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Biology

उच्च throughput CRISPR वेक्टर निर्माण और डीएनए संशोधनों की विशेषता टमाटर रोंआर जड़ें की पीढ़ी द्वारा

Published: April 30, 2016 doi: 10.3791/53843
Automatic Translation
1, 1,2
1Boyce Thompson Institute for Plant Research, 2Section of Plant Pathology & Plant-Microbe Biology, School of Integrative Plant Science, Cornell University

Summary

डीएनए विधानसभा का प्रयोग, कई CRISPR वैक्टर एक भी क्लोनिंग प्रतिक्रिया में समानांतर में निर्माण किया जा सकता, CRISPR की बड़ी संख्या के निर्माण बनाने के लिए एक आसान काम वैक्टर। टमाटर बालों की जड़ों CRISPR वैक्टर मान्य है और उत्परिवर्ती सामग्री उत्पन्न करने के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली रहे हैं।

Introduction

CRISPR के साथ लक्षित डीएनए संशोधनों उत्पन्न करने की क्षमता / Cas9 कार्यात्मक जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए महान क्षमता है। वहाँ CRISPR / Cas9 प्रणाली के दो घटक हैं; Cas9 nuclease, Staphylococcus प्योगेनेस और एक लगभग 100-NT गाइड आरएनए (gRNA) अणु है कि लक्षित डीएनए साइट (ओं) के लिए 1 Cas9 निर्देशन से निकाली गई। लक्ष्य मान्यता पहले द्वारा प्रदत्त है ~ gRNA, जो लक्षित कर वैक्टर 2,3 के उच्च throughput उत्पादन के लिए अनुमति देता है के 20-NT। अधिकांश जीवों कि इंजीनियर हो सकता है, पहले से ही CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी 4,5 के साथ किया गया है।

पौधों, ऐसे CaMV 35S प्रमोटर के रूप में विधान प्रवर्तकों में, आमतौर पर Cas9 nuclease 6 की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। gRNAs आरएनए पोलीमर्स III U6 या U3 प्रमोटरों जो gRNA की पहली आधार प्रतिबंधित का उपयोग कर व्यक्त कर रहे हैं करने के लिए या तो एक जी, U6, या u3 के लिए एक कुशल, प्रतिलेखन के लिए के लिए। हालांकि शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के सालाना जलसेoters है, जो इन प्रतिबंधों से मुक्त कर रहे हैं, भी 7.8 इस्तेमाल किया गया है।

विभिन्न gRNAs अलग क्षमता के साथ डीएनए उत्परिवर्तन प्रेरित है, और इसलिए यह पहली बार पूरे संयंत्र परिवर्तनों में निवेश या व्यापक प्ररूपी स्क्रीन स्थापित करने से पहले CRISPR वैक्टर मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। CRISPR की क्षणिक अभिव्यक्ति, पौधों में constructs उदाहरण के लिए agroinfiltration का उपयोग करके, स्थिर पौधों 6 की तुलना में, मुश्किल म्यूटेशन और इस तरह के दृष्टिकोण के साथ अव्यावहारिक प्ररूपी assays का पता लगाने कर रही है आम तौर पर डीएनए संशोधन का एक कम आवृत्ति में परिणाम है। बालों की जड़ों तथाकथित एक सुविधाजनक, वैकल्पिक प्रणाली के बाद से स्वतंत्र, स्थिरतापूर्वक तब्दील सामग्री की एक बड़ी संख्या है, के रूप में स्थिर संयंत्रों के लिए महीने में करने का विरोध सप्ताह के भीतर उत्पन्न किया जा सकता हैं। CRISPR वैक्टर बालों की जड़ों 9,10 में डीएनए उत्परिवर्तन उत्प्रेरण में बहुत प्रभावी रहे हैं।

डीएनए विधानसभा तरीकों कुशलता से डीएनए overl युक्त टुकड़े ligateapping समाप्त होता है 11। कुछ डीएनए विधानसभा तरीकों का एक प्रमुख लाभ इकट्ठे उत्पादों में ssDNA (यानी, ओलिगोस) को शामिल करने की क्षमता है। चूंकि gRNAs केवल ~ 20-NT लंबे होते हैं और नए लक्ष्य संश्लेषित ओलिगोस के साथ बनाया जा सकता है, इन डीएनए विधानसभा तरीकों अच्छी तरह से CRISPR क्लोनिंग के लिए अनुकूल हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल गया है कि सफलतापूर्वक सोयाबीन 10, चिनार 12 में इस्तेमाल किया और अब टमाटर की गई CRISPR वैक्टर p201 श्रृंखला पर आधारित हैं। प्रस्तुत क्लोनिंग प्रक्रिया चालू क्लोनिंग विधि 10 पर कई लाभ प्रदान करता है। अर्थात्, पूरी तरह कार्यात्मक वैक्टर एक ही दिन में एक भी क्लोनिंग प्रतिक्रिया में उत्पन्न किया जा सकता है। वेक्टर निर्माण भी आगे हाथ पर समय और माल की लागत को कम करने, समानांतर में कई CRISPR वैक्टर उत्पन्न करने के लिए जमा किया जा सकता है। हम यह भी एक कारगर तरीका लक्षित जीन विलोपन के साथ ट्रांसजेनिक सामग्री का उत्पादन करने के लिए के रूप में टमाटर बालों की जड़ों की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। बालों की जड़ों को वैध करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंCRISPR वैक्टर खाया और बाद के प्रयोगों के लिए सामग्री प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. गाइड आरएनए डिजाइन और निर्माण वेक्टर

  1. ब्याज की जीन के लिए लक्ष्य दृश्यों को पहचानें। इस कदम 13,14 के लिए उपयुक्त ऑनलाइन CRISPR लक्ष्य पाने के कार्यक्रमों की एक किस्म है।
    नोट: यहाँ हम जीएन 20 जी जी लक्ष्य की आकृति का उपयोग करें, लेकिन अन्य डिजाइन का इस्तेमाल किया आवेदन या वेक्टर सिस्टम के आधार पर उपयुक्त हो सकता है।
  2. डिजाइन 60-मेर gRNA ओलिगोस 5 से घिरे लक्ष्य रूपांकनों 'और 3' 20-NT दृश्यों कि डीएनए विधानसभा के लिए आवश्यक हैं के जीएन 19 भाग शामिल करने के लिए। अंतिम 60-मेर मूल भाव है: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-जीएन 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC -3 '।
    नोट: स्टैंडर्ड, desalted प्राइमरों ठीक काम करते हैं।
  3. (चित्रा 1) विधानसभा के लिए चार DNAs तैयार करें। डीएनए दृश्यों के लिए अनुपूरक फ़ाइल देखें।
    1. डाइजेस्ट 1 - 5 p201N की माइक्रोग्राम: 2 घंटे के लिए प्रतिबंध एंजाइम 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x बफर 4 में Spe के साथ मैं Cas9 10 प्लाज्मिड। कॉलम-शुद्ध एक पचानेनिर्माता के निर्देशों के ccording। 10 मिमी Tris एचसीएल के 15 μl में resuspend ~, और यूवी spectrophotometry द्वारा यों।
    2. एक दूसरे 2 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिबंध एंजाइम 1x बफर 3.1 में स्व मैं के साथ पचा प्रदर्शन करना। 100 की जांच - 200 एक 0.8% agarose जेल पर एनजी पूरा पाचन पुष्टि करने के लिए।
      नोट: एक सही ढंग से पचा प्लाज्मिड 14,313 बीपी पर एक भी बैंड होगा। नोट: एंजाइम और dephosphorylation की गर्मी निष्क्रियता की आवश्यकता नहीं है। पचा प्लाज्मिड -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    3. पीसीआर प्राइमरों स्व I_MtU6F / MtU6R और ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, क्रमशः का उपयोग कर पीयूसी gRNA शटल 10 प्लाज्मिड से मेडिकागो truncatula (माउंट) U6 प्रमोटर और पाड़ DNAs बढ़ाना। पीसीआर शर्तों के साथ एक उच्च निष्ठा पोलीमर्स का उपयोग करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 31 चक्र (20 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
      1. कल्पना पीसीआर जनसंपर्क के ~ 3 μl aliquotsएक 1% agarose जेल पर oducts प्रवर्धन की पुष्टि करें। MtU6 amplicon 377 बीपी और पाड़ amplicon 106 बीपी है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्तंभ-शुद्ध शेष पीसीआर उत्पादों, -20 डिग्री सेल्सियस पर यूवी spectrophotometry और दुकान से यों।
    4. प्रयोगशाला ग्रेड पानी में 100 माइक्रोन के लिए gRNA ओलिगोस की पूरी ट्यूब Resuspend। 1x बफर 2.1 के 500 μl के लिए 100 माइक्रोन के oligo के 1 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। यदि एक से अधिक ओलिगोस पूलिंग, 1x बफर 2.1 ट्यूब के लिए प्रत्येक 100 माइक्रोन के oligo के 1 μl जोड़ें। पतला ओलिगोस -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. एक थर्मल साइक्लर कार्यक्रम 50 डिग्री सेल्सियस पर धारण करने के लिए, एक गर्म ढक्कन का उपयोग कर। की मात्रा को linearized वेक्टर, 50 एनजी MtU6 प्रमोटर, 12 एनजी पाड़ के (0.2 pmol), 1 μl (0.2 pmol) पतला gRNA oligo (एस), और पानी का (0.2 pmol) का गठबंधन 100 एनजी (0.011 pmol) 5 μl। , 2x उच्च निष्ठा डीएनए विधानसभा मास्टर मिश्रण के 5 μl जोड़े अच्छा मिश्रण है और नीचे स्पिन। में 60 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते50 डिग्री सेल्सियस थर्मल साइक्लर। फिर बर्फ पर प्रतिक्रिया जगह है।
    नोट: रिएक्शन की मात्रा कम डीएनए पैदावार समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
  5. सक्षम ई में प्रतिक्रिया के 2 μl रूपांतरण कोलाई कोशिकाओं मानक तकनीक और लेग पर थाली के साथ 50 मिलीग्राम एल -1 केनामाइसिन (कान 50) पूरक का उपयोग कर। 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर चढ़ाया-कोशिकाओं को विकसित। -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया बचाओ।
  6. पीसीआर द्वारा कालोनी स्क्रीन प्राइमरों StUbi3P218R और ISceIR का उपयोग कर। पानी के साथ 1 शेष डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया के एक विभाज्य पतला: 5। एक नहीं डालने के नियंत्रण के रूप में Cas9 प्लाज्मिड: कॉलोनी स्क्रीन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण और परिपत्र p201N का 1 एनजी के रूप में 1 μl का प्रयोग करें।
    1. पीसीआर शर्तों के साथ बढ़ाना; 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 31 चक्र (30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर। एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों कल्पना। सुनिश्चित करें कि सही सम्मिलन 725 बीपी और वैक्टर बुद्धि पर एक बैंड हैHout सम्मिलित करता है (जैसे, काटा हुआ वेक्टर) एक 310-बीपी बैंड होगा।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 तरल संस्कृतियों रात भर पौंड कान में सकारात्मक कालोनियों आगे बढ़ें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार plasmids शुद्ध। सेंगर अनुक्रम StUbi3P218R प्राइमर के साथ plasmids और MtU6 प्रमोटर, लक्ष्य, और पाड़ दृश्यों के लिए chromatograms संरेखित सुनिश्चित करने के लिए क्लोनिंग के दौरान कोई त्रुटि पेश किए गए।
  8. एक नैदानिक ​​पारिस्थितिकी आर.वी. और शूकरशाला I. साथ ~ प्लाज्मिड के 1 माइक्रोग्राम पचाने के द्वारा पचाने प्रदर्शन करना एक 0.8% agarose जेल पर कल्पना। (बीपी) में टुकड़े कर रहे हैं: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, और 174।
  9. कई gRNAs साथ वैक्टर का निर्माण करने के लिए डीएनए विधानसभा का प्रयोग करें।
    1. दो gRNA कैसेट के साथ एक सदिश का निर्माण करने के लिए, पीसीआर बढ़ाना प्राइमरों स्व I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR और दूसरी स्थिति gRNA प्राइमरों संबंधित में से प्रत्येक की 1 एनजी से UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR साथ साथ पहली स्थिति gRNA1.8 - 1.1 प्लास्मिड कदम का निर्माण किया। कदम 1.3.3 में पीसीआर की स्थिति का प्रयोग करें। प्रवर्धन की पुष्टि के लिए एक 1% agarose जेल पर कल्पना पीसीआर उत्पादों की ~ 3 μl aliquots। Amplicons ~ 500 बीपी हैं।
    2. गठबंधन और एक 200 μl ट्यूब में संयुक्त राष्ट्र के शुद्ध पीसीआर उत्पादों के लगभग बराबर मात्रा में मिश्रण (आमतौर पर 3 - प्रत्येक के 4 μl)। विधानसभा के लिए, संयुक्त पीसीआर उत्पादों 1 μl, स्व मैं 50 एनजी जोड़ने और विशेष मैं p201N linearized: 2.5 μl और 2x उच्च निष्ठा डीएनए विधानसभा मास्टर मिश्रण के 2.5 μl को Cas9, प्रयोगशाला ग्रेड पानी। 15 मिनट के लिए एक 50 डिग्री सेल्सियस थर्मल cycler में सेते हैं।
      नोट: डीएनए विधानसभा मैनुअल 2 के लिए एक 15 मिनट ऊष्मायन की सिफारिश की - 3 टुकड़े।
    3. सक्षम ई में 2 μl - 1 रूपांतरण कोलाई कोशिकाओं और लेग कान 50 पर थाली। 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर चढ़ाया कोशिकाओं को विकसित। -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष प्रतिक्रिया बचाओ।
    4. प्राइमरों StUbi3P218R और ISceIR 1.6 कदम के रूप में एक ही स्थिति के साथ साथ पीसीआर द्वारा कालोनी स्क्रीन। सही गlones 1200 बीपी amplicon होगा। 50 तरल संस्कृतियों रात भर पौंड कान में सकारात्मक कालोनियों आगे बढ़ें और plasmids शुद्ध।
    5. प्राइमरों StUbi3P218R साथ सेंगर अनुक्रम plasmids (प्रथम स्थिति gRNA शामिल किया गया है) और p201R (दूसरी स्थिति gRNA शामिल किया गया है)। MtU6 प्रमोटर, लक्ष्य, और पाड़ दृश्यों के लिए chromatograms संरेखित करें। नैदानिक ​​पारिस्थितिकी आर.वी. साथ पचाने और शूकरशाला मैं निम्नलिखित टुकड़े (बीपी में) में परिणाम होगा: 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174 Bolded टुकड़ा दूसरी gRNA शामिल हैं।
  10. सभी गुणवत्ता नियंत्रण अपेक्षाओं को पूरा करने के बाद, plasmids को बदलने में Agrobacterium तनाव ARqua1 15 rhizogenes। सेटिंग्स के साथ एक 1 मिमी क्युवेट में electrocompetent कोशिकाओं और electroporate के 50 μl के लिए प्लाज्मिड प्रस्तुत करने के 1 μl जोड़ें: 2.4 केवी, 25 μF, और 200 Ω। समाज की ~ 500 μl में कोशिकाओं को ठीक और 2 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर हिला। पौंड कान 50 और जी पर प्लेट2 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर पंक्ति। 1.3.3 के रूप में ही प्राइमरों और पीसीआर शर्तों का उपयोग कॉलोनी स्क्रीन प्रदर्शन करना। सकारात्मक क्लोन से ग्लिसरॉल शेयरों बनाओ।

2. रोंआर रूट परिवर्तन

  1. 15 मिनट के लिए 20% घरेलू ब्लीच में टमाटर के बीज जीवाणुरहित, लगातार मिश्रण के साथ। एक लामिना का प्रवाह हुड में, ब्लीच हटाने और बाँझ प्रयोगशाला ग्रेड पानी में 3 बार धोएं।
  2. एक जीए-7 बॉक्स में प्लेट 30 बीज युक्त आधा एमएस मीडिया (2.22 जी एल -1 एमएस लवण + Gamborg विटामिन, 10 ग्राम एल -1 सुक्रोज, 3 जी एल -1 Gellan गम, पीएच 5.8)। अंधेरे में ~ 2 दिनों के लिए उगना, तब प्रकाश में जीए-7 बक्से ले जाते हैं। ~ 4 प्रकाश में अधिक दिनों के लिए बीज बोने।
  3. दिन के परिवर्तन से पहले, ए लकीर बाहर ठोस पौंड कान 50 पर संस्कृतियों rhizogenes और रात में 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
  4. परिवर्तन का दिन, लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ सामग्री इकट्ठा: 12 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, साढ़े एमएस तरल (कोई Gellan जीउम), 200 माइक्रोन के acetosyringone, फिल्टर पेपर, पेट्री डिश, संदंश और छुरी, pipettes और पिपेट टिप्स। आधा एमएस की 50 मिलीलीटर acetosyringone के 25 μl जोड़ें और ~ 6 मिलीलीटर प्रत्येक संस्कृति ट्यूब में डाल देना।
  5. ए परिमार्जन करने के लिए एक तुला 200 μl टिप का उपयोग करें प्लेट और आधा एमएस तरल के 6 मिलीलीटर में resuspend से rhizogenes कोशिकाओं। भंवर ट्यूब पूरी तरह से कोशिकाओं resuspend। प्रत्येक वेक्टर से कोशिकाओं resuspending के बाद, 600 एनएम का एक निश्चित तरंग दैर्ध्य में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने। सुनिश्चित करें आयुध डिपो 0.2 और 0.4 के बीच है; पतला या आवश्यक के रूप में अधिक कोशिकाओं जोड़ें। प्रत्येक निर्माण के लिए दोहराएँ।
  6. एक बाँझ फिल्टर पेपर के साथ एक पेट्री डिश के लिए आधा एमएस तरल की ~ 2 मिलीलीटर जोड़ें। पौध और सिक्त फिल्टर पेपर पर जगह से आबकारी बीजपत्र। एक बार सभी बीजपत्र एकत्र किया गया है, बीजपत्र के बंद बाहर का ~ 1 सेमी में कटौती, दो कटौती के साथ समाप्त होता गर्भदल टुकड़े में जिसके परिणामस्वरूप। ए explants जोड़े rhizogenes समाधान, मिश्रण, और 20 मिनट के लिए सेतेकभी-कभी inverting के साथ।
    नोट: निर्माण के अनुसार लगभग 12 explants नियमित तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, हालांकि के रूप में कई के रूप में 80 explants ए के 6 मिलीलीटर में टीका दिया है rhizogenes समाधान।
  7. ए के दौरान rhizogenes ऊष्मायन, पेट्री डिश के लिए फिल्टर पेपर जोड़ने के लिए, एक प्रति का निर्माण बदल दिया। इसके अलावा, आधा एमएस ठोस मीडिया, कोई एंटीबायोटिक दवाओं सेट लामिना का प्रवाह हुड में सूखे के लिए।
  8. ए से बाहर बीजपत्र स्कूप सूखी फिल्टर पेपर पर बाँझ संदंश और जगह के साथ rhizogenes समाधान। पेट्री ढक्कन के साथ कवर, जबकि अगले परिवर्तन के लिए आगे बढ़ने के ऊतकों सुनिश्चित करने के लिए बाहर सूखी नहीं है। फिल्टर पेपर और हस्तांतरण, abaxial ऊपर की ओर, पर ब्लाट बीजपत्र एमएस मीडिया आधा करने के लिए। लपेटें सर्जिकल टेप और साथ प्लेटों 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सह खेती।
  9. सह खेती, स्थानांतरण बीजपत्र, abaxial पक्ष अप के बाद, आधा करने के लिए एमएस मीडिया 300 मिलीग्राम एल -1 ticarcillin / clavulanic एसिड के साथ पूरक (टिम 300, Resid के विकास को रोकने के लिएयौन ए rhizogenes) और कान 50 (संयंत्र चयन के लिए) और सर्जिकल टेप के साथ लपेटो। एक 16-घंटे के फोटो पीरियड के साथ कमरे के तापमान पर फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत संस्कृतियों को बनाए रखें।
  10. लंबाई में 2 सप्ताह जड़ों में कम से कम 2 सेमी बाँझ संदंश और एक छुरी का उपयोग कर बीजपत्र से excised और एमएस कान 50 टिम 300 मीडिया आधा करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं - ~ 1.5 के बाद। एक ही थाली के लिए 10 से 15 जड़ों स्थानांतरण। एक मार्कर के साथ जड़ सुझावों की स्थिति निशान, सर्जिकल टेप के साथ रैप, और संस्कृति के कमरे में बनाए रखें।
  11. एक सप्ताह के बाद, तब्दील जड़ों चयनात्मक मीडिया पर बढ़ रही देखा जाता है। वरीय डीएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग डीएनए निष्कर्षण के लिए बदल जड़ों की एक subsample हार्वेस्ट। नोट: बीजपत्र साथ प्लेटों 2 के लिए रखा जा सकता है - 3 साप्ताहिक फसल, जिसके बाद बिंदु जड़ों को एक पेचीदा मेस में आगे बढ़ने और अलग करने के लिए मुश्किल हो जाता है। गैर काटा जड़ ऊतकों अनिश्चित काल के लिए बनाए रखा जा सकता है। assays की एक किस्म पृथक डीएनए नमूने पर किया जा सकता हैडीएनए उत्परिवर्तन आवृत्ति और प्रकार का निर्धारण करने के लिए। कुछ ऐसे assays के परिणाम से नीचे वर्णित हैं।

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Representative Results

डीएनए विधानसभा के साथ CRISPR वेक्टर निर्माण आम तौर पर स्वतंत्र क्लोन के सैकड़ों करने के लिए दसियों उत्पन्न करता है। पीसीआर द्वारा कालोनी स्क्रीनिंग आसानी से सही क्लोन को दिखाता है और साथ और सम्मिलित करता है (2A चित्रा) जो समस्या निवारण के लिए उपयोगी है बिना plasmids के बीच भेद कर सकते हैं। आमतौर पर, क्लोन के सभी एक डालने होते हैं और एक उपयोगकर्ता को पूरी तरह कॉलोनी स्क्रीनिंग कदम को छोड़ करने के लिए विकल्प चुन सकते हैं। नैदानिक ​​हज़म (चित्रा 2 बी) और सेंगर अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है। जब त्रुटि होती है, वे आम तौर पर ओवरलैपिंग डीएनए क्षेत्रों में मनाया जाता है यानी, 5 'MtU6 प्रमोटर के अंत में, gRNA, या 3' पाड़ दृश्य के अंत। कई gRNA ओलिगोस एक भी प्रतिक्रिया में जमा कर रहे हैं, तो gRNAs सेंगर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं। व्यक्तिगत gRNAs के समावेश में समान रूप से वितरित किया जाता है और gRNAs के सबसे एक भी परिवर्तन (चित्रा -2 से अलग किया जा सकता है (चित्रा -2) है।

टमाटर बालों की जड़ों आमतौर पर परिवर्तन (चित्रा 3) के बाद दो सप्ताह के लिए एक मनाया जाता है। लंबाई में जड़ें ≥2 सेमी excised और चयनात्मक मध्यम और केनामाइसिन प्रतिरोधी जड़ों एक सप्ताह बाद (चित्रा 3 बी) पहचाना जा सकता है स्थानांतरित कर रहे हैं। अधिकांश जड़ों चयनात्मक मीडिया और तब्दील जड़ों चर हो सकता है में जड़ विकास पर कुछ हद तक विकसित होगा; यदि संभव हो तो, विश्लेषण के लिए सबसे तेजी से बढ़ रही जड़ों का चयन करें। दो केनामाइसिन प्रतिरोधी जड़ों को एक आम तौर पर टीका गर्भदल प्रति बरामद कर रहे हैं। नियमित रूप से हस्तांतरण के साथ, बदल जड़ों चयनात्मक मीडिया पर अनिश्चित काल के लिए बनाए रखा जा सकता है।

डीएनए केनामाइसिन प्रतिरोधी जड़ों से निकाला जाता है और पीसीआर amplif करने के लिए प्रयोग किया जाता हैY लक्ष्य क्षेत्र (एस)। पीसीआर उत्पादों assays की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है इस तरह के क्लोनिंग और अनुक्रमण (चित्रा 3 सी), प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता विश्लेषण, जेल वैद्युतकणसंचलन 16 (चित्रा 3 डी), T7E1 endonuclease 16, या उच्च throughput amplicon अनुक्रमण के रूप में उत्परिवर्तन दक्षता, का निर्धारण करने के लिए 10। जैसा कि अन्य CRISPR संयंत्र प्रणालियों 6 में सूचना दी, gRNA / लक्ष्य अनुक्रम में चयनित पर निर्भर करता है, म्यूटेशन और उत्परिवर्तन क्षमता की एक सीमा देखा जा सकता है।

आकृति 1
। चित्रा 1. CRISPR विधानसभा के सिद्धांत डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया में, चार DNAs एक साथ मिश्रित कर रहे हैं; p201N: Cas9 स्व मैं और विशेष मैं (काले वृत्त), MtU6 प्रमोटर (हरी तीर), चबूतरा (पीली पट्टी) और जीएन 19 लक्ष्य अनुक्रम युक्त 60-मेर gRNA oligo (ख के साथ linearizedलुए बार)। प्रत्येक डीएनए अणु के सिरों आसन्न टुकड़े के साथ 20 बीपी overlaps। डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया एक एकल, परिपत्र अणु में इन DNAs recombines। StUbi3p218R और ISceIR प्राइमर बाध्यकारी साइटों काला तीर के साथ संकेत कर रहे हैं, 2x35S: Cas9 कैसेट, बैंगनी है StUbi3: nptII कैसेट नारंगी और छोड़ दिया है और सही सीमाओं ग्रे सलाखों के साथ संकेत कर रहे हैं। नोट:। वेक्टर नक्शा पैमाने पर नहीं है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. कालोनी स्क्रीनिंग और प्लाज्मिड गुणवत्ता नियंत्रण। ए) डीएनए विधानसभा और परिवर्तन से 20 क्लोन की कालोनी स्क्रीनिंग। एम, 100-बीपी सीढ़ी; +, P201N: Cas9: GFPT2 सकारात्मक नियंत्रण; एनआई, p201N: Cas9 कोई डालने नियंत्रण; जीए, पतला डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया; NT, कोई टेम्पलेट नियंत्रणबी।) चार p201N के प्रतिनिधि डाइजेस्ट: Cas9: प्रतिबंध के साथ gRNA वैक्टर एंजाइमों पारिस्थितिकी आर.वी. और शूकरशाला I. एम, 2-लॉग सीढ़ी। सी) मानक और उच्च निष्ठा डीएनए विधानसभा घोला जा सकता है और बरामद वैक्टर का वितरण जब 11 gRNA ओलिगोस एक भी प्रतिक्रिया में जमा थे की निष्ठा की तुलना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. रोंआर रूट संस्कृतियों और डीएनए संशोधन की जांच। ए) रोंआर जड़ों 11 दिनों के बाद परिवर्तन। बी बीजपत्र से उभरते देखा जा सकता है) जड़ों लगभग एक सप्ताह के लिए आधा एमएस कान 50 मीडिया पर चुने गए हैं। ग्रे सलाखों चढ़ाना। सी के समय) क्लोनिंग का उदाहरण जड़ सुझावों की स्थिति निरूपित औरअनुक्रमण दो अलग अलग जीन लक्ष्य के साथ डीएनए उत्परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए चार अलग-बालों की जड़ की घटनाओं में। ग्रे बॉक्स अर्थ जीएन 20 जी जी लक्ष्य अनुक्रम, Δ उत्परिवर्तन के प्रकार, और संकेत उत्परिवर्तन। डी) जेल वैद्युतकणसंचलन के उदाहरण के साथ क्लोन की संख्या डीएनए उत्परिवर्तन निर्धारित करने के लिए इंगित करता है। बड़े विलोपन और heteroduplex बैंड लक्ष्य दृश्यों पर डीएनए उत्परिवर्तन की उपस्थिति का संकेत। 12 स्वतंत्र घटनाओं में से छह के रूप में म्यूटेंट (Δ) रन बनाए थे। गुम्मट, जंगली प्रकार नियंत्रण; NT, कोई टेम्पलेट नियंत्रण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान IOS-1025642 (जीबीएम) द्वारा समर्थित किया गया। हम ARqua1 तनाव प्रदान करने के लिए मारिया हैरिसन धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) New England Biolabs E5520
p201N:Cas9 Addgene 59175 The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes.
pUC gRNA Shuttle Addgene 47024
SwaI New England Biolabs R0604S
SpeI New England Biolabs R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification Zymo Research D4003
NEB Buffer 2.1 New England Biolabs B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4) New England Biolabs B7204S
NEB Buffer 3.1 New England Biolabs B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) Epoch Life Sciences 1910-050/250
EcoRV-HF® New England Biolabs R3195S
StyI-HF® New England Biolabs R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins Phytotechnology Laboratories M404
Phytagel™ (gellan gum) Sigma Aldrich P8169
GA-7 Boxes Sigma Aldrich V8505
Micropore™ surgical tape 3M 1535-0
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) Various 0029-6571-26
Primers 5' → 3'
SwaI_MtU6F  GATATTAATCTCTTCGATGA
AATTTATGCCTATCTTATAT
GATCAATGAGG
MtU6R   AAGCCTACTGGTTCGCTTG
AAG
ScaffoldF  GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
AAGTT
SpeI_Scaffold R GTCATGAATTGTAATACGACTC
AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R  ACATGCACCTAATTTCACTA
GATGT
ISceIR GTGATCGATTACCCTGTTAT
CCCTAG		 Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid
UNS1_Scaffold R  GAGAATGGATGCGAGTAATGAA
AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F   CATTACTCGCATCCATTCTCAT
GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R  CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9.

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 110, CRISPR / Cas9 जेनेटिक इंजीनियरिंग जीनोम संपादन डीएनए विधानसभा पादप जैव प्रौद्योगिकी संयंत्र परिवर्तन
उच्च throughput CRISPR वेक्टर निर्माण और डीएनए संशोधनों की विशेषता टमाटर रोंआर जड़ें की पीढ़ी द्वारा
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Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843, doi:10.3791/53843 (2016).

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