeren, en smeltetemperatur på 53 ° C, et GC-innhold på 45%, og dens 3'-ende er plassert 15-16 bp oppstrøms fra 3'-termini av de forskjellige linker lange tråder (tabell 1). Den første runden 27 nt LTR primer har en smeltetemperatur på 59 ° C, et GC-innhold på 48%, og dens 3'-ende er plassert 34 bp oppstrøms fra HIV-1 U5 terminus. Området for den andre runden 26 nt LTR primer som er komplementær med HIV-1 LTR har en smeltetemperatur på 60 ° C, et GC-innhold på 50%, og dens 3'-ende er plassert 18 bp oppstrøms fra det virale U5 endestasjonen. Det anbefales at oligonukleotid smeltetemperatur og GC-innhold bør etterligne disse parametrene hvis brukerneMotivet PCR-primere med endrede sekvenser (inkludert for bruk med andre retrovirus) 21. - Kjør første PCR-runde under følgende termo parametere: en syklus: 94 ° C i 2 minutter; 30 sykluser: 94 ° C i 15 sekunder, 55 ° C i 30 sek, 68 ° C i 45 sekunder; en syklus: 68 ° C i 10 min.
- Pool reaksjoner og rense ved hjelp av en PCR rensing kit. Forbered andre runde PCR som inneholder ingredienser per rør som per tabell 3. Kjør den andre runden av PCR ved hjelp av termo parametrene er beskrevet i trinn 5.2. Pool reaksjonene og rense DNA ved hjelp av et kommersielt PCR rensing kit følge produsentens instruksjoner.
Merk: En rekke anbefalte indeks sekvenser som er kompatible med DNA clustering NGS er tilgjengelig 71.
6. Utfør QC og NGS (typisk gjennomført av en Sequencing Facility)
- (QC analyse # 1) Bekreft Trinn 5,3 bibliotek DNA-konsentrasjon ved hjelp av en fluormeter 55. I korthet fremstille standarder og eksperimentelle prøver i et sluttvolum på 200 ul nuklease-fri vann. Vortex-rør i 2-3 sek, inkuber ved romtemperatur i 2 minutter, og deretter lese prøvene i fluorometeret.
Merk: Prøvene bør inneholde en minimumskonsentrasjon på 2 nM bibliotek-DNA i et minimalt volum av 15 ul. - (QC analyse # 2) Bekreft DNA fragment størrelsesfordeling ved hjelp av en tape-baserte analysen 56.
Merk: En ideell fordeling er en relativt bred DNA topp sentrering rundt 500 bp i lengde. Dersom en betydelig mengde materiale som er større enn 1 kb, så er det anbefalt å innlemme et størrelse-utvelgelsesprosedyre for å eliminere lengre DNA-arter, noe som vil vanskeliggjøre bro amplifikasjon under gruppering. Derimot, hvis en betydelig topp er tydelig rundt 100 til 200 bp, en primer-dimer kan ha dannet i løpet av PCR. I dette tilfellet er prosedyren bør optimaliseres for å minimalisere dannelsen av primer-dimerer. - (QC assay # 3) Samtidignfirm riktig inkorporering av adaptere til DNA-biblioteket ved kvantitativ PCR 57.
- Utfør NGS følge produsentens søknad litteratur. Utnytte en topp-in på 10% (vekt / vekt) ΦX174 DNA, som vil optimalisere sanntid Kvalitetsmålet ved å tilveiebringe balansert basesammensetning til sekvense løp.
Merk: Integrasjon nettstedet sekvense eksperimenter er typisk utsatt for enkle enden 150 bp (SE150) eller parvise end 150 bp (PE150) sekvensering. PE150 er spesielt nyttig for å fange opp den linkerfestepunkt på hver DNA-molekyl (for eksempel når gransker integrasjons områder for tegn på vertscelle klonal ekspansjon).
7. Bruk en tilpasset Python eller Perl-skript for å analysere Sekvense Data for LTR inneholder sekvenser, Crop bort LTR og lenke sekvenser, og Kart til Reference Genome med BLAT
- Skann FASTA filer for LTR-holdige sekvens leser, beskjære LTR og lenke sekvenser fra verten genomisk DNA-sekvens, ogeksport av disse sekvenser i et nytt FASTA fil. Kart beskjæres leser både en referanse genom (f.eks menneskelige genom versjoner hg19 eller GRCh38) og viral genom hjelp BLAT 58, med utgang integrasjon nettstedet koordinater eksportert til en separat .txt-fil med følgende innstillinger:
trinnstørrelse = 6, minIdentity = 97, og maxIntron = 0 - Parse BLAT utgangs TXT fil, tar autointegrations (dvs. bevis for at LTR enden er integrert i en indre region av det virale DNA genom) og andre sekvenser tilordning til HIV-1 genomet, og å skape en separat utgang TXT fil i hvilken alle dupliserte integrasjons nettsteder har blitt kondensert til enkle, unike koordinere treff.
8. Lag .bed filer som inneholder 15 Nt intervaller Omkringintegrasjoner, konvertere disse til FASTA filer, og Konstruer Sequence Logoer til Display Base Preferences Rundt Integrasjons nettsteder
- Lag .bed filer som inneholder et intervall på baser forhvert integrering nettsted. Minst 15 baser (5 oppstrøms og 10 nedstrøms) er foreslått for sekvens logo generasjon. Generere en FASTA fil fra disse .bed filer ved hjelp av fastaFromBed funksjon fra BEDTools 59 og denne kommandoen:
fastaFromBed fi / katalog / til / referanse / genom / -name -s-sengs 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
Merk: invariant viral 5'-CA-3 'dinucleotide er sluttet å være vert for DNA under integrasjon, og verifisere krysset av LTR endestasjonen på cellulært DNA er et viktig første filter for å identifisere bona fide integrasjonssider. Vi i tillegg kompilere sekvens logoer fra denne verten DNA sekvens befolkningen til å verifisere de eksperimentelle resultatene. Som retrovirus vise signatur basis preferanser rundt sine integrasjonssider 14,15, sekvens logoer tjene til å bekrefte at de kartlagte genomiske områder oppsto gjennom IN-mediert integrasjon i forhold til andre rekombinasjon mekanismer som ikke-homologe DNAende å bli 60,61. - Bruk WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) for å lage sekvens logoer fra FASTA filer. Klikk "Velg fil" for å laste opp FASTA fil, og bruke følgende innstillinger: Output format, PDF (vektor); Logo størrelse, stor; Først posisjonsnummer, -5; Logo rekkevidde, -5 til 5; Y-aksen skala, 0.1, Y-aksen tic avstand, 0,5, Fargevalg, klassisk (NA).
9. Lag Central basepar .bed filer, se etter Sample krysskontaminering, og kartlegge fordelingen av unike integreringen nettsteder Relativt Relevant Genomisk Funksjoner
- Siden retroviral integrering skjer i en forskjøvet måte over tDNA strenger, justere nøyaktige koordinatene til integrasjons nettsider for å reflektere den sentrale bp over målstedet duplisering for riktig kartlegging av genom fordeling i forhold til genomisk funksjoner.
- Derfor, for 5 bp duplisere virus som HIV-1, opprette en .bed fil med den sentrale bp forskjøvet fra jegntegration stedet av to baser nedstrøms for integrasjoner kartlegging til pluss strand, og to baser oppstrøms for integrasjoner kartlegging til minus strand.
- For å sjekke for prøve krysskontaminering, beregne antall integrasjonssider vanligste blant de forskjellige bibliotekene ved hjelp av BEDTools krysser funksjonen til å krysse midt bp .bed filer i to forskjellige prøver og ved å følge denne kommandoen:
bedtools skjærer -a central_basepair_1.bed -b central_basepair_2.bed -f 1.00 -r -s> overlap1v2.txt - Tell antall linjer innen utgangen overlap1v2.txt fil for å kvantifisere nøyaktig antall områder vanlige blant de to bibliotekene ved hjelp av følgende kommando:
wc -l overlap1v2.txt - Last ned RefSeq merknaden .bed filen for den versjonen av referansen genomet som ble brukt for integrering nettstedet kartlegging fra UCSC Genome Kommentar Database (f.eks http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/daLageret) 62.
- Beregn antall integrasjons områder som faller innenfor RefSeq gener ved hjelp av BEDTools krysser funksjon for å krysse den sentrale basepar .bed filen som ble generert for prøven med RefSeq .bed filen følgende kommando:
bedtools skjærer -a central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
- Beregn antall integrasjons områder som faller innenfor RefSeq gener ved hjelp av BEDTools krysser funksjon for å krysse den sentrale basepar .bed filen som ble generert for prøven med RefSeq .bed filen følgende kommando:
- Tell antall linjer innen utgangen RefSeq_sample1.bed fil for å kvantifisere den eksakte antallet nettsteder som faller i RefSeq gener ved hjelp av følgende kommando:
wc -l RefSeq_sample1.bed - Gjenta trinn 9.3 og 9.4 for kartlegging integrasjons nettsteder til noen annen annotering av interesse som et intervall .bed filen er tilgjengelig. Last ned den nyeste CpG island annotering .bed fil for referansegenom interesse fra UCSC Genome merknad Database som anvist i trinn 9.4.
- Beregn antall integrasjons områder som faller innenfor en viss distilling (vist i dette eksempel er et 5 kb vindu) av CpG øyene ved hjelp av BEDTools vindusfunksjon og følgende kommando:
bedtools vindu -w 2500 central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed
- Beregn antall integrasjons områder som faller innenfor en viss distilling (vist i dette eksempel er et 5 kb vindu) av CpG øyene ved hjelp av BEDTools vindusfunksjon og følgende kommando:
- Tell antall linjer innen utgangen CpG_sample1.bed fil for å kvantifisere nøyaktig antall områder som faller innenfor 2,5 kb oppstrøms eller nedstrøms av CpG øyer ved å bruke følgende kommando:
wc -l CpG_sample1.bed - Gjenta trinn 9.6 og 9.7 for kartlegging av integrerings områder i nærheten TSSs. Generere en alternativ versjon av RefSeq.bed fil, hvor genomisk koordinerer kartlegging til mer enn ett gen er justert for å reflektere bare et enkelt gen til stede på den posisjonen. Dette hindrer overvurdering av genet tetthet rundt integrering nettsteder. Beregn genet tettheten i en Mb regionen rundt hvert integrering område ved hjelp av BEDTools vindu funksjon og følge denne kommandoen:
- Beregne gjennomsnittlig genet tetthet for alle integrasjoner i datasettet ved å følge denne kommandoen:
awk '(sum + = $ 7) END (print "Average =", sum / NR)' GeneDensity_sample1.bed
10. Statistisk sammenligning Integrasjon Nettsteds Fordelinger blant Prøver å bruke to-tailed Fishers Exact Test og Two-tailed Wilcoxon Rank Sum Test i R
Merk: Bruk Fishers eksakte test for å sammenligne andelen av integrasjons områder innenfor RefSeq gener eller innenfor et vindu av CpG øyer eller TSSs, men bruke Wilcoxon rank sum test for sammenligning av fordelingen i genet tetthet som omgir integreringssteder. R Programmet er tilgjengelig på http://www.r-project.org/.
To-tailed Fishers eksakte test:
- Bruke tallene beregnet som beskrevet i trinn 9.4 og 9.7, create matriser for hver sammenligning i R observerte forekomster (integrasjoner innenfor en merknad eller innenfor et vindu rundt en merknad) versus rester nettsider ved å følge denne kommandoen:
(Annotation_of_interest <- matrise (c (SampleA # i, gjenværende SampleA #, SampleB # i, gjenværende SampleB #), nrow = 2, dimnames = liste (c ( 'senter', 'Rest'), c ( 'SampleA', 'SampleB')))) - Beregn P-verdi for sammenligning av to-tailed Fishers eksakte test med følgende kommando:
fisher.test (annotation_of_interest, alternativ = 'two.sided') $ p.value
To-tailed Wilcoxon rank sum test: - Opprett en tabulatordelt txt-fil hvor hver kolonne inneholder prøven navn i den øverste cellen, etterfulgt nedenfor ved verdier gense tetthet for alle integrasjons områder i det biblioteket (hentet fra .bed fil generert i trinn 9.9). Importere denne tabulatordelt txt-fil inn i R ved hjelp av følgende kommando og navigating til riktig fil katalogen:
FILNAVN <- as.data.frame (read.delim (file.choose (), header = T, check.names = USANN, fylle = TRUE, sep = ' t')) - Beregn P-verdi for sammenligning av to-tailed Wilcoxon rank sum test med følgende kommando:
wilcox.test (NAME $ SampleA, filnavn $ SampleB, alternative = 'two.sided ", sammen = F, nøyaktige = T) $ p.value
Merk: P-verdier kan beregnes bare ned til et visst (ekstremt lav) grense i R, hvoretter null vil bli returnert av programmet. For massivt forskjellige prøver som gir en P = 0 i R, anslå P-verdi som <2,2 x 10 -308.
11. Undersøk Raw Sekvense Data for Bevis på klonal ekspansjon av celler som inneholder Integrert Viral DNA
Merk: En liten potensial for mer enn en integrering på nøyaktig samme nt i referanse genomet. Alternativt kan en singel iintegrering arrangement kan bli redundant til stede i sekvenseringsdataene på grunn av bruk av PCR under bibliotek fremstillingen og / eller ved hjelp av celle duplisering før DNA-preparat. Nye analyser av genomisk DNA fra HIV-infiserte pasienter har preget disse mulighetene ved å identifisere unike ultralydskjærpunkter / linker festepunktene (som bare kan oppstå før PCR) innen DNA-sekvenser som inneholder identiske integrasjonssider 52-54. Det er for tiden en debatt om hvorvidt provirus næret innen clonally utvidet celler bidra til latent viral reservoaret, og dermed er det av spesiell interesse å karakterisere deres nivå av ekspansjon når studere integrering steder i menneskelige pasienter.
- I likhet med fremgangsmåten som er oppført i trinn 8.1, generere .bed filer med lister over et intervall på baser som strekker seg, i dette tilfellet 25 nt nedstrøms fra hver unike integreringssete (oppstrøms baser er unødvendig her). Generere en FASTA fil fra disse .bed filer (som beskrevet iTrinn 8.1) ved hjelp av fastaFromBed funksjon fra BEDTools og følge denne kommandoen:
fastaFromBed fi / katalog / til / referanse / genom / -name -s-sengs 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
Merk: For å forbedre spesifisiteten til hvert søk, anbefales det å trekke minst 25 nt nedstrøms fra hver integrering stedet for klonal ekspansjon analyser. - Helst bruker en tilpasset manus, søke på rå sekvens data FASTA fil for alle strenger som inneholder en eksakt match til 25 nt nedstrøms fra hver unike integrering området, og sette disse sekvensene inn i en ny fil. Trim LTR og lenke sekvenser fra rå strenger. Flett PE sekvens leser ved å konvertere leser til det motsatte komplement, trimming LTR og lenke sekvenser, og deretter tildele read2 strenger til deres read1 par hvis strengene deler minst 20 overlapp nt.
- Skann linker festepunkter i hver integrasjons nettstedet blokk. Klassifisere hver integrasjon som "clonally utvidet &# 34; hvis linker festepunkter er ≥3 bp hverandre.
Merk: En protokoll for klonal ekspansjon analyse uten sammenslåing sekvens leser har blitt beskrevet 52.
Merk: Fragmentering av genomet på nøyaktig samme sted ved ultralydbehandling fører til en undervurdering av omfanget av klonal ekspansjon, og fremgangsmåter for å korrigere de resulterende eksperimentelle forspenningen er blitt beskrevet 63,64.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 4 viser resultatene av et representativt eksperiment for å illustrere sensitiviteten av NGS for gjenvinning av integrasjons områder fra en kultur av infiserte celler. Uinfiserte cellulær DNA ble benyttet til å fortynne serielt genomisk DNA fra en infeksjon hvori hver celle i gjennomsnitt inneholdt en integrasjons 40. Fortynninger ble fremstilt i trinn på fem til en maksimal fortynning på 1: 15625. Genomisk DNA i titreringen serie ble så fragmentert ved ultralydbehandling eller ved spaltning med restriksjonsendonukleaser Msel og Bglll, fulgt av LM-PCR. Antallet av unike integrering områder, så vel som antall steder kartlegging proksimalt til utvalgte genomiske anmerkninger, ble beregnet i henhold til ovennevnte protokoll. Dataanalyse avslørte dusinvis av unike integrasjonssider (1-2% av beløpet utvinnes fra ryddig genomisk DNA) utvinnes fra biblioteker fremstilt fra cellene der i teorien eneste i 15625 ble smittet. Ved analyse av integreringssete datasett, er det avgjørende å sammenligne dataene til et matchet sett av tilfeldige genomiske områder, noe som kalles en matchet tilfeldig kontroll eller MRC. Som representative resultater skåret genom-DNA ved hjelp av restriksjonsenzymkutting eller ved ultralydbehandling, ble to forskjellige MRC-datasett konstruert. MRC Enz inneholdt 50.000 unike genomisk nettsider generert av tilfeldig valg av områder fra hg19 i nærhet til områder av MseI og Bglll restriksjonsenzym fordøyelsen, mens MRC tilfeldige næret 10.000 nettsider generert uten normalisering for avstand fra satt genomiske markører. Bare de områder som kan tilordnes tilbake til en unik genomisk sted som skal brukes i MRC datasett. Som ultralyd saks genomisk DNA hovedsak fri rekkefølge bias, kan MRC tilfeldig bli sett på som mer aktuelt å datasett produsert av fragmentering av DNA ved ultralydbehandling. Et alternativ stil av kontroll integreringområde datasett kan dannes in vitro ved omsetning av rekombinant protein, intasome nukleoprotein komplekset 21, eller PICs ekstrahert fra akutt infiserte celler 17 med avproteinisert genomisk DNA, og deretter følge LM-PCR og NGS protokoller 21.
P-verdier for sammenligning av fordelingen av integrasjons områder gjenvunnet ved ultralydbehandling i forhold til restriksjonskutting (sammenligning er mellom de pene prøvene), så vel som for sammenligning med MRC enz og MRC tilfeldig, er vist i figur 2. Fordelingen av integrasjons områder gjenvunnet følgende ultralyd var lik de utvinnes ved restriksjonsenzym fordøye for alle kommentarer undersøkt, med størst variasjon tydelig i form av nærhet til CpG øyer. Som forventet 18,65 begge datasett skilte seg vesentlig fra de MRCS i form av integrasjoner innen RefSeq gener og gen density rundt gjennomsnittet integrering stedet, mens begge datasett var lik MRCS i form av distribusjon i forhold til CpG øyer og TSSs. Siden relativt få HIV-1-integrasjonssider kart innenfor 2,5 kb av et CpG øy eller TSS, noe som øker det totale antall områder utvinnes er egnet til å redusere variabiliteten som kan oppstå mellom datasett (tabell 4 og figur 2). Sekvens logoer for å bekrefte ektheten av integrasjon nettsteddata er vist i figur 3. Konsensus HIV-1 integrasjon nettstedet 14,22 (-3) TDG (G / V) TWA (C / B) CHA (7) ( skrevet med International Union of Biochemistry basiskoder, backslash indikerer plasseringen av vDNA pluss-strand delta, og understrekingen indikerer 5-bp sekvensen dupliseres etter HIV-1 integrasjon og DNA-reparasjon) er åpenbar for bibliotekene utarbeidet av begge fragmentering teknikker, selv om den grad av sikkerhet avtar med økende fortynning av infiserte celleDNA. De tilfeldige steder justert fra MRC datasettet derimot ikke klarte å generere betydelige nivåer av basis preferanser.
Figur 1:. Flytskjema Illustrasjon Integrerings- nettstedet bibliotek Forberedelser (A) generere virus aksjer ved trans HEK293T celler, høsting og filtrering supernatanten 48 timer senere, konsentrere av ultrasentrifugering, og infisere målceller med passende konsentrasjon av virus. Minst fem dager etter infeksjon, trekke genomisk DNA. Se §§ 1 og 2 i hovedteksten for flere eksperimentelle detaljer. (B og C) fragment ble renset genomisk DNA ved kutting med restriksjonsenzymer eller ved ultralydbehandling. Restriksjonsenzym cocktail bør inneholde et enzym (f.eks BglII) som spalter nedstrøms fra oppstrøms viral LTR å motvirke-select for LM-PCR forsterkning av interne vDNA sekvenser. Grønn stjerne og forgrenede pilen i (C) betegne at Bglll bør påføres etter linker ligering. Røde høydepunkter viral sekvens, mens svart høydepunkter vert mobil sekvens. Implisitt DNA brytepunkter (ikke i målestokk) er merket med "X" HIV-1 inneholder mange Msel og Bglll områder; bare de som er relevante til protokollen er vist. Konsollene over kartene betegne U5-cellulær DNA-områder fortrinnsvis forsterket av LM-PCR. (D) Rens fragmentert DNA (da ende-reparasjon og A-hale i tilfellet av ultralydbehandling) og ligere til (E) som er kompatible asymmetriske linkermolekyler (farget blå). Magenta sirkler i (D) indikerer integrasjons område som vil bli forsterket. Stjernene i 3'-endene av de korte linker trådene betegne aminosyrene blokkerende modifikasjoner. (F) Gjennomføring første runde av semi-nested PCR ved anvendelse av første runden LTR primer (rød) og linker-primeren (blå). i tsin PCR-runde, koder for linkeren primer for DNA clustering og NGS primer bindingssekvenser (gruppert som en grønn vedheng til den blå linker primeren), mens den LTR primeren mangler slike sekvenser. (G) Rens første runde PCR produkt og gjennomføre andre runde av semi-nestet PCR. I denne runden av PCR, bruke samme linker primer som i første runde (blå + grønn vedheng), sammen med den andre runden LTR primer (rød) som bærer DNA clustering og NGS primer bindende sekvenser samt en strekkode for multipleksing ( gruppert som en grønn vedheng til den røde LTR primer). (H) Rens andre runde PCR-produktet som det endelige integrering nettstedet bibliotek (eske i magenta, med integrasjon stedet preget av magenta sirkel). Send delmengde til sekvensering anlegg for QC og NGS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. P-verdier for sammenligning av Integrasjons nettsteder Amplified Etter DNA fragmentering ved ultralydbehandling eller ved restriksjonsenzymspaltning versus Respektive MRCS Numbers av integrasjons områder innen RefSeq gener og nærliggende CpG øyer og TSSs, samt regionale genet tetthetsprofiler, oppført i . Tabell 4 P-verdier ≥0.05 er uthevet med fet og kursiv tekst en P-verdier beregnet av Fishers eksakte test b P-verdier beregnet av Wilcoxon rank sum test c MRC Enz:... matchet tilfeldig kontroll; et sett av 50.000 unike integrasjonssider ble produsert av tilfeldig velge posisjoner i nærhet til MseI / Bglll restriksjonssetene i hg build 19. d MRC tilfeldig: matchet tilfeldig kontroll med 10.000 unike integrasjonssider produsert av tilfeldig selecting stillinger i hg19 uten normalisering til restriksjonssetet nærhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sekvens Logos viser HIV-1 Base Valg fra Representative Experiment biblioteker Integrasjons nettsteder fra biblioteker utarbeidet av (A) fordøyelse med restriksjonsenzymer eller (B) lydbehandling ble justert ved hjelp WebLogo programvare.. Hver fortynning i titreringen serien er avbildet, fra ryddig DNA ved toppen av figuren til den maksimale fortynning på 1: 15625 i bunnen. (C) Sekvens logo for MRC på 50.000 unike genomisk nettsider. Feilfelt hovedsak representerer standardavviket i basen innlemmelse i en bestemt posisjon. Mer spesifikt, totalt høyden av hvert feilfelt som tilsvarer det dobbelte av lite utvalg korreksjon 66, som kontrollerer for undervurdering av entropi til stede i relativt små datasett. X-aksen representerer vertscelle genomisk DNA nt posisjoner i forhold til stedet for integrering på nullpunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Tabell 1: oligonukleotidsekvenser for Linker Bygg og PCR Amplification Linker spesifikke og andre runde LTR primere kode DNA clustering adapter sekvenser, som er fargekodet slik: svart, baser utfyllende til linker eller til HIV-1 LTR; rød, entydig indeks eller strekkode; grønn, sekvense primer bindingssteder; blå, adaptere sekvenser for DNA clustering. Single-end (SE) sekvense reactions vil utnytte sekvense primer som hybridiserer til andre runde LTR primer read1 (grønn) sekvens, mens paret-end (PE) reaksjoner vil bruke begge (read1 og read2) sekvenseringsprimere. en linker korte tråder inneholder 3 'amino blokkerer modifisering. klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
| reagens | Å Legg per Reaction |
| First Round LTR primer (15 mm): | 2,5 mL |
| Linker spesifikk primer (15 mm): | 0,5 ul |
| 10x PCR buffer: | 2,5 mL |
| dNTP (2,5 mM hver) | 0,5 ul |
| DNA polymerase mix: | 0,5 ul |
| Ligation reaksjon: | 100 ng |
| Nukleasefritt vann: | opp til 25 ul |
Tabell 2:. Resept for første runde PCR Mengden av hver angitte reagens som skal tilsettes til hver individuelle PCR-rør er indikert.
| reagens | Å Legg per Reaction |
| Andre runde LTR primer (15 mm): | 2,5 mL |
| Linker spesifikk primer (15 mm): | 0,5 ul |
| 10x PCR buffer: | 2,5 mL |
| dNTP (2,5 mM hver) | 0,5 ul |
| DNA polymerase mix: | 0,5 ul |
| Første runde PCR: 100 ng | |
| Nukleasefritt vann: | opp til 25 ul |
Tabell 3:. Andre runde PCR Oppskrift Mengden av hver reagens som skal tilsettes til hvert PCR-rør er indikert.
| Bibliotek | #Unique nettsteder | % RefSeq en | % CpG +/- 2,5 kb b | % TSS +/- 2,5 kb c | Nr. Gene Tetthet +/- 500 kb d |
| Lydbehandling, ryddig | 3169 | 71.2 | 5.1 | 3.7 | 15.8 |
| Ultralydbehandling, 1: 5 | 366 | 75,1 | 2.7 | 3 | 16,3 |
| 254 | 74 | 7.1 | 5.1 | 16,7 | |
| Ultralydbehandling, 1: 125 | 430 | 69.8 | 6.9 | 6 | 14.6 |
| Ultralydbehandling, 1: 625 | 314 | 65.6 | 5.6 | 6.7 | 13.5 |
| Lydbehandling, 1: 3125 | 116 | 73.6 | 3,5 | 2,5 | 13.1 |
| Ultralydbehandling, 1: 15625 | 72 | 62,5 | 0 | 1.4 | 14.7 |
| Digest, ryddig | 7428 | 69.8 | 3.6 | 2.9 | 15.2 |
| Digest, 1: 5 | 1460 | 71,4 | 4.4 | 3.4 | 14.9 |
| Digest, 01:25 | 394 | 68.8 | 4.3 | 3.3 | 15.8 |
| 172 | 71 | 0 | 3 | 14 | |
| Digest, 1: 625 | 134 | 73,9 | 3.7 | 3.7 | 14.1 |
| Digest, 1: 3125 | 100 | 83.1 | 6.4 | 5.2 | 19.1 |
| Digest, 1: 15625 | 73 | 74 | 4.1 | 1.4 | 9.7 |
| MRC Enz e | 50000 | 44.7 | 4.2 | 4 | 8.7 |
| MRC tilfeldig f | 10000 | 41.3 | 5.3 | 4.2 | 8.6 |
Tabell 4: Genomisk Fordeling av Integrasjons nettsteder fra Representant Titrering Series Andelen av totale integrasjonssider th.ved fall i løpet av RefSeq gener, b innen 2,5 kb av CpG øyer, og c innenfor 2,5 kb TSSs d Genet tetthet innen 1 Mb rundt gjennomsnittet integrasjon nettstedet e MRC Enz.. matchet tilfeldig kontroll; et sett av 50.000 unike integrasjonssider ble produsert av tilfeldig velge posisjoner i nærhet til MseI / Bglll restriksjonssetene i hg19 f MRC tilfeldig. matchet tilfeldig kontroll med 10.000 unike integrasjonssider produsert av tilfeldig velge posisjoner i hg19 uten normalisering til faste stillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En protokoll for analyse av retrovirale integrasjons områder, fra den initiale virus infeksjon trinn gjennom kartlegging av genomiske fordelingsmønstre, er beskrevet. Denne protokollen er anvendelig til en hvilken som helst retrovirus, og en hvilken som helst infiserbare celletype. Videre er analysen rørledningen ganske følsom, med mulighet for å utvinne et tilfredsstillende antall unike integrering områder fra seriefortynninger av genomisk DNA som tilsvarer en infeksjon initiert med en MOI på 6,4 x 10 -5. Denne følsomhet gjør protokollen spesielt nyttig når den anvendes på prøver fra infiserte pasienter som kan inneholde en lav virusbelastning, hvor bare en liten fraksjon av cellene vil huse en integrert provirus. I samsvar med tidligere metodikk papirer på dette feltet 36,38,41-43, vil flere trinn i bioinformatikk del av denne protokollen dra nytte av utviklingen av tilpassede skript for behandling av store filer av sekvensdata. Mens BLAT 58 er maPPING verktøyet beskrevet i denne protokollen, kan brukere finne Bowtie 67 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) til å være et passende alternativ.
Et alternativ bioinformatikk rørledningen ble nylig rapportert for bestemmelse av Moloney murine leukemia virus (MoMLV) integrasjonssider 19. Det rørledningen er nyttig ved at det ble utviklet til frittstående programvare som er offentlig tilgjengelig, og er ganske kraftig i at det opprinnelig ble brukt til å kartlegge hundretusener av unike MoMLV integrasjonssider. Men den tilgjengelige programvaren ble opprinnelig utviklet for å spesifikt re-analysere rapporterte MoMLV datasettet, og så omprogrammere ville være nødvendig å tilpasse rørledningen for å veksle eksperimentelle design (funksjonalitet i verktøyet ble nylig utvidet til å omfatte adeno-assosiert virus og Tol2 og ac / Ds transposon vektorer 68). Videre at protokollen beskrev generasjon av den foreløpige integrering nettstedet .bedfil, men ikke legge ut konkrete tiltak som er nødvendige for å kartlegge områder til relevant genomiske merknader. Leserne kan finne "Vector Integration Nettstedet Analysis" server 69, som ble utgitt under gjennomgang av dagens manuskript, nyttig å analysere NGS sekvenser generert ved hjelp av protokollen beskrevet her.
Enkelte punkter bør vektlegges når du bruker en protokoll for å analysere retrovirale integrering språk datasett. Når du forbereder flere biblioteker i tandem, finnes et betydelig potensial for prøve krysskontaminering. Selv en meget liten grad av prøven krysstale kan skjule resultatene til nivået gjengi et NGS løpe ubrukelig. Derfor bør all våt-benk arbeidet være ferdig i en sterilisert, dedikert laminær hette eller PCR arbeidsstasjon. Et sett med pipetter og reagenser som nukleasefritt vann skal være dedikert utelukkende til integrering nettstedet forsterkning. Bruken av unike linkere for hvert bibliotek preparat kan begrense den potensiellefor kryss-forsterkning og også gi rom for identifikasjon av crossover leser innenfor hvert bibliotek i rå FASTA filer.
Det er viktig å vurdere fordeler og ulemper ved bruk av ultralyd versus restriksjonsendonucleaseoppløsning å fragmentere genomisk DNA. På den ene side gir sonikering en forholdsvis tilfeldig fordeling av skjærpunkter, men de etterfølgende nødvendige DNA-reparasjon og A-tailing trinn gående redusere utbyttet av linkerligeringsprodukter i forhold til ligeringer utføres med restriksjonsenzym-genererte klebrige ender. På den annen side, gir restriksjonsenzymspaltning en mindre utbetalt populasjon av skjærpunkter, noe som alltid vil introdusere noen skjevhet i de gjenopprettede data. Ved å benytte en restriksjonsendonuklease for å forkaste oppstrøms LTR-sekvenser vil i begge tilfeller (figur 1) resultere i tap av en liten brøkdel av integrasjons områder som ligger oppstrøms for det området i genomet. Eventuelle data skjevhet som kan føre kan være annonsekledd ved å utelate den enzymatiske fordøyelsen fra protokollen under biblioteket forberedelse og filtrere ut de mange resulterende oppstrøms LTR sekvenser fra sekvenseringsdata.
Selv om den nåværende protokollen er ganske følsom og i stand til å generere millioner av unike integrasjonssider 21,40, bare om lag en tredjedel av alle tilgjengelige integrasjoner kan forventes å bli forsterket i et gitt eksperiment selv med det beste av biblioteket preparater (ref. 70 og upubliserte observasjoner). Dette kan føre til komplikasjoner ved analyse av prøver fra lave MOI infeksjoner eller pasienter som havn lav virusmengde. Denne begrensning kan overvinnes delvis ved gjentatte ganger å sekvensere det samme bibliotek fremstillingen og / eller sekvensering av flere biblioteker avledet fra den samme DNA-prøven i parallell. Fremtidige økninger i analysen sensitivitet vil derfor være svært gunstig for å fremme translasjonsforskning anvendelser av retroviral integrering nettstedet sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for at våre kolleger Stephen Hughes og Henry Levin for råd som var avgjørende for å etablere NGS protokollen for retroviral integrering nettstedet sekvensering i Engelman lab. Dette arbeidet ble støttet av amerikanske National Institutes of Health gir AI039394 og AI052014 (til ANE) og AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-084 | Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | Antibiotics to be added to DMEM |
| Phosphate-Buffered saline | Mediatech | 21-040-CV | Used to wash cells |
| Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CI | Used to detach adherent cells from tissue culture plates |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | DNA transfection reagent |
| 0.45 µm Filters | Thermo Scientific | 09-740-35B | Used to filter virus particle-containing cell culture media |
| Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks |
| HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Used to quantify yield of virus production |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | Used to purify genomic DNA from cells |
| Sonicator | Covaris | S2 | With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec |
| Nuclease-Free Water | GeneMate | G-3250-125 | Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination |
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Used to purify DNA during library construction |
| End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples |
| Klenow Fragment (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments |
| dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
| MseI | NEB | R0525L | Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage |
| BglII | NEB | R0144L | Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202L/6218 | Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends |
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | custom | Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Commercial mix containing DNA polymerase for PCR |
| dNTPs (100 mM solutions) | Thermo Scientific | R0181 | Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer for determination of DNA concentration |
| Qubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit® 3.0 | Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration |
| 2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Used for NGS |
References
- Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890 (2012).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464, 232-236 (2010).
- Hare, S., Maertens, G. N., Cherepanov, P. 3'-processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo. EMBO J. 31, 3020-3028 (2012).
- Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54, 497-504 (1988).
- Roth, M. J., Schwartzberg, P. L., Goff, S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence. Cell. 58, 47-54 (1989).
- Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Retroviral integration: structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2525-2529 (1989).
- Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179, 886-889 (1990).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3, 469-478 (1989).
- Bukrinsky, M. I., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6580-6584 (1992).
- Miller, M. D., Farnet, C. M., Bushman, F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390 (1997).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468, 326-329 (2010).
- Holman, A. G., Coffin, J. M. Symmetrical base preferences surrounding HIV-1, avian sarcoma/leukosis virus, and murine leukemia virus integration sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6103-6107 (2005).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M., Munroe, D. J. Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J. Virol. 79, 5211-5214 (2005).
- Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42, 10209-10225 (2014).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- LaFave, M. C., et al. MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42, 4257-4269 (2014).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J. Virol. 88, 4504-4513 (2014).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523, 366-369 (2015).
- Serrao, E., et al. Integrase residues that determine nucleotide preferences at sites of HIV-1 integration: implications for the mechanism of target DNA binding. Nucleic Acids Res. 42, 5164-5176 (2014).
- Aiyer, S., et al. Structural and sequencing analysis of local target DNA recognition by MLV integrase. Nucleic Acids Res. 43, 5647-5663 (2015).
- Ciuffi, A., et al. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat. Med. 11, 1287-1289 (2005).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12036-12041 (2013).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J. Virol. 87, 12721-12736 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell Rep. 5, 886-894 (2013).
- Demeulemeester, J., et al. HIV-1 integrase variants retarget viral integration and are associated with disease progression in a chronic infection cohort. Cell Host Microbe. 16, 651-662 (2014).
- Meehan, A. M., et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog. 5, e1000522 (2009).
- Ferris, A. L., et al. Lens epithelium-derived growth factor fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3135-3140 (2010).
- Gijsbers, R., et al. LEDGF hybrids efficiently retarget lentiviral integration into heterochromatin. Mol. Ther. 18, 552-560 (2010).
- Aiyer, S., et al. Altering murine leukemia virus integration through disruption of the integrase and BET protein family interaction. Nucleic Acids Res. 42, 5917-5928 (2014).
- Jahner, D., Jaenisch, R. Integration of Moloney leukaemia virus into the germ line of mice: correlation between site of integration and virus activation. Nature. 287, 456-458 (1980).
- Stevens, S. W., Griffith, J. D. Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5557-5561 (1994).
- Wang, G. P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C. C., Bushman, F. D. HIV integration site selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic modifications. Genome Res. 17, 1186-1194 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. 36, e49 (2008).
- Roth, S. L., Malani, N., Bushman, F. D. Gammaretroviral integration into nucleosomal target DNA in vivo. J. Virol. 85, 7393-7401 (2011).
- Ciuffi, A., Barr, S. D. Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA. Methods. 53, 39-46 (2011).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117, 3113-3122 (2011).
- Matreyek, K. A., et al. Host and viral determinants for MxB restriction of HIV-1 infection. Retrovirology. 11, 90 (2014).
- Ciuffi, A., et al. Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes. Methods. 47, 261-268 (2009).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39, e72 (2011).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol. Biol. 1185, 321-344 (2014).
- Page, K. A., Landau, N. R., Littman, D. R. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270-5276 (1990).
- Emi, N., Friedmann, T., Yee, J. K. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65, 1202-1207 (1991).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Goff, S., Traktman, P., Baltimore, D. Isolation and properties of Moloney murine leukemia virus mutants: use of a rapid assay for release of virion reverse transcriptase. J. Virol. 38, 239-248 (1981).
- Willey, R. L., et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of the human immunodeficiency virus that is critical for infectivity. J. Virol. 62, 139-147 (1988).
- Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
- Brussel, A., Sonigo, P. Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77, 10119-10124 (2003).
- Serrao, E., Ballandras-Colas, A., Cherepanov, P., Maertens, G. N., Engelman, A. N. Key determinants of target DNA recognition by retroviral intasomes. Retrovirology. 12, 39 (2015).
- Maldarelli, F., et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345, 179-183 (2014).
- Wagner, T. A., et al. HIV latency. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345, 570-573 (2014).
- Cohn, L. B., et al. HIV-1 integration landscape during latent and active infection. Cell. 160, 420-432 (2015).
- Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the QubitTM RNA HS assay using RNA spike-in. BMC Mol. Biol. 16, 9 (2015).
- Padmanaban, A., Walker, D. M. Analysis of high molecular weight genomic DNA using the Agilent 2200 TapeStation and genomic DNA ScreenTape. Publication number 5991-1797EN Agilent Technologies. , Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA. (2013).
- Kapa library quantification technical guide version v1.14. , KapaBiosystems. Boston, MA. (2014).
- Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 12, 656-664 (2002).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Gaur, M., Leavitt, A. D. Mutations in the human immunodeficiency virus type 1 integrase D,D(35)E motif do not eliminate provirus formation. J. Virol. 72, 4678-4685 (1998).
- Varadarajan, J., McWilliams, M. J., Hughes, S. H. Treatment with suboptimal doses of raltegravir leads to aberrant HIV-1 integrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 14747-14752 (2013).
- Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, 996-1006 (2002).
- Berry, C. C., et al. Estimating abundances of retroviral insertion sites from DNA fragment length data. Bioinformatics. 28, 755-762 (2012).
- Firouzi, S., et al. Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites. Genomic Med. 6, 46 (2014).
- Mitchell, R. S., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2, E234 (2004).
- Schneider, T. D., Stormo, G. D., Gold, L., Ehrenfeucht, A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 188, 415-431 (1986).
- Langmead, B. Chapter 11, Unit 11. 17, Aligning sort sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics. , (2010).
- LaFave, M. C., Varshney, G. K., Burgess, S. M. GeIST: a pipeline for mapping integrated DNA elements. Bioinformatics. 31, 3219-3221 (2015).
- Hocum, J. D., et al. VISA - Vector Integration Site Analysis server: a web-based server to rapidly identify retroviral integration sites from next-generation sequencing. BMC Bioinformatics. 16, 212 (2015).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15, 1431-1436 (2009).
- TruSeq Library Prep Pooling Guide. Guidelines for pooling TruSeq libraries for Illumina sequencing systems that require balanced index combinations. , Source: https://support.illumina.com/downloads/truseq-library-prep-pooling-guide-15042173.html (2015).
