Summary
באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.
Introduction
היכולת ליצור שינויי DNA ממוקדים עם CRISPR / יש Cas9 פוטנציאל גדול ללימודי גנומיקה תפקודית. ישנם שני מרכיבים של מערכת CRISPR / Cas9; nuclease Cas9, נגזר pyogenes Staphylococcus ו RNA מדריך כ 100-NT (gRNA) מולקולה שמנתב Cas9 לאתר DNA ממוקד (ים) 1. זיהוי מטרות הוענק על היד הראשונה ~ 20-NT של gRNA, המאפשר לייצור תפוקה גבוהה של וקטורי מיקוד 2,3. רוב האורגניזמים שיכול להיות מהונדסים, כבר היה עם CRISPR / Cas9 הטכנולוגיה 4,5.
בצמחים, יזמים מכוננים, כמו המקדם 35S CaMV, משמשים בדרך כלל לנהוג הביטוי של nuclease Cas9 6. GRNAs באים לידי ביטוי באמצעות היזמים U6 או U3 RNA פולימראז III המגביל את הבסיס הראשון של gRNA או א G עבור U6 או עבור U3, שעתוק יעיל. עם זאת RNA פולימראז II לנשףoters, שהם ללא הגבלות אלה, יש גם שימש 7,8.
gRNAs שונים לגרום מוטציות DNA עם יעילות שונים, ולכן זה יכול להיות חשוב כדי לאמת וקטורים CRISPR הראשון לפני השקעה טרנספורמציות כל-צמח או הגדרת מסכי פנוטיפי נרחב. ביטוי חולף של CRISPR בונה בצמחים, באמצעות agroinfiltration למשל, בדרך כלל תוצאות בתדירות נמוכה יותר של שינוי ה- DNA לעומת צמחים יציבים 6, ביצוע זיהוי של מוטציות מבחני פנוטיפי קשות מעשיים עם גישות כאלה. מה שנקראו שורשי שעירים הם מערכת נוחה, חלופה מאז מספר רב של עצמאיים, חומרים טרנספורמציה ביציבות יכול להיוצר תוך מספר שבועות, בניגוד לחודשים לצמחים יציבים. וקטורי CRISPR יעילים מאוד גרימת מוטציות DNA ב שורשי שעירי 9,10.
שיטות הרכבת DNA ולקשור ביעילות שברת DNA המכיל overlapping מסתיים 11. יתרון עיקרי של כמה שיטות הרכבת DNA הוא היכולת לשלב ssDNA (כלומר, oligos) לתוך המוצרים הנאספים. מאז gRNAs הוא רק ~ 20-NT ארוך מטרות חדשות יכולות להתבצע עם oligos המסונתז, שיטות הרכבת DNA אלה בהחלט מתאימות לשיבוט CRISPR. הפרוטוקולים המתוארים כאן מבוססים על סדרת P201 של וקטורי CRISPR כי נעשה שימוש בהצלחת סויה 10, צפצפת 12 ועכשיו עגבניות. תהליך השכפול הציג מציע מספר יתרונות על פני שיטת השיבוט הנוכחית 10. כלומר, וקטורים מתפקדים במלואה יכולים להיוצר תגובת שיבוט יחידה ביום אחד. בניית וקטור ניתנת ותקווה גם כדי לייצר וקטורי CRISPR מרובים במקביל, מקטינה עוד יותר ידות על עלויות זמן וחומר. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול ההדור של שורשי שעירים עגבניים כמו שיטה יעילה להפקת חומרים מהונדסים עם מחיקות גן ממוקדות. שורשי שעירים משמשים תקףאכלו הווקטורים CRISPR ולספק חומר לניסויים הבאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב מדריך RNA ובינוי וקטור
- לזהות רצפי היעד עבור הגנים של עניין. יש מגוון של תוכניות יעד-מציאת CRISPR באינטרנט מתאימה בשלב זה 13,14.
הערה: כאן אנו משתמשים מוטיב היעד GN 20 GG, אבל עיצובים אחרים עשויים להיות מתאימים בהתאם למערכת יישום או וקטור בשימוש. - עיצוב 60-mer oligos gRNA לכלול את חלק 19 GN של מוטיבי היעד מוקפים 5 'ו 3' 20-NT רצפים שנדרשים הרכבת DNA. מוטיב 60-mer הסופי הוא: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 ".
הערה: רגיל, desalted פריימרים לעבוד בסדר. - הכן את הארבע DNAs להרכבה (איור 1). ראה קובץ משלים רצפי DNA.
- תקציר 1 - 5 מיקרוגרם של p201N: Cas9 10 פלסמיד עם אנזים הגבלה Spe לי ב 1x הצפת 4 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. טור-לטהר את לעכלccording להוראות היצרן. Resuspend ב ~ 15 μl של 10 mM Tris-HCl, ולכמת ידי spectrophotometry UV.
- בצע לעכל שני עם אנזים ההגבלה Swa לי ב 1x הצפת 3.1 ב 25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. בדקו 100 - 200 ng על ג'ל agarose 0.8% כדי לאשר עיכול שלם.
הערה: פלסמיד מתעכל כראוי יהיה להקה אחת ב 14,313 BP. הערה: איון חום של האנזים dephosphorylation אינו נדרש. פלסמיד מתעכל עשוי להיות מאוחסן ב -20 ° C. - PCR להגביר את truncatula Medicago (הר) DNAs האמרגן פיגום U6 מן הפלסמיד Puc gRNA הסעות 10 באמצעות פריימרים Swa I_MtU6F / MtU6R ו ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, בהתאמה. השתמש פולימראז באיכות גבוהה עם תנאי PCR: 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 31 מחזורים (98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות); ו 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- דמיינו ~ 3 aliquots μl של pr PCRoducts על ג'ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicon MtU6 הוא 377 נ"ב ואת amplicon הפיגום הוא 106 נ"ב. טור-לטהר את מוצרי ה- PCR שנותרו על פי הוראות היצרן, לכמת ידי לספקטרופוטומטריה UV ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- Resuspend הצינור כולו של oligos gRNA 100 מיקרומטר במים מעבדה כיתה. הוסף 1 μl של 100 מיקרומטר אוליגו 500 μl של 1x הצפת 2.1. מערבבים היטב. אם איגום oligos המרובה, להוסיף 1 μl של כל אוליגו 100 מיקרומטר אל צינור 1x הצפת 2.1. oligos המדולל ניתן לאחסן ב -20 ° C.
- לתכנת Cycler תרמית להחזיק ב 50 מעלות צלזיוס, באמצעות מכסה מחומם. מערבבים 100 ננוגרם (0.011 pmol) של וקטור לינארית, 50 ng (0.2 pmol) של האמרגן MtU6, 12 ng (0.2 pmol) של הפיגום, 1 μl (0.2 pmol) של אוליגו gRNA מדולל (ים), ומים בהיקף של 5 μl. הוסף 5 μl של תמהיל מאסטר הרכבה DNA באיכות גבוהה 2x, מערבבים היטב ספין למטה. דגירת תגובה במשך 60 דקות ב50 ° C Cycler תרמית. אז במקום את התגובה על הקרח.
הערה: ניתן להגדיל כמויות תגובה כדי להתאים תשואות DNA נמוכות. - Transform 2 μl של התגובה לתוך E. המוסמכת קולי תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות צלחת על LB בתוספת 50 מ"ג ל -1 kanamycin (Kan 50). לגדול-תאים מצופים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שמור את תגובת ההרכבה DNA הנותר ב -20 ° C.
- מסך המושבה על ידי PCR באמצעות פריימרים StUbi3P218R ו ISceIR. לדלל aliquot של תגובת ההרכבה DNA הנותרת במים 1: 5. השתמש 1 μl כביקורת חיובית עבור מסך המושבה 1 ננוגרם של p201N המעגלי: פלסמיד Cas9 כביקורת ללא הוספה.
- PCR להגביר את התנאים; 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 31 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות); ו ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דמיינו מוצרי ה- PCR על ג'ל 1% agarose. ודא הוספות נכונות יש להקה ב 725 נ"ב ו וקטורי שנינותמוסיף Hout (למשל, וקטור נימול) תהיה להקה 310-BP.
- לגדול מושבות חיוביות LB Kan 50 תרבויות נוזלי הלילה בשעת 37 ° C ולטהר פלסמידים פי הוראות היצרן. רצף סנגר פלסמידים עם פריימר StUbi3P218R וליישר chromatograms אמרגן MtU6, היעד, רצפי הפיגום כדי להבטיח שאין טעויות הוכנסו במהלך שיבוט.
- בצע אבחון לעכל ידי לעכל ~ 1 מיקרוגרם של פלסמיד עם RV אקו ואני בדיר דמיינו על ג'ל 0.8% agarose. שברים (ב BP) הם: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, ו -174.
- השתמש הרכבת DNA לבנות וקטורים עם gRNAs המרובה.
- כדי לבנות וקטור עם שתי קלטות gRNA, PCR להגביר את gRNA-העמדה הראשונה עם פריימרים Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR ואת gRNA שנייה עמדה עם פריימרים UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR מ -1 ng של כל אחד בהתאמהפלסמידים נבנה בשלבים 1.1 - 1.8. השתמש תנאי PCR בשלב 1.3.3. דמיינו ~ 3 aliquots μl של מוצרי ה- PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicons הם ~ 500 נ"ב.
- מערבבים ומערבבים כמויות שווה של מוצרי ה- PCR מטוהרים האו"ם בתוך שפופרת 200 μl (בדרך כלל 3 - 4 μl של כל אחד). להרכבה, להוסיף 1 μl בשילוב מוצרי ה- PCR, 50 ng של Swa לי ו SPE שאני לינארית p201N: Cas9, מים מעבדה כיתה 2.5 μl 2.5 μl של תמהיל מאסטר הרכבה DNA באיכות גבוהה 2x. מדגירים את Cycler תרמית 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
הערה: מדריכי DNA ההרכבה ממליץ על דגירת 15 דקות עבור 2 - 3 שברים. - Transform 1 - 2 μl לתוך E. המוסמכת תאי צלחת coli על LB Kan 50. לגדל תאים מצופים ב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. שמור את התגובה הנותרים ב -20 ° C.
- מסך מושבה על ידי PCR עם פריימרים StUbi3P218R ו ISceIR עם אותם התנאים כמו צעד 1.6. ג הנכונהlones תהיה amplicon 1,200 נ"ב. לגדול מושבות חיוביות LB Kan 50 תרבויות נוזלי הלילה ולטהר פלסמידים.
- פלסמידים רצף סנגר עם StUbi3P218R פריימרים (מכסה-העמדה הראשונה gRNA) ו p201R (מכסה-העמדה השנייה gRNA). יישר chromatograms אל רצפי אמרגן, יעד, פיגום MtU6. האבחון לעכל עם RV אקו בדיר שאני אביא את שהברים הבאים (נ"ב): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. שבר מודגש מכיל את gRNA השני.
- אחרי הפגישה כל הציפיות-בקרת איכות, להפוך פלסמידים לתוך Agrobacterium rhizogenes זן ARqua1 15. הוסף 1 μl של הכנה פלסמיד 50 μl של תאים electrocompetent ו electroporate ב קובט 1 מ"מ עם הגדרות: 2.4 קילו וולט, 25 μF, ו -200 Ω. שחזור תאים ~ 500 μl של SOC ולנער על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. פלייט על LB Kan 50 גרםשורה על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. בצע מסך המושבה באמצעות באותו פריימרים ותנאי PCR כמו 1.3.3. הפוך מניות גליצרול של שיבוטים חיוביים.
2. טרנספורמציה שעירים שורש
- לעקר זרעי עגבניות ב אקונומיקה ביתית 20% במשך 15 דקות, עם ערבוב מתמיד. במנדף זרימה למינרית, להסיר את האקונומיקה ולשטוף במי מעבדת כיתה סטריליים 3 פעמים.
- פלייט 30 זרעים בקופסה GA-7 המכיל התקשורת ½ MS (2.22 גרם ל -1 מלחים MS + Gamborg ויטמינים, 10 גרם ל -1 סוכרוז, 3 גרם ל -1 מסטיק gellan, pH 5.8). לנבוט עבור ~ 2 ימים בחושך, ואז לעבור GA-7 תיבות אור. לגדל שתילים עבור ~ 4 ימים יותר באור.
- היום לפני השינוי, מתוך פס א rhizogenes תרבויות על LB Kan 50 ולגדול מוצק ב 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- יום של טרנספורמציה, בשכונת הזרימה למינרית להרכיב חומרים מעוקרים: 12 מיליליטר צינורות תרבות, 50 מ"ל צינור חרוטים, ½ נוזל MS (לא גרם gellanאממ), 200 מיקרומטר acetosyringone, נייר סינון, צלחות פטרי, מלקחיים אזמל, טפטפות וטיפים פיפטה. הוסף 25 μl של acetosyringone 50 מ"ל של ½ MS ויוצקים ~ 6 מ"ל לתוך צינור אחד תרבות.
- השתמש טיפ 200 μl כפוף לגרד א rhizogenes תאים מהצלחת ו resuspend ב 6 מ"ל של נוזל ½ MS. הצינור וורטקס resuspend התאים לחלוטין. לאחר resuspending תאים מפני כל וקטור, למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של 1 מיליליטר של תאים באורך גל קבוע של 600 ננומטר. ודא OD הוא בין 0.2 ו 0.4; לדלל או להוסיף עוד תאים לפי הצורך. חזור על הפעולה עבור כל מבנה.
- הוסף ~ 2 מ"ל של נוזל ½ MS כדי בצלחת פטרי עם נייר סינון סטרילי. cotyledons בלו מן השתילים ומניחים על נייר פילטר טבול. לאחר כל cotyledons כבר נאספו, לחתוך את דיסטלי ~ 1 ס"מ הנחה של cotyledons, וכתוצאה מכך חלקים טבורית עם שני הקצוות לחתוך. להוסיף explants א פתרונות rhizogenes, לערבב, דגירה במשך 20 דקותעם היפוך מזדמן.
הערה: כ 12 explants לכל לבנות משמשים באופן שגרתי, אם כי רבים כמו 80 explants כבר מחוסן ב 6 מ"ל של א פתרון rhizogenes. - במהלך א דגירת rhizogenes, להוסיף נייר סינון כדי צלחות פטרי, לבנות לכל אחד טרנספורמציה. כמו כן נקבע ½ MS תקשורת מוצקה, ללא אנטיביוטיקה, בשכונת הזרימה למינרית לייבוש.
- סקופ cotyledons מתוך א פתרון rhizogenes עם מלקחיים ומניחים סטרילי על נייר סינון יבש. מכסים עם מכסה פטרי כדי להבטיח רקמות שלא יתייבשו תוך שתמשיך השינוי הבא. cotyledons הכתם על נייר הסינון והעברה, abaxial כלפי מעלה, כדי ½ תקשורת MS. גלישת צלחות עם הקלטת וכירורגי שיתוף לטפח בחושך בטמפרטורת החדר למשך 2 ימים.
- לאחר שיתוף טיפוח, cotyledons העברה, abaxial כלפי מעלה, כדי ½ התקשורת MS בתוספת 300 מ"ג ל -1 ticarcillin / חומצה clavulanic (טים 300, כדי למנוע את צמיחת residרע"מ א rhizogenes) ו קאן 50 (לבחירת צמח) ולעטוף בעזרת פלסטר. לשמור על תרבויות תחת אורות הניאון בטמפרטורת החדר עם photoperiod 16 שעות ביממה.
- לאחר ~ 1.5 - 2 שורשים שבועות לפחות 2 ס"מ אורך הם נכרת מן cotyledons באמצעות מלקחיים סטרילית אזמל והועברו ½ MS Kan 50 טים 300 מדיה. העבר 10 עד 15 שורשי צלחת אחת. סמן את המיקום של טיפים שורש בטוש, לעטוף בעזרת פלסטר, ולשמור בחדר התרבות.
- אחרי שבוע אחד, שורשי טרנספורמציה נראים הגוברים על התקשורת סלקטיבית. בציר subsample של שורשי טרנספורמציה להפקת DNA בשיטת DNA שאיבת המועדפת. הערה: צלחות עם cotyledons יכולות להישמר במשך 2 - 3 יבולים שבועיים, ולאחר מכן הם השורשים לצמוח לתוך בלגן סבוך וקשים לבודד. יכול להישמר רקמות השורש ללא שנקטפו ללא הגבלת זמן. מגוון של מבחנים יכול להתבצע על דגימת DNA המבודדתים כדי לקבוע תדירות מוטציה בדנ"א וסוג. תוצאות מכמה מבחנים כאלה מתוארות להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניית וקטור CRISPR עם הרכבת DNA בדרך כלל מייצרת עשרות עד מאה שיבוטים עצמאיים. הקרנת מושבה על ידי PCR בקלות מזהה שיבוטים נכונים ויכולה להבחין בין פלסמידים עם ובלי הוסיף (איור 2 א) וזה שימושי לפתרון בעיות. בדרך כלל, כל השיבוטים מכילים אינסרט לבין משתמש יכול לבחור לדלג על שלבי הקרנת מושבה לגמרי. מעכל אבחון (איור 2 ב) ו רצף סנגר משמשים לבקרת איכות. כאשר טעויות מתרחשות, הם בדרך כלל הם נצפו באזורי DNA החופפים, כלומר, "סוף אמרגן MtU6, את gRNA, או 3 '5 בסוף רצף הפיגום. אם oligos gRNA המרובה הם אספו לתוך תגובה אחת, gRNAs נקבע על ידי רצף סנגר. השילוב של הפרט gRNAs מופץ באופן שווה ורוב gRNAs יכול להיות מבודד טרנספורמציה יחיד (איור 2 ג (איור 2 ג).
עגבניות שורשים שעירים בדרך כלל הם נצפו שבוע עד שבועיים לאחר השינוי (איור 3 א). שורשים ≥2 ס"מ אורך הם נכרת והועברו מצע סלקטיבי ושורשים עמידים kanamycin ניתן לזהות אחרי שבוע (איור 3B). רוב השורשים יגדלו במידה מסוימת על תקשורת סלקטיבית וצמיחת שורש שורשים שינו יכול להיות משתנה; אם ניתן, בחר את השורשים הגדלים ביותר נמרצות לניתוח. אחת לשני שורשים עמידים kanamycin הם בדרך כלל התאושש לכל טבורית מחוסן. עם העברות קבועות, שורשי טרנספורמציה יכולים להישמר ללא הגבלה זמן על תקשורת סלקטיבית.
DNA מופק שורשים עמידים kanamycin ו- PCR משמש ומחזקיםy באזור היעד (ים). מוצרי ה- PCR יכולים לשמש במגוון של מבחנים כדי לקבוע את יעילות מוטציה, כגון שיבוט וסדר (איור 3 ג), ניתוח פולימורפיזם אורך קטע הגבלה, ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide 16 (איור 3D), T7E1 endonuclease 16, או רצף amplicon תפוקה גבוהה 10. כפי שדווח במערכות צמח-CRISPR אחרים 6, תלוי ברצף gRNA / היעד הנבחר, מגוון של מוטציות יעילות מוטציה אפשר לראות.
. עיקרון באיור 1. אסיפת CRISPR בשנת תגובת הרכבת DNA, ארבעה DNAs מעורבבים יחד; p201N: Cas9 לינארית עם Swa לי ו SPE אני (העיגול שחור), אמרגן MtU6 (חץ ירוק), פיגום (פס צהוב) ואת אוליגו gRNA 60-mer המכיל את רצף היעד 19 GN (בlue בר). הקצוות של כל מולקולת הדנ"א חופפים 20 נ"ב עם החתיכה הסמוכה. תגובת DNA ההרכבה משלבת מחדש DNAs אלה לתוך מולקולה בודדת, עגולה. פריימר StUbi3p218R ו ISceIR אתרי קישור מסומן חיצים שחורים, 2x35S: קלטת Cas9 היא סגולה, StUbi3: קלטת nptII היא כתומה והשאיר וגבולות תקינים מסומנים עם פסים אפורים. הערה:. מפת הווקטור הוא לא בקנה מידה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הקרנת מושבת איור 2. פלסמיד בקרה איכות. א) הקרנת מושבה של 20 שיבוטים של הרכבת DNA וטרנספורמציה. M, סולם 100-BP; +, P201N: Cas9: שליטה חיובית GFPT2; NI, p201N: שליטה ללא הוספה Cas9; GA, תגובת הרכבה המדוללת DNA; NT, ללא תבנית מלאה. B) נציג תקציר של ארבעה p201N: Cas9: וקטורי gRNA עם הגבלת אנזימי RV אקו בדיר א M, 2-יומן סולם. ג) השוואה בין הנאמנות של ההתקן ותערובות הרכבת DNA באיכות גבוהה והפצה של וקטורים התאוששו כאשר 11 oligos gRNA היה נקווה לתוך לתגובה אחת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תרבויות שעירים שורש וזיהוי של שינוי ה- DNA. א) שורשים שעירים ניתן לראות העולה מתוך cotyledons 11 ימים לאחר השינוי. B) שורשים נבחרו על התקשורת 50 ½ MS קאן עבור כשבוע. ברי גריי לציין עמדת טיפי שורש בשעת הציפוי. C) דוגמא של שיבוטרצף לקבוע מוטציות DNA עם שתי מטרות גן שונות בארבעה אירועים שעיר-שורש שונים. תיבת גריי מציינת רצף יעד GN 20 GG, Δ מציין סוג של מוטציה, ואת מספר השיבוטים עם המוטציה המצוינת. D) דוגמא של ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide לקבוע מוטציות DNA. מחיקות גדולות ולהקות heteroduplex להעיד על נוכחות של מוטציות DNA על רצפי היעד. שש מתוך 12 אירועים עצמאיים דורגו כמו מוטציות (Δ). WT, בקרת wild-type; NT, ללא תבנית שליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע מענק IOS-1025642 (GBM). אנו מודים מריה הריסון למתן את המתח ARqua1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
