Summary
Anvendelse af DNA samling, kan flere CRISPR vektorer konstrueres parallelt i en enkelt kloning reaktion, hvilket gør konstruktionen af et stort antal CRISPR vektorer en enkel opgave. Tomat hårrødder er en glimrende modelsystem til at validere CRISPR vektorer og generere mutant materialer.
Introduction
Evnen til at generere målrettede DNA ændringer med CRISPR / Cas9 har et stort potentiale inden for funktionel genomforskning studier. Der er to komponenter af CRISPR / Cas9 systemet; den Cas9 nuklease, afledt af Staphylococcus pyogenes og en ca. 100-nt guide RNA (gRNA) molekyle, der dirigerer Cas9 til det målrettede DNA site (s) 1. Target anerkendelse bibringes af den første ~ 20 nt af gRNA, som giver mulighed for high-throughput produktion af targeting vektorer 2,3. De fleste organismer, der kan manipuleret, allerede har været med CRISPR / Cas9 teknologi 4,5.
I planter, konstitutive promotorer, såsom CaMV 35S-promotoren, anvendes almindeligvis til at drive ekspressionen af Cas9 nuclease 6. De gRNAs udtrykkes ved anvendelse af de RNA-polymerase III U6 eller U3 promotorer, der begrænser den første base af gRNA til enten et G, for U6, eller A for U3, til effektiv transkription. Imidlertid RNA-polymerase II promoters, der er fri for disse begrænsninger, er også blevet anvendt 7,8.
Forskellige gRNAs inducerer DNA-mutationer med forskellige virkningsgrader, og så det kan være vigtigt først at validere CRISPR vektorer før man investerer i hel-plante transformationer eller oprette omfattende fænotypiske skærme. Transient ekspression af CRISPR-konstruktioner i planter ved anvendelse agroinfiltration for eksempel generelt resulterer i en lavere frekvens af DNA modifikation sammenlignet med stabile planter 6, hvilket gør påvisning af mutationer vanskelige og fænotypiske assays upraktisk med sådanne fremgangsmåder. Såkaldte hårede rødder er en bekvem, alternativt system siden kan genereres et stort antal uafhængige, stabilt transformerede materialer inden for uger, i modsætning til måneder for stabile planter. CRISPR vektorer er meget effektive til at inducere DNA-mutationer i hårrødder 9,10.
DNA samlingsmetoder effektivt ligere DNA-fragmenter indeholdende overlapping ender 11. En væsentlig fordel ved nogle DNA samlingsmetoder er evnen til at inkorporere ssDNA (dvs. oligoer) i den samlede produkter. Da gRNAs kun ~ 20 nt lang og kan gøres nye mål med syntetiserede oligoer, disse DNA samlingsmetoder er velegnede til CRISPR kloning. De her beskrevne protokoller er baseret på P201 serie CRISPR vektorer, som er blevet anvendt i sojabønne 10, poppel 12 og nu tomat. Kloningen præsenteret tilbyder flere fordele i forhold til den aktuelle kloning metode 10. Nemlig, kan fuldt funktionelle vektorer blive frembragt i en enkelt kloning reaktion på en enkelt dag. Vector konstruktion kan også samles til at generere flere CRISPR vektorer i parallel, hvilket yderligere reducerer hands-on tid og materialeomkostninger. Vi præsenterer også en protokol til generering af tomater hårrødder som en effektiv metode til at producere transgene materialer med målrettede gendeletioner. Hårrødder bruges til gyldigspiste CRISPR vektorer og tilvejebringe materiale til efterfølgende eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Guide RNA Design og Vector Construction
- Identificere målsekvenser for generne af interesse. Der er en række online CRISPR target-finding programmer er egnede til dette trin 13,14.
BEMÆRK: Her bruger vi GN 20 GG mål motiv, men andre udformninger kan være egnede afhængig af anvendelsen eller vektor, der anvendes. - Design 60-mer gRNA oligoer at medtage GN 19 del af target-motiver flankeret af 5 'og 3' 20 nt sekvenser, som kræves til DNA samling. Den endelige 60-mer-motiv, er: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
BEMÆRK: Standard, afsaltede primere fungere fint. - Forbered de fire DNA til samling (Figur 1). Se supplerende fil til DNA-sekvenser.
- Fordøje 1 - 5 ug p201N: Cas9 10 plasmid med restriktionsenzymet Spel i 1x puffer 4 ved 37 ° C i 2 timer. Kolonne-oprense fordøje enccording til producentens anvisninger. Resuspender i ~ 15 pi 10 mM Tris-HCI og kvantificere ved UV-spektrofotometri.
- Udfør en anden fordøje med restriktionsenzymet Swal i 1x puffer 3.1 ved 25 ° C i 2 timer. Check 100 - 200 ng på en 0,8% agarosegel for at bekræfte fuldstændig fordøjelse.
BEMÆRK: En korrekt fordøjet plasmid vil have en enkelt bånd på 14.313 bp. Bemærk: Heat inaktivering af enzymet og dephosphorylering er ikke påkrævet. Spaltede plasmid kan opbevares ved -20 ° C. - PCR forstærke Medicago truncatula (Mt) U6 promotoren og stillads DNA fra pUC gRNA Shuttle 10 plasmid hjælp primerne Swa I_MtU6F / MtU6R og ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR hhv. Brug en hi-fi-polymerase med PCR betingelser: 95 ° C i 3 min; 31 cykler (98 ° C i 20 sekunder, 60 ° C i 15 sek, 72 ° C i 30 sek); og 72 ° C i 5 minutter.
- Visualisere ~ 3 pi alikvoter af PCR products på en 1% agarosegel for at bekræfte amplifikation. Den MtU6 amplicon er 377 bp og stilladset amplikon er 106 bp. Kolonne-rense de resterende PCR-produkter i henhold til producentens anvisninger, kvantificere ved UV spektrofotometri og opbevares ved -20 ° C.
- Resuspender hele tube gRNA oligoer til 100 uM i laboratoriet-grade vand. Tilsæt 1 pi 100 pM oligo til 500 pi 1x buffer 2.1. Bland godt. Hvis samle flere oligoer, tilsættes 1 ul af hver 100 uM oligo til 1x puffer 2.1 rør. Fortyndede oligoer kan opbevares ved -20 ° C.
- Programmere en thermal cycler at holde ved 50 ° C, ved anvendelse af et opvarmet låg. Kombiner 100 ng (0,011 pmol) af lineariseret vektor, 50 ng (0,2 pmol) af MtU6 promotor, 12 ng (0,2 pmol) af stillads, 1 pi (0,2 pmol) af fortyndet gRNA oligo (er), og vand til et volumen på 5 pi. Tilsæt 5 pi 2x high-fidelity DNA samling mester mix, bland godt og spin ned. Inkuber reaktion i 60 minutter i50 ° C thermocycler. Placer derefter reaktionen på is.
Bemærk: Reaktionsvolumener kan øges for at imødekomme lave DNA udbytter. - Transform 2 pi af reaktionsblandingen ind i kompetente E. coli-celler under anvendelse af standardteknikker og plade på LB suppleret med 50 mg L -1 kanamycin (Kan 50). Grow udpladede-celler ved 37 ° C natten over. Gemme den resterende DNA samling reaktionen ved -20 ° C.
- Colony skærmen ved PCR ved hjælp af primere StUbi3P218R og ISceIR. Fortynd en portion af den resterende DNA samling reaktion med vand 1: 5. Brug 1 pi som en positiv kontrol for kolonien skærm og 1 ng af cirkulær p201N: Cas9 plasmid som en no-insert kontrol.
- PCR forstærke de betingelser; 95 ° C i 3 min; 31 cykler (95 ° C i 30 sek, 58 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek); og ved 72 ° C i 5 min. Visualisere PCR-produkter på en 1% agarosegel. Sørg for, at korrekte indsættelser har et band på 725 bp og vektorer without skær (f.eks uncut vektor) vil have en 310-bp band.
- Grow positive kolonier i LB Kan 50 flydende kulturer natten over ved 37 ° C og oprense plasmider ifølge producentens instruktioner. Sanger sekvens plasmider med StUbi3P218R primer og tilpasse kromatogrammer til MtU6 promoter, mål og stillads sekvenser for at sikre, at ingen fejl blev indført under kloning.
- Udfør en diagnostisk fordøje ved at fordøje ~ 1 ug plasmid med Eco RV og Sty I. Visualisere på en 0,8% agarosegel. Fragmenter (i bp) er: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, og 174.
- Brug DNA forsamling til at konstruere vektorer med flere gRNAs.
- For at konstruere en vektor med to gRNA kassetter, PCR amplificere den første-stillingen gRNA med primerne Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR og den anden-stillingen gRNA med primerne UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR fra 1 ng af hver af de respektiveplasmider konstrueret i trin 1.1 - 1.8. Brug PCR-betingelserne i trin 1.3.3. Visualisere ~ 3 pi alikvoter af PCR-produkter på en 1% agarosegel for at bekræfte amplifikation. Amplikoner ~ 500 bp.
- Kombiner og blandes omtrent lige mængder af un-oprenset PCR-produkter i en 200 pi rør (typisk 3 - 4 pi af hver). For montage, tilsættes 1 pi kombineret PCR-produkter, 50 ng Swa I og Spe I lineariseret p201N: Cas9, laboratorie-grade vand til 2,5 pi og 2,5 ul 2x high-fidelity DNA samling mester mix. Inkuber i et 50 ° C termisk cyklusapparat i 15 min.
Bemærk: De DNA assembly manualer anbefaler en 15 min inkubation i 2 - 3 fragmenter. - Transform 1 - 2 pi ind i kompetente E. coli-celler og plade på LB Kan 50. Grow udpladede celler ved 37 ° C natten over. Gemme den resterende reaktionen ved -20 ° C.
- Colony skærmen ved PCR med primere StUbi3P218R og ISceIR med de samme betingelser som trin 1.6. Korrekt cLones vil have en 1.200 bp amplikon. Grow positive kolonier i LB Kan 50 flydende kulturer natten over og oprense plasmider.
- Sanger sekvens plasmider med primerne StUbi3P218R (dækker første-position gRNA) og p201R (dækker anden position gRNA). Juster kromatogrammer til MtU6 promotor, mål og stillads-sekvenser. Diagnostisk fordøje med Eco RV og Sty Jeg vil resultere i følgende fragmenter (i bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. fed fragment indeholder den anden gRNA.
- Efter mødet alle kvalitetskontrol forventninger, omdanne plasmider i Agrobacterium rhizogenes stammen ARqua1 15. Tilsæt 1 pi af plasmidet prep til 50 pi elektrokompetente celler og elektroporere i en 1 mm cuvette med indstillingerne: 2,4 kV, 25 uF og 200 Ω. Recover celler i ~ 500 pi SOC og rystes ved 28 ° C i 2 timer. Plade på LB Kan 50 og gro ved 28 ° C i 2 dage. Udfør koloni skærmen ved hjælp af de samme primere og PCR-betingelser som 1.3.3. Lav glycerol lagre fra positive kloner.
2. Behårede Root Transformation
- Sterilisere tomatfrø i 20% husholdningsblegemiddel i 15 minutter, under konstant blanding. I en laminar flow hætte, fjerne blegemiddel og vask i sterilt laboratorium-grade vand 3 gange.
- Plate 30 frø i en GA-7 kasse indeholdende ½ MS medier (2,22 g L -1 MS salte + Gamborg Vitaminer, 10 g L -1 saccharose, 3 g L -1 gellangummi, pH 5,8). Spire til ~ 2 dage i mørke, derefter flytte GA-7 kasser til lys. Grow frøplanter for ~ 4 flere dage i lyset.
- Dagen før transformation, streak ud A. rhizogenes kulturer på fast LB Kan 50 og vokse ved 28 ° C natten over.
- Dag transformation, i laminar flow hætte samle sterile materialer: 12 ml kultur rør, 50 ml konisk rør, ½ MS væske (ingen gellan gum), 200 uM acetosyringon, filtrerpapir, petriskåle, pincet og skalpel, pipetter og pipettespidser. Tilsæt 25 pi acetosyringon til 50 ml ½ MS og hæld ~ 6 ml i hver kultur rør.
- Brug en bøjet 200 pi tip til at skrabe A. rhizogenes celler fra pladen og resuspender i de 6 ml ½ MS væske. Vortex røret for helt at opblande cellerne. Efter resuspension celler fra hver vektor, måle den optiske densitet (OD) af 1 ml celler ved en fast bølgelængde på 600 nm. Sikre OD er mellem 0,2 og 0,4; fortynde eller tilføje flere celler efter behov. Gentag for hver konstruktion.
- Tilføj ~ 2 ml ½ MS væske til en petriskål med en steril filtrerpapir. Forbrugsafgifter kimblade fra de planter og sted på den fugtet filtrerpapir. Når alle kimbladene er blevet indsamlet, skar de distale ~ 1 cm ud af kimbladene, hvilket resulterer i cotyledon stykker med to afskårne ender. Tilføj eksplantater til A. rhizogenes opløsninger, bland og inkuber i 20 minmed lejlighedsvis invertere.
Bemærk: Ca. 12 eksplantater pr konstrukt anvendes rutinemæssigt, men så mange som 80 eksplantater er podet i 6 ml A. rhizogenes opløsning. - Under A. rhizogenes inkubation tilsættes filtrerpapir til petriskåle, én pr konstruktion forvandlet. Indstil også ½ MS faste medier, ingen antibiotika, i laminar flow hætte for at tørre.
- Scoop kimbladene ud af A. rhizogenes løsning med steril pincet og sted på tørt filtrerpapir. Dæk med Petri låg for at sikre væv ikke tørrer ud, mens du fortsætter til næste transformation. Blot kimblade på filtrerpapir og overførsel, abaxial side op, til ½ MS-medier. Wrap plader med kirurgisk tape og co-kultivere i mørke ved stuetemperatur i 2 dage.
- Efter samdyrkning overførsel kimblade, abaxial opad, til ½ MS-medium suppleret med 300 mg L -1 ticarcillin / clavulansyre (Tim 300, for at forhindre vækst af residual A. rhizogenes) og Kan 50 (for plantevalg) og wrap med kirurgisk tape. Vedligehold kulturer under fluorescerende lys ved stuetemperatur med en 16-timers fotoperiode.
- Efter ~ 1,5 - 2 uger rødder mindst 2 cm i længde udskæres fra kimbladene med steril pincet og en skalpel og overført til ½ MS Kan 50 Tim 300 medier. Overfør 10 til 15 rødder til en enkelt plade. Markér placeringen af de grundlæggende tips med en markør, wrap med kirurgisk tape, og vedligeholde i kultur værelse.
- Efter en uge, er transformerede rødder ses voksende på selektive medier. Harvest en delprøve af transformerede rødder til DNA-ekstraktion ved hjælp af den foretrukne DNA-ekstraktion metode. Bemærk: Plader med kimblade kan opbevares i 2 - 3 ugentlige høst, hvorefter peger rødderne vokse ind i en sammenfiltret rod og er vanskelige at isolere. Ikke høstet rodvæv kan opretholdes på ubestemt tid. En række assays kan udføres på det isolerede DNA-prøves at bestemme DNA mutation hyppighed og type. Resultater fra et par sådanne assays er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR vektor konstruktion med DNA samling genererer typisk ti til hundrede uafhængige kloner. Colony screening ved PCR nemt identificerer korrekte kloner og kan skelne mellem plasmider med og uden indsatse (Figur 2A), som er nyttige for fejlfinding. Typisk alle klonerne indeholder en indsats og en bruger kan vælge at springe koloni screening skridt helt. Diagnostiske fordøjelser (figur 2B) og Sanger-sekventering anvendes til kvalitetskontrol. Når der opstår fejl, er de normalt observeres i de overlappende DNA-regioner, dvs. 5'-enden af MtU6 promotoren, gRNA, eller 3'-enden af stilladset sekvens. Hvis flere gRNA oligoer samlet i en enkelt reaktion, er de gRNAs bestemt ved Sanger-sekventering. Indarbejdelsen af individuelle gRNAs er jævnt fordelt, og de fleste af de gRNAs kan isoleres fra en enkelt transformation (figur 2C (figur 2C).
Tomat hårrødder sædvanligvis observeres en til to uger efter transformation (figur 3A). Rødder ≥2 cm i længden udskæres og overføres til det selektive medium og kanamycinresistente rødder kan identificeres en uge senere (figur 3B). De fleste rødder vil vokse til en vis grad på selektive medier og rodvækst i transformerede rødder kan være variabel; hvis det er muligt, skal du vælge de mest energisk voksende rødder til analyse. En til to kanamycinresistente rødder er typisk udvindes pr cotyledon inokuleret. Med regelmæssige overførsler, kan transformerede rødder opretholdes på ubestemt tid på selektive medier.
DNA ekstraheres fra kanamycinresistente rødder og PCR anvendes til amplify målområdet (erne). PCR-produkter kan anvendes i en række assays til bestemmelse mutation effektivitet, såsom kloning og sekventering (figur 3C), restriktionsfragmentlængde-polymorfisme analyse, polyacrylamidgelelektroforese 16 (figur 3D), T7E1 endonuklease 16, eller high-throughput amplicon sekventering 10. Som rapporteret i andre CRISPR-plantesystemer 6, afhængigt af gRNA / målsekvens valgt, kan der observeres en række mutationer og mutation effektivitet.
. Figur 1. Princip for CRISPR Assembly I DNA samling reaktion, er fire DNA blandet sammen; p201N: Cas9 lineariseret med Swa I og Spe I (sort cirkel), MtU6 promotor (grøn pil), Scaffold (gul bar) og 60-mer gRNA oligo indeholder GN 19 målsekvensen (blue bar). Enderne af hvert DNA-molekyle overlapper 20 bp med det tilstødende stykke. DNA samlingsreaktionen rekombinerer disse DNA'er i et enkelt, cirkulært molekyle. Den StUbi3p218R og ISceIR primer bindingssteder er angivet med sorte pile, er 2x35S: Cas9 kassette er lilla, er StUbi3: nptll kassette er orange og venstre og højre grænser er angivet med grå bjælker. Bemærk:. Vector kort er ikke til at skalere Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Colony Screening og Plasmid Quality Control. A) Colony screening af 20 kloner fra DNA samling og transformation. M, 100 bp stige; +, P201N: Cas9: GFPT2 positiv kontrol; NI, p201N: Cas9 no-insert kontrol; GA, fortyndet DNA samlingsreaktionen; NT, kontrol uden template. B) Repræsentant digest af fire p201N: Cas9: gRNA vektorer med restriktionsenzymerne Eco RV og Sty I. M, 2-log stigen. C) Sammenligning af nøjagtighed for de standard og high-fidelity DNA montage blandinger og distribution af genvundne vektorer, når 11 gRNA oligoer blev samlet i en enkelt reaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Behårede Root Kulturer og Påvisning af DNA modifikation. A) Behårede rødder kan ses på vej ud af kimblade 11 dage efter transformation. B) Rødder udvælges på ½ MS Kan 50 medier for ca. en uge. Grå søjler angiver position rodspidserne på tidspunktet for plating. C) Eksempel på kloning ogsekventering til at bestemme DNA-mutationer med to forskellige gen-mål i fire forskellige behåret-root begivenheder. Grå boks betegner GN 20 GG målsekvens, Δ angiver typen af mutation, og antallet af kloner med den angivne mutation. D) Eksempel på polyacrylamidgelelektroforese at bestemme DNA-mutationer. Store sletninger og heteroduplex bands indikerer tilstedeværelsen af DNA-mutationer ved målsekvenserne. Seks af 12 uafhængige hændelser blev scoret som mutanter (Δ). WT, vildtype kontrol; NT, uden template kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Science Foundation tilskud IOS-1025642 (GBM). Vi takker Maria Harrison til tilvejebringelse af ARqua1 stamme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
