Summary
Используя сборку ДНК, несколько векторов CRISPR могут быть построены параллельно в одной реакции клонирования, что делает строительство большого числа CRISPR векторов простую задачу. Томатные волосатые корни отличная модель системы для проверки CRISPR векторов и генерировать мутантные материалы.
Introduction
Способность генерировать адресные модификации ДНК с CRISPR / cas9 имеет большой потенциал для функциональной геномики исследований. Есть два компонента системы CRISPR / cas9; cas9 нуклеазы, полученный из Staphylococcus Пирролидонилпептидаза и приблизительно 100-нт руководство РНК (gRNA) молекулы , которая направляет cas9 на сайт целевой ДНК (ов) 1. Целевой показатель признания присуждается первым ~ 20-нт из gRNA, что позволяет продукции с высокой пропускной способностью адресности векторов 2,3. Большинство организмов , которые могут быть созданы, уже были с CRISPR технологии / cas9 4,5.
В растениях, конститутивные промоторы, такие как промотор CaMV 35S, которые обычно используются для управления экспрессией в cas9 нуклеазы 6. В gRNAs выражаются с помощью РНК-полимеразы III U6 или промоторы U3, который ограничивает первую базу gRNA либо к G, для U6 или для У3, для эффективной транскрипции. Однако РНК-полимеразы II выпускного вечераoters, которые свободны от этих ограничений, также были использованы 7,8.
Различные gRNAs вызывают мутации ДНК с различной эффективностью, и поэтому он может быть важно сначала проверить CRISPR векторов, прежде чем инвестировать в преобразования целого растения или создание обширных фенотипические экранов. Переходная экспрессия CRISPR конструкций в растениях, используя агроинфильтрации например, как правило , приводит к более низкой частоте модификации ДНК по сравнению с устойчивыми растениями 6, что делает обнаружение мутаций трудно и фенотипических анализов непрактичными с такими подходами. Так называемые волосатых корней являются удобной, альтернативная система, так как большое число независимых, стабильно трансформированных материалов могут быть получены в течение нескольких недель, в отличие от месяцев для стабильных растений. CRISPR векторы очень эффективны при индукции мутаций ДНК в волосатых корней 9,10.
методы сборки ДНК эффективно лигирования фрагменты ДНК, содержащие overlapping заканчивается 11. Основным преимуществом некоторых методов сборки ДНК является способность включать оцДНК (т.е. олиго) в собранных продуктах. Так как gRNAs только ~ 20-нт долго и новые цели могут быть сделаны с синтезированных олигонуклеотидов, эти методы сборки ДНК хорошо подходят для CRISPR клонирования. Протоколы , описанные здесь , основаны на P201 серии CRISPR векторов, которая успешно используется в сое 10, 12 тополя и теперь помидор. Процедура клонирования представлены предлагает несколько преимуществ по сравнению с текущим методом клонирования 10. А именно, полностью функциональные векторы могут быть получены в одной реакции клонирования в течение одного дня. Вектор строительства также могут быть объединены для создания нескольких векторов CRISPR параллельно, дальнейшее сокращение практического времени и материальных затрат. Мы также приводим протокол для генерации томатных волосатых корней как эффективный способ для получения трансгенных материалов с целевым делеции гена. Волосатые корни используются для действительныйели векторы CRISPR и дают материал для последующих экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. РНК Руководство по проектированию и векторные Строительство
- Определение целевых последовательностей для генов, представляющих интерес. Есть множество онлайн CRISPR целевых ознакомительных программ , пригодных для этого шага 13,14.
Примечание: При этом мы используем GN 20 GG целевой мотив, но и другие конструкции могут быть пригодны в зависимости от прикладной системы или используемого вектора. - Дизайн 60-мерный gRNA олиго , чтобы включать в себя часть целевой мотивов , фланкированных 5 'и 3' 20-нт последовательности, которые необходимы для сборки ДНК Г.Н. 19. Окончательный 60-мерный мотив: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный, обессоливают праймеры работают отлично. - Подготовьте четыре ДНК для сборки (Рисунок 1). См дополнительный файл для ДНК-последовательностей.
- Дайджест 1 - 5 мкг p201N: cas9 10 плазмиды с ферментом рестрикции Spe I в 1X буфера 4 при 37 ° С в течение 2 часов. Колонка-очистить дайджестогласно инструкциям изготовителя. Ресуспендируют в ~ 15 мкл 10 мМ Трис-HCl, и количественно с помощью УФ-спектрофотометрии.
- Выполнение второго переваривания ферментом рестрикции Сва I в 1х буфере 3,1 при 25 ° C в течение 2 часов. Проверка 100 - 200 нг на агарозном геле 0,8%, чтобы подтвердить полное переваривание.
Примечание: Правильно переваривают плазмиду будет иметь одну полосу на 14,313 б.п.. Примечание: Тепло инактивации фермента и дефосфорилирование не требуются. Расщепленную плазмиду можно хранить при -20 ° С. - ПЦР - амплификации truncatula Medicago (Mt) U6 промотора и эшафот ДНК из 10 плазмиды МПУЕ gRNA Shuttle с использованием праймеров Сва I_MtU6F / MtU6R и ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR соответственно. Используйте высококачественную полимеразу с условиями ПЦР: 95 ° C в течение 3 мин; 31 циклов (98 ° С в течение 20 сек, 60 ° С в течение 15 сек, 72 ° С в течение 30 сек); и 72 ° С в течение 5 мин.
- Визуализируйте ~ 3 мкл аликвоты ПЦР-прoducts на агарозном геле 1% для подтверждения амплификации. MtU6 ампликона составляет 377 пар оснований и подмости ампликона составляет 106 пар оснований. Колонка-очистить оставшиеся продукты ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, количественно с помощью УФ-спектрофотометрии и хранят при -20 ° С.
- Ресуспендируют всю трубу gRNA олигомеров до 100 мкМ в лаборатории класса воды. Добавляют 1 мкл 100 мкМ олиго до 500 мкл буфера 1x 2.1. Хорошо перемешать. Если объединение нескольких олигонуклеотиды, добавить 1 мкл каждого 100 мкМ олиго к 1x буфера 2.1 трубы. Разведенные олигонуклеотиды можно хранить при -20 ° С.
- Программирование амплификатор для хранения при 50 ° С, с использованием нагретой крышкой. Смешайте 100 нг (0,011 пмоль) из линеаризованного вектора, 50 нг (0,2 пмоль) из MtU6 промотора, 12 нг (0,2 пмоль) из помост, 1 мкл (0,2 пмоль), разбавленного gRNA олиго (ов), а также воду до объема 5 мкл. Добавьте 5 мкл 2x высокой точности сборки ДНК мастер-смеси, хорошо перемешать и спин вниз. Инкубируйте реакции в течение 60 мин в50 ° C Термоциклер. Затем поместите реакцию на льду.
Примечание: объемы реакции может быть увеличено, чтобы покрыть низкий выход ДНК. - Transform 2 мкл реакционной смеси в компетентную E. палочка клеток с использованием стандартных методик и пластину на LB , дополненной 50 мг L -1 канамицина (Kan 50). Grow плакированные-клеток при 37 ° С в течение ночи. Сохранить оставшуюся ДНК реакцию сборки при -20 ° C.
- Экран колонии с помощью ПЦР с использованием праймеров StUbi3P218R и ISceIR. Развести аликвоту оставшейся ДНК реакции сборки с водой в соотношении 1: 5. Используйте 1 мкл в качестве положительного контроля для экрана колонии и 1 нг круговой p201N: cas9 плазмиды в качестве контроля нет-вставки.
- ПЦР-амплификации с условиями; 95 ° С в течение 3 мин; 31 циклов (95 ° С в течение 30 сек, 58 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 30 сек); и при 72 ° С в течение 5 мин. Визуализируйте продуктов ПЦР на 1% -ном агарозном геле. Убедитесь в том, что правильные вставки имеют полосу в 725 п.о. и векторы остроумияХаут вставки (например, режиссерский вектор) будет иметь 310 п.н. полосу.
- Grow положительные колонии в LB Кан 50 жидких культур в течение ночи при температуре 37 ° С и очищают плазмид в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательность Sanger плазмид с праймером StUbi3P218R и выравнивать хроматограммы к MtU6 промотор, цели и каркасных последовательностей для обеспечения не были введены никакие ошибки в процессе клонирования.
- Выполните диагностику переваривать расщеплением ~ 1 мкг плазмиды с Eco RV и Sty I. Визуализируйте на 0,8% -ном агарозном геле. Фрагменты (в п.н.) являются: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, и 174.
- Используйте сборку ДНК для построения векторов с несколькими gRNAs.
- Чтобы построить вектор с двумя кассетами gRNA, ПЦР - амплификации первого положения gRNA с праймерами Сва I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR и второе положение gRNA с праймерами UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR от 1 нг каждого из соответствующихПлазмиды построены с шагом 1,1 - 1,8. Используйте условия ПЦР на этапе 1.3.3. Визуализируйте ~ 3 мкл аликвоты ПЦР-продуктов на агарозном геле 1% для подтверждения амплификации. Ампликоны ~ 500 пар оснований.
- Объединить и смешать примерно равное количество оон очищенных продуктов ПЦР в 200 мкл трубки (как правило, 3 - 4 мкл каждого). Для сборки, добавьте 1 мкл комбинированные продукты ПЦР, 50 нг SWA I и Spe I линеаризуется p201N: cas9, лабораторно-класса воды до 2,5 мкл и 2,5 мкл 2x высокой точности сборки ДНК мастер - микс. Выдержите в амплификатор 50 ° C в течение 15 мин.
Примечание: Сборочные ДНК руководства рекомендует 15 мин инкубации в течение 2 - 3 фрагментов. - Transform 1 - 2 мкл в компетентные E. клетки палочки и пластины на LB Кан 50. Grow высевания клеток при 37 ° С в течение ночи. Сохранить оставшуюся реакционную смесь при -20 ° С.
- Экран колонии с помощью ПЦР с использованием праймеров StUbi3P218R и ISceIR при тех же условиях, как на стадии 1.6. Правильно сциклоны будут ампликона в 1200 пар оснований. Grow положительные колонии в LB Кан 50 жидких культур в течение ночи и очищают плазмиды.
- Последовательность плазмиды Sanger с StUbi3P218R праймеров (охватывает первого положения gRNA) и p201R (занимает второе место gRNA). Совместите хроматограммы к MtU6 последовательностей промотора, целевых и строительных лесов. Диагностический дайджест с Eco RV и Sty я приведу в следующих фрагментов (в п.н.): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Bolded фрагмент содержит второй gRNA.
- После встречи все ожидания контроля качества, преобразование плазмид в Agrobacterium rhizogenes штамм ARqua1 15. Добавить 1 мкл плазмиды преп к 50 мкл электрокомпетентных клеток и электропорации в 1 мм кювету с параметрами: 2,4 кВ, 25 мкФ и 200 Ом. Восстановление клеток в ~ 500 мкл SOC и встряхивают при температуре 28 ° С в течение 2 ч. Тарелка на LB Кан 50 и ггрести при 28 ° С в течение 2-х дней. Выполнение экрана колоний с использованием тех же праймеров и условия ПЦР, как 1.3.3. Сделать запасы глицерина из положительных клонов.
Трансформация 2. Волосатые Root
- Стерилизовать семена томатов в 20% хлорной извести в течение 15 мин, при постоянном перемешивании. В ламинарном потоке, удалите отбеливатель и стирать в стерильной лаборатории класса воды 3 раза.
- Пластина 30 семян в коробке GA-7 , содержащие ½ MS носитель (2,22 г L -1 MS соли + Gamborg Витамины, 10 г L -1 сахарозы, 3 г L -1 геллановая камедь, рН 5,8). Прорастают на ~ 2 дней в темноте, а затем переместите GA-7 коробок к свету. Вырастить рассаду для ~ более 4-х дней в свете.
- За день до этого преобразования, полоса из А. rhizogenes культуры на твердой LB Кан 50 и расти при температуре 28 ° С в течение ночи.
- День не трансформации, в ламинарный собрать стерильных материалов: 12 мл культуральной пробирки, 50 мл коническую трубку, ½ MS жидкость (не геллановая гмкм), 200 мкМ ацетосирингона, фильтровальная бумага, чашки Петри, пинцет и скальпель, пипетки и наконечники пипеток. Добавьте 25 мкл ацетосирингона до 50 мл ½ МС и влить ~ 6 мл в каждую пробирку.
- Используйте изогнутый наконечник 200 мкл , чтобы скоблить A. rhizogenes клетки от пластины и ресуспендируют в 6 мл ½ MS жидкости. Вихревая трубка полностью ресуспендирования клеток. После ресуспендирования клеток из каждого вектора, измеряют оптическую плотность (ОП) в 1 мл клеток, при фиксированной длине волны 600 нм. Убедитесь, что OD находится в интервале от 0,2 до 0,4; разбавить или добавить больше клеток по мере необходимости. Повторите эти действия для каждой конструкции.
- Добавить ~ 2 мл ½ MS жидкости в чашку Петри с стерильной фильтровальной бумагой. Акцизные семядоли из сеянцев и места на увлажненную фильтровальную бумагу. После того, как все семядоли были собраны, вырезать дистальных ~ 1 см от семядолей, в результате чего семядольных куски с двумя концами разреза. Добавить эксплантов А. растворы rhizogenes, перемешать и инкубировать в течение 20 минс редкими переворачивая.
Примечание: Приблизительно 12 эксплантатов на конструкции , которые обычно используются, хотя и больше, чем 80 эксплантов была сделана прививка в 6 мл А. Решение rhizogenes. - Во время А. rhizogenes инкубации, добавьте фильтровальную бумагу в чашки Петри, по одному на конструкцию трансформировали. Также установлено ½ MS твердых сред, ни антибиотики, в ламинарном шкафу для просушки.
- Совок семядоли из A. Раствор rhizogenes с стерильным пинцетом и поместить на сухой фильтровальной бумаге. Накройте крышкой Петри, чтобы обеспечить ткани не высыхают в то время как перейти к следующему преобразованию. Блот семядоли на фильтровальную бумагу и передачи, абаксиальной стороной вверх, на ½ MS СМИ. Оберните плиты с хирургической лентой и со-культивируют в темноте при комнатной температуре в течение 2-х дней.
- После совместного культивирования, переноса семядолей, абаксиальный стороной вверх, к ½ MS дополненной 300 мг L -1 Ticarcillin / клавулановой кислоты (Tim 300, чтобы предотвратить рост RESIDUAL А. rhizogenes) и Кан 50 (для селекции растений) и завернуть с хирургической лентой. Поддержание культуры под лампами дневного света при комнатной температуре с 16-часовой фотопериод.
- После того, как ~ 1.5 - 2 недели корни по крайней мере , 2 см в длину вырезают из семядолей с помощью стерильного пинцета и скальпеля и переносили на ½ MS Кан 50 Тим 300 средств массовой информации. Передача от 10 до 15 корней к одной пластине. Отметьте положение кончиков корней с маркером, обертывание с хирургической лентой, а также поддерживать в комнатной культуре.
- После одной недели, трансформированные корни замечены растет на селективной среде. Заготавливают подвыборки трансформированных корней для экстракции ДНК с использованием предпочтительного способа ДНК-экстракции. Примечание: Пластины с семядолей могут храниться в течение 2 - 3 еженедельных урожая, после чего указывают корни растут в запутанную беспорядок и трудно выделить. Номера заготовленные ткани корня может сохраняться неопределенно долго. Различные тесты могут быть выполнены на образце Выделенная ДНКдля того чтобы определить частоту мутаций ДНК и тип. Результаты нескольких таких анализов описаны ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR вектор строительства с блоком ДНК, как правило, создает десятки и сотни независимых клонов. Скрининг колоний с помощью ПЦР легко идентифицирует правильные клоны и могут различать плазмид с и без вставок (рис 2А) , которая полезна для поиска и устранения неисправностей. Как правило, все из клонов содержат вставку, и пользователь может выбрать, чтобы пропустить шаги скрининга колонии в целом. Диагностические дайджесты (рис 2В) и Sanger секвенирования используются для контроля качества. При возникновении ошибок, они, как правило , наблюдается в перекрывающихся областей ДНК, то есть, 'конец промотора MtU6, то gRNA, или 3' - 5' - конце последовательности каркасного. Если несколько олиго gRNA объединяются в одной реакции, то gRNAs определяются Sanger секвенирования. Включение отдельных gRNAs равномерно распределяется и большинство gRNAs могут быть выделены из одного преобразования (рис 2С (рис 2С).
Томатные волосатые корни, как правило , наблюдаются от одной до двух недель после трансформации (рис 3А). Roots ≥2 см в длину, вырезают и переносили на селективную среду и устойчивые к канамицину корни могут быть идентифицированы на одну неделю позже (фигура 3В). Большинство корней будет расти до некоторой степени на селективных средах и рост корней в трансформированных корней может быть переменной; если это возможно, выбрать наиболее интенсивно растущих корней для анализа. От одного до двух устойчивых к канамицину корней, как правило, восстанавливается в семядолях, привитых. С помощью регулярных трансфертов, трансформированные корни могут сохраняться неопределенно долго на селективных средах.
ДНК экстрагируют из устойчивых к канамицину корней и ПЦР используют для amplifу целевой области (ов). ПЦР - продукты могут быть использованы в различных анализах для определения эффективности мутации, такие как клонирование и секвенирование (рис 3C), анализ рестрикционных фрагментов полиморфизма длины, электрофорезом на геле полиакриламида 16 (рис 3D), T7E1 эндонуклеазы 16, или с высокой пропускной способностью ампликонов секвенирования 10. Как уже сообщалось в других системах CRISPR-растений 6, в зависимости от gRNA / целевой последовательности , выбранной, может наблюдаться ряд мутаций и эффективности мутации.
. Рисунок 1. Принцип CRISPR Ассамблеи В реакции сборки ДНК, четыре ДНК смешивают друг с другом; p201N: cas9 Линеаризованная с SWA I и Spe I (черный круг), MtU6 промотор (зеленая стрелка), Эшафот (желтые) и 60-мерным gRNA олиго , содержащего 19 GN последовательность - мишень (бLUE бар). Концы каждой молекулы ДНК, перекрывается 20 п.о. с соседним куском. Реакция сборки ДНК рекомбинирует эти ДНК в единую круговую молекулу. StUbi3p218R и ISceIR праймер сайты связывания обозначены черными стрелками, 2x35S: cas9 кассета фиолетовый, StUbi3: кассета NPTII оранжевого цвета, левая и правая границы обозначены серые полосы. Примечание: Vector . Карта не в масштабе Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Colony Скрининг и Плазмида Контроль качества. А) колонии скрининг 20 клонов из сборки ДНК и трансформации. М, 100 п.н. лестница; +, P201N: cas9: GFPT2 положительный контроль; Н.И., p201N: cas9 управления нет-вставки; GA, разбавленный ДНК реакция сборки; NT, нет-шаблон управления. Б) представитель дайджеста из четырех p201N: cas9: gRNA векторы с ферментами рестрикции Eco RV и StY I. М, 2-журнал лестницы. C) Сравнение точности стандарта и высокой точностью сборки ДНК смесей и распределение восстановленных векторов , когда 11 gRNA олигонуклеотиды были объединены в одну реакцию. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Волосатые корневых культур и обнаружение ДНК модификации. А) волосистых корней можно видеть выходящий из семядоли через 11 дней после трансформации. Б) Корни выбираются на ½ MS Кан 50 сред в течение приблизительно одной недели. Серые полосы обозначают положение кончиков корней во время металлизации. C) Пример клонирования исеквенирование для определения мутаций ДНК с двумя различными целями генов в четырех различных волосатой корневых событий. Серый ящик обозначает GN 20 GG последовательность - мишень, Δ тип мутации, и число клонов с указанной мутации. D) Пример электрофореза в полиакриламидном геле , чтобы определить , мутации ДНК указывает на то . Большие делеции и гетеродуплексным полосы указывают на наличие мутаций ДНК в целевых последовательностей. Шесть из 12 независимых событий оценивались как мутанты (А). WT дикого типа управления; NT, нет-шаблон управления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом Национального научного фонда IOS-1025642 (GBM). Мы благодарим Марию Харрисона за предоставление штамма ARqua1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' → 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG |
||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG |
||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT |
||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT |
||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG |
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG |
||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG |
||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
