Summary
Ved hjelp av DNA-sammenstillingen, kan flere CRISPR vektorer konstrueres i parallell i et enkelt klonings reaksjon, noe som gjør konstruksjonen av et stort antall vektorer CRISPR en enkel oppgave. Tomat hårete røtter er en utmerket modellsystem for å validere CRISPR vektorer og generere mutante materialer.
Introduction
Evnen til å generere målrettede DNA modifikasjoner med CRISPR / Cas9 har stort potensial for funksjonell genomstudier. Det er to komponenter av CRISPR / Cas9 system; den Cas9 nuklease, avledet fra Staphylococcus pyogenes og en ca 100-nt guide RNA (gRNA) molekyl som dirigerer Cas9 til målrettede DNA nettsted (er) 1. Målgjenkjenning er gitt av den første ~ 20-nt av gRNA, som gir mulighet for high-throughput produksjon av målretting vektorer 2,3. De fleste organismer som kan være konstruert, allerede har vært med CRISPR / Cas9 teknologi 4,5.
I planter, konstitutive promotorer, slik som CaMV 35S-promoteren, blir ofte anvendt for å drive ekspresjonen av Cas9 nuklease 6. De gRNAs uttrykkes ved hjelp av RNA-polymerase III-U6 eller U3 promotorer som begrenser den første basen av gRNA til enten en G, for U6, eller A for U3, for effektiv transkripsjon. Men RNA polymerase II promoters, som er fri for disse begrensningene, er også blitt anvendt 7,8.
Ulike gRNAs indusere DNA mutasjoner med ulik effektivitet, og så det kan være viktig å først validere CRISPR svektorer før du investerer i hel-anlegget transformasjoner eller sette opp store fenotypiske skjermer. Transient ekspresjon av CRISPR konstruerer i planter, ved hjelp av agroinfiltration for eksempel, vanligvis resulterer i en lavere hyppighet av DNA modifikasjon i forhold til stabile planter 6, noe som gjør deteksjon av mutasjoner vanskelige og fenotypiske analyser upraktisk med slike tilnærminger. Såkalte hårete røtter er en enkel, alternativt system ettersom et stort antall av uavhengige, stabilt transformerte materialer kan genereres i løpet av uker, i motsetning til måneder for stabile planter. CRISPR vektorer er svært effektiv på å indusere DNA mutasjoner i hårete røtter 9,10.
DNA monteringsmetoder effektivt ligere DNA-fragmenter som inneholder overlapping slutter 11. En stor fordel med enkelte DNA montering metoder er evnen til å inkorporere ssDNA (dvs. oligoer) inn i de sammenstilte produkter. Siden gRNAs er bare ~ 20-nt lang og nye mål kan fremstilles med syntetiske oligonukleotider, DNA disse monteringsmetoder er velegnet til å CRISPR kloning. Protokollene er beskrevet her er basert på P201 serie CRISPR vektorer som har blitt brukt i soya 10, poppel 12 og nå tomat. Kloningsprosedyren presentert tilbyr flere fordeler i forhold til dagens kloningsfremgangsmåten 10. Nemlig, kan fullt ut funksjonell vektorer bli generert i et enkelt klonings reaksjon på en enkelt dag. Vector konstruksjon kan også bli slått sammen for å generere flere CRISPR vektorer i parallell, noe som ytterligere reduserer hands-on tid og materialkostnader. Vi presenterer også en protokoll for generering av tomat hårete røtter som en effektiv metode for å fremstille transgene materialer med målrettede genet delesjoner. Hårete røtter blir brukt til gyldigspiste CRISPR vektorer og gi materiale for etterfølgende eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Guide RNA Design og Vector Construction
- Idenitifisere sekvenser for genene av interesse. Det finnes en rekke online CRISPR måls finne programmer som passer for dette trinnet 13,14.
MERK: Her bruker vi GN 20 GG mål motiv, men andre design kan være egnet, avhengig av programmet eller vektorsystem som brukes. - Design 60-mer oligonukleotidene gRNA til å inkludere GN 19 parti av målet motivene flankert av 5 'og 3' 20-nt-sekvenser som er nødvendige for DNA-sammenstillingen. Den endelige 60-mer Motivet er: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
MERK: Standard, avsaltet primere fungere fint. - Forbered de fire DNA for montering (figur 1). Se utfyllende fil for DNA-sekvenser.
- Fordøye 1 - 5 ug p201N: Cas9 10 plasmidet med restriksjonsenzymet Spel i 1 x buffer 4 ved 37 ° C i 2 timer. Kolonne-rense fordøye enccording til produsentens instruksjoner. Resuspender i ~ 15 ul 10 mM Tris-HCl, og kvantifisere ved hjelp av UV-spektrofotometri.
- Utføre en andre fordøye med restriksjonsenzymet Sw I i 1 x buffer 3,1 ved 25 ° C i 2 timer. Sjekk 100-200 ng på en 0,8% agarosegel for å bekrefte fullstendig fordøyelse.
MERK: En riktig fordøyd plasmid vil ha et enkelt band på 14 313 bp. Merk: Termisk inaktivering av enzymet og defosforylering er ikke nødvendig. Fordøyd plasmid kan lagres ved -20 ° C. - PCR forsterke Medicago truncatula (Mt) U6 promoter og stillas DNA fra pUC gRNA Shuttle 10 plasmid ved hjelp av primere Swa I_MtU6F / MtU6R og ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR hhv. Bruk en Hi-Fi-polymerase med den PCR-betingelser: 95 ° C i 3 minutter; 31 sykluser (98 ° C i 20 sekunder, 60 ° C i 15 sek, 72 ° C i 30 sek); og 72 ° C i 5 minutter.
- Visualiser ~ 3 pl prøver av PCR products på en 1% agarosegel for å bekrefte forsterkning. Den MtU6 amplicon er 377 bp og stillaset amplicon er 106 bp. Kolonne-rense de resterende PCR produktene i henhold til produsentens anvisninger, kvantifisere ved UV spektrofotometri og oppbevares ved -20 ° C.
- Resuspender hele røret for gRNA oligoer til 100 uM i laboratorie-grad vann. Tilsett 1 mL av 100 mikrometer oligo til 500 mL av 1x buffer 2.1. Bland godt. Hvis pooling flere oligonukleotider, tilsett 1 mL av hver 100 mikrometer oligo til 1x buffer 2,1 tube. Utvannet oligos kan oppbevares ved -20 ° C.
- Programmere en termosykler til å holde ved 50 ° C, ved hjelp av et oppvarmet lokk. Kombiner 100 ng (0,011 pmol) av linearisert vektor, 50 ng (0,2 pmol) av MtU6 promoter, 12 ng (0,2 pmol) av stillaset, 1 pl (0,2 pmol) av fortynnet gRNA oligo (r), og vann til et volum av 5 pl. Tilsett 5 mL av 2x high-fidelity DNA montering mester mix, bland godt og spinn ned. Inkuber reaksjon i 60 minutter i50 ° C termosykler. Deretter plasserer reaksjonen på is.
Merk: Reaction volumer kan økes for å imøtekomme lave DNA avkastning. - Transform 2 ul av reaksjonsblandingen inn i kompetente E. coli-celler ved bruk av standardteknikker og plate på LB supplert med 50 mg L -1 kanamycin (KAN 50). Vokse belagt-cellene ved 37 ° C over natten. Lagre de resterende DNA forsamlingen reaksjon ved -20 ° C.
- Colony skjermen ved PCR med primere StUbi3P218R og ISceIR. Fortynn en aliquot av den resterende DNA-sammenstillingen reaksjon med vann 1: 5. Bruk 1 mL som en positiv kontroll for kolonien skjerm og 1 ng av sirkulær p201N: Cas9 plasmid som et nei-insert kontroll.
- PCR forsterke med forholdene; 95 ° C i 3 minutter; 31 sykluser (95 ° C i 30 sek, 58 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek); og ved 72 ° C i 5 minutter. Visual PCR-produktene på en 1% agarosegel. Kontroller at riktig innsetting har et band på 725 bp og vektorer viddHout innsatser (f.eks uncut vektor) vil ha en 310-bp band.
- Grow positive kolonier i LB Kan 50 flytende kulturer over natten ved 37 ° C og rense plasmider i henhold til produsentens instruksjoner. Sanger sekvens plasmider med StUbi3P218R primer og justere kromatogrammene til MtU6 Arrangøren, mål og stillas sekvenser for å sikre at ingen feil ble introdusert i løpet kloning.
- Utfør en diagnostisk fordøye ved å fordøye ~ 1 mikrogram av plasmid med Eco RV og Sty I. Visualisere på en 0,8% agarosegel. Fragmenter (i bp) er: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, og 174.
- Bruk DNA forsamlingen til å konstruere vektorer med flere gRNAs.
- For å konstruere en vektor med to gRNA kassetter, PCR-amplifisere den første-stillingen gRNA med primerne Sw I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR og den andre-stillingen gRNA med primerne UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR fra 1 ng av hver av de respektiveplasmider bygget i trinn 1.1 - 1.8. Bruk PCR-betingelser i trinn 1.3.3. Visual ~ 3 mL alikvoter av PCR-produktene på en 1% agarosegel for å bekrefte forsterkning. Amplikonene er ~ 500 bp.
- Kombiner og bland tilnærmet like mengder av un-rensede PCR-produktene på en 200 mL rør (typisk med 3 - 4 mL av hver). For montering, tilsett 1 mL kombinert PCR-produkter, 50 ng Swa I og Spe jeg linearisert p201N: Cas9, laboratorie-grade vann til 2,5 mL og 2,5 mL av 2x high-fidelity DNA montering mester mix. Inkuberes i et 50 ° C thermal cycler i 15 min.
Merk: DNA monteringsanvisninger anbefaler en 15 min inkubasjon i 2 - 3 fragmenter. - Transform 1 - 2 mL inn i kompetente E. coli-celler og plate på LB Kan 50. Dyrk celler belagt ved 37 ° C over natten. Lagre de resterende reaksjon ved -20 ° C.
- Colony skjermen ved PCR med primere StUbi3P218R og ISceIR med samme vilkår som steg 1,6. riktig cLones vil ha en 1200 bp fragment. Grow positive kolonier i LB Kan 50 flytende kulturer over natten og rense plasmider.
- Sanger sekvens plasmider med primere StUbi3P218R (dekker førsteposisjon gRNA) og p201R (dekker andre posisjoner gRNA). Juster kromatogrammene til MtU6 promoter, mål, og stillas sekvenser. Diagnostic fordøye med Eco RV og svinesti jeg vil resultere i følgende fragmenter (i bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, inneholder 174. uthevet fragment den andre gRNA.
- Etter møte alle kvalitetskontroll forventninger, forvandle plasmider inn Agrobacterium rhizogenes belastning ARqua1 15. Tilsett 1 pl av plasmidet prep til 50 ul av elektrokompetente celler og electroporate i en 1 mm kyvette med innstillingene: 2,4 kV, 25 uF, og 200 Ω. Gjenopprette celler i ~ 500 mL av SOC og rist ved 28 ° C i 2 timer. Plate på LB Kan 50 og grad ved 28 ° C i 2 dager. Utfør koloni skjermen ved hjelp av de samme primere og PCR-forhold som 1.3.3. Gjør glyserol aksjer fra positive kloner.
2. Hårete Root Transformation
- Steril tomat frø i 20% klorin i 15 minutter, med konstant blanding. I en laminær hette, fjerne blekemiddel og vask i sterilt laboratorium-grade vann 3 ganger.
- Plate 30 frø i en GA-7 boks som inneholder ½ MS media (2,22 g L -1 MS salter + Gamborg Vitaminer, 10 g L -1 sukrose, 3 g L -1 gellangummi, pH 5,8). Spire til ~ 2 dager i mørke, og deretter flytte GA-7 bokser til lys. Forkultiver for ~ 4 dager i lyset.
- Dagen før transformasjon, strek ut A. rhizogenes kulturer på fast LB Kan 50 og vokse ved 28 ° C over natten.
- Day of transformasjon, i laminær hette montere sterile materialer: 12 ml kultur rør, 50 ml konisk tube, ½ MS væske (ingen gellan gum), 200 pM acetosyringone, filter papir, petriskåler, pinsett og skalpell, pipetter og pipettespisser. Legg 25 ul av acetosyringone til 50 ml ½ MS og hell ~ 6 ml i hver kultur rør.
- Bruk en bøyd 200 mL tips å skrape A. rhizogenes cellene fra platen og resuspender i 6 ml ½ MS væske. Vortex-røret for å resuspendere cellene. Etter resuspendering celler fra hver vektor, måle den optiske tetthet (OD) av 1 ml av cellene ved en fast bølgelengde på 600 nM. Sørg for OD er mellom 0,2 og 0,4; fortynne eller legge til flere celler som nødvendig. Gjenta for hver konstruksjon.
- Legg ~ 2 ml ½ MS væske til en petriskål med en steril filterpapir. Avgifts cotyledons fra spirene og sted på fuktet filterpapiret. Når alle cotyledons har blitt samlet, kuttet de distale ~ 1 cm ut av cotyledons, noe som resulterer i cotyledon stykker med to kutt endene. Legg explants til A. rhizogenes løsninger, bland, og inkuberes i 20 minmed sporadiske invertere.
Merk: Omtrent 12 explants per konstruere brukes rutinemessig, men så mange som 80 explants har blitt vaksinert i 6 ml A. rhizogenes løsning. - Under A. rhizogenes inkubasjon, legge filter papir til petriskåler, én per konstruere forvandlet. Også satt ½ MS faste medier, ingen antibiotika, i laminær hette til tørk.
- Scoop cotyledons ut av A. rhizogenes løsning med steril pinsett og legg dem på tørt filterpapir. Dekk med Petri lokk for å sikre vev ikke tørker ut mens du fortsetter til neste transformasjon. Blot cotyledons på filterpapiret og overføring, abaxial siden opp til ½ MS media. Vikle plater med kirurgisk tape og co-dyrke i mørket ved romtemperatur i 2 dager.
- Etter ko-dyrking, overføring Cotyledon, abaxial side opp, til ½ MS media supplementert med 300 mg L -1 ticarcillin / klavulansyre (Tim 300, for å hindre vekst av residUAL A. rhizogenes) og Kan 50 (for anlegget valg) og pakk med kirurgisk tape. Oppretthold kulturer Under fluorescerende lys ved romtemperatur med en 16-timers daglengde.
- Etter ~ 1,5 - 2 uker røtter på minst 2 cm i lengde ble skåret fra cotyledons ved hjelp av sterile pinsetter og en skalpell og overført til ½ MS Kan 50 tim 300 media. Overfør 10 til 15 røtter til en enkelt plate. Markere posisjonen til roten tips med en markør, wrap med kirurgisk tape, og opprettholde i kultur rommet.
- Etter en uke blir transformert røtter sett vokser på det selektive medium. Høste subsample av transform røtter for DNA ekstraksjon ved hjelp av den foretrukne DNA-ekstraksjon metoden. Merk: Plater med cotyledons kan holdes i 2 - 3 ukentlige avlinger, etter som peker røttene vokse inn i en stor floke og er vanskelig å isolere. Ikke høstes rot vev kan opprettholdes på ubestemt tid. En rekke analyser kan bli utført på det isolerte DNA-prøvens for å bestemme DNA-mutasjonsfrekvens og type. Resultater fra noen slike analyser er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR vektor konstruksjon med DNA enhet genererer vanligvis titalls til hundrevis av uavhengige kloner. Colony screening ved PCR lett identifiserer riktige kloner og kan skille mellom plasmider med og uten innsatser (Figur 2A) som er nyttig for feilsøking. Vanligvis er alle klonene inneholder en innsats og en bruker kan velge å hoppe over de koloniscreeningstrinn helt. Diagnostiske fordøyer (figur 2B) og Sanger-sekvensering blir anvendt for kvalitetskontroll. Når det oppstår feil, er de som vanligvis observeres i de overlappende DNA-områder, dvs. den 5 'ende av den MtU6 promoteren, gRNA, eller den 3'-ende av stillaset sekvensen. Hvis flere gRNA oligoer ble slått sammen i en enkelt reaksjon, blir gRNAs bestemmes av Sanger-sekvensering. Inkorporering av de enkelte gRNAs er jevnt fordelt, og de fleste av de gRNAs kan isoleres fra en enkelt transformasjon (figur 2C (figur 2C).
Tomat hårete røtter observeres vanligvis en til to uker etter transformasjon (figur 3A). Røtter ≥2 cm i lengde blir skåret ut og overført til selektivt medium og kanamycin-resistente røtter kan identifiseres en uke senere (figur 3B). De fleste røtter vil vokse til en viss grad på selektive medier og rotvekst i transform røtter kan være variabel; Hvis det er mulig, velger de kraftig voksende røtter for analyse. En til to kanamycin-resistente røtter er vanligvis utvinnes per cotyledon vaksinert. Med regelmessige overføringer, kan transformeres røtter opprettholdes på ubestemt tid på selektive medier.
DNA blir ekstrahert fra kanamycin-resistente røtter og PCR blir brukt for å forsterker;y mål-region (r). PCR-produkter kan brukes i en rekke forsøk for å bestemme mutasjon effektivitet, for eksempel kloning og sekvensering (figur 3C), rflp analyse, polyakrylamid-gelelektroforese 16 (figur 3D), T7E1 endonuklease 16, eller high-throughput fragment sekvense 10. Som rapportert i andre CRISPR-plantesystemer 6, avhengig av gRNA / target-sekvensen er valgt, kan en rekke mutasjoner og mutasjons effektivitet observeres.
. Figur 1. Prinsippet CRISPR sammenstilling I DNA forsamlingen reaksjon, er fire DNA blandet sammen; p201N: Cas9 linearized med Swa I og Spe I (sort sirkel), MtU6 promoter (grønn pil) Stillas (gul linje) og 60-mer gRNA oligo inneholder GN 19 mål sekvens (blue bar). Endene av hvert DNA-molekylet overlapper 20 bp med det tilstøtende stykke. DNA montering reaksjon recombines disse DNA i en enkelt, sirkulært molekyl. Den StUbi3p218R og ISceIR primer bindingsseter, er angitt med sorte piler, er 2x35S: er Cas9 kassett lilla, den StUbi3: NPTII kassett er oransje og venstre og høyre grenser er markert med grå søyler. Merk:. Vector Kartet er ikke i riktig målestokk Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Colony Screening og Plasmid kvalitetskontroll. A) Colony screening av 20 kloner fra DNA montering og transformasjon. M, 100 bp stige; +, P201N: Cas9: GFPT2 positiv kontroll; NI, p201N: Cas9 no-insert kontroll; GA, fortynnet DNA forsamlingen reaksjon; NT, no-mal kontroll. B) Representant sammendrag av fire p201N: Cas9: gRNA vektorer med restriksjonsenzymene Eco RV og Sty I. M, 2-log stige. C) Sammenligning av troskap av standard og high-fidelity DNA montering mikser og distribusjon av innhentede vektorer når 11 gRNA oligonukleotider ble slått sammen til en enkelt reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Hårete Root kulturer og påvisning av DNA modifisering. A) Hårete røtter kan sees dukker opp fra cotyledons 11 dager etter transformasjon. B) Roots er valgt på ½ MS Kan 50 medier i ca en uke. Grey barer betegne stilling rot tips på tidspunktet for plating. C) Eksempel på kloning ogsekvensering for å bestemme DNA mutasjoner med to forskjellige gen mål i fire forskjellige hårete-rot hendelser. Grå boksen betegner GN 20 GG målsekvens, Δ indikerer typen av mutasjon, og antall kloner med den angitte mutasjon. D) Eksempel på polyakrylamid-gel-elektroforese for å bestemme DNA-mutasjoner. Store delesjoner og heterodupleks bånd indikerer nærvær av DNA-mutasjoner ved målsekvenser. Seks av 12 uavhengige hendelser ble scoret som mutanter (Δ). WT, villtype kontroll; NT, no-mal kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation tilskudd IOS-1025642 (GBM). Vi takker Maria Harrison for å gi ARqua1 belastning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
