Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Hög genomströmning crispr Vektorkonstruktion och karakterisering av DNA Ändringar av Generation tomat håriga Roots

Published: April 30, 2016 doi: 10.3791/53843

Summary

Med användning av DNA montering, kan flera crispr vektorer konstrueras parallellt i en enda kloningsreaktion, vilket gör konstruktionen av ett stort antal crispr vektorer en enkel uppgift. Tomat håriga rötter är ett utmärkt modellsystem för att validera crispr vektorer och generera muterade material.

Introduction

Förmågan att generera riktade DNA-ändringar med crispr / Cas9 har stor potential för funktionsgenomik studier. Det finns två komponenter i crispr / Cas9 systemet; den Cas9 nukleas, härledd från Staphylococcus pyogenes och ett ungefär 100-nt guide RNA (gRNA) molekyl som styr Cas9 till den målsökta DNA-ställe (n) 1. Måligenkännande ges av den första ~ 20 nt av gRNA, vilket möjliggör hög kapacitet produktion av målstyrningsvektorer 2,3. De flesta organismer som kan manipuleras, redan har varit med crispr / Cas9 teknik 4,5.

I växter, konstitutiva promotorer, såsom CaMV 35S-promotorn, används vanligen för att driva expressionen av Cas9 nukleas 6. De gRNAs uttrycks enligt de RNA-polymeras III U6 eller U3 promotorer som begränsar den första basen av gRNA till antingen ett G, för U6, eller A för U3, för effektiv transkription. Dock RNA-polymeras II promoters, som är fria från dessa begränsningar, har också använts 7,8.

Olika gRNAs inducerar DNA-mutationer med olika verkningsgrader, så det kan vara viktigt att först validera crispr vektorer innan man investerar i hel-växt transformationer eller inrätta omfattande fenotypiska skärmar. Transient uttryck av crispr konstruktioner i växter, genom att använda agroinfiltration till exempel i allmänhet resulterar i en lägre frekvens av DNA-modifiering jämfört med stabila växter 6, vilket gör detektion av mutationer svåra och fenotypiska analyser opraktiska med sådana metoder. Så kallade håriga rötter är ett bekvämt, alternativt system eftersom ett stort antal av oberoende, stabilt transformerade material kan genereras inom veckor, i motsats till månader för stabila växter. Crispr vektorer är mycket effektiva i att inducera DNA-mutationer i håriga rötter 9,10.

DNA monteringsmetoder ligera effektivt DNA-fragment som innehåller overlapping ändar 11. En stor fördel med vissa DNA monteringsmetoder är möjligheten att införliva ssDNA (dvs oligos) i sammansatta produkter. Eftersom gRNAs är endast ~ 20 nt lång och nya mål kan göras med syntetiserade oligonukleotider, dessa DNA monteringsmetoder är väl lämpade för crispr kloning. De protokoll som beskrivs här bygger på P201 serien crispr vektorer som har använts med framgång i soja 10, poppel 12 och nu tomat. Förfarandet kloning presenteras erbjuder flera fördelar jämfört med den aktuella kloningsmetod 10. Nämligen, kan fullt fungerande vektorer genereras i en enda klonings reaktion på en enda dag. Vektorkonstruktion kan också slås samman för att generera flera crispr vektorer parallellt, vilket ytterligare minskar praktisk tid och materialkostnader. Vi presenterar också ett protokoll för generering av tomat håriga rötter som en effektiv metod för att producera transgena material med riktade gen strykningar. Håriga rötter används för att giltigtåt de crispr vektorerna och ge underlag för efterföljande experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Guide RNA Design och Vektorkonstruktion

  1. Identifiera målsekvenser för generna av intresse. Det finns en mängd olika program på nätet crispr måls finna lämpliga för detta steg 13,14.
    OBS: Här använder vi GN 20 GG mål motiv, men andra konstruktioner kan vara lämpliga beroende på tillämpningen eller vektorsystem som används.
  2. Design 60-mer gRNA oligos att inkludera GN 19 delen av målet motiv flankerad av 5 'och 3' 20-nt-sekvenser som krävs för DNA-montering. Den slutliga 60-mer motiv är: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
    OBS: Standard, avsaltade primers fungera bra.
  3. Förbered fyra DNA för montering (Figur 1). Se kompletterande fil för DNA-sekvenser.
    1. Digest 1 - 5 ug av p201N: Cas9 10 plasmiden med restriktionsenzymet Spe I i 1x Buffert 4 vid 37 ° C under 2 h. Kolonn rena smälta ennligt tillverkarens instruktioner. Resuspendera i ~ 15 | il av 10 mM Tris-HCl, och kvantifiera genom UV-spektrofotometri.
    2. Utföra en andra smälta med restriktionsenzymet Swa I i 1x buffert 3,1 vid 25 ° C under 2 h. Ta 100-200 ng på en 0,8% agarosgel för att bekräfta fullständig uppslutning.
      ANMÄRKNING: En korrekt omsatta plasmiden kommer att ha en enda band vid 14313 bp. Anmärkning: Värmeinaktivering av enzymet och defosforylering krävs inte. Klippta plasmid kan förvaras vid -20 ° C.
    3. PCR förstärka tornlusern (Mt) U6 promotor och ställnings DNA från pUC gRNA Shuttle 10 plasmid med hjälp av primers Swa I_MtU6F / MtU6R och ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR respektive. Använda en hög-fi-polymeras med de PCR-betingelser: 95 ° C under 3 min; 31 cykler (98 ° C under 20 s, 60 ° C under 15 sek, 72 ° C under 30 sek); och 72 ° C under 5 min.
      1. Visualisera ~ 3 l alikvoter av PCR-produkter på en 1% agarosgel för att bekräfta amplifiering. Den MtU6 amplicon är 377 bp och ställningen amplikon är 106 bp. Kolonn-rening de återstående PCR-produkter i enlighet med tillverkarens instruktioner, kvantifiera med UV-spektrofotometri och förvara vid -20 ° C.
    4. Resuspendera hela röret av gRNA oligos till 100 nm i laboratoriekvalitet vatten. Tillsätt 1 pl 100 pM oligo till 500 pl 1x buffert 2,1. Blanda väl. Om sammanslagning flera oligonukleotider, tillsätt 1 pl av varje 100 iM oligo till 1x buffert 2,1 rör. oligos utspädda kan förvaras vid -20 ° C.
  4. Programmera en termocykelapparat för att hålla vid 50 ° C, med användning av ett uppvärmt lock. Kombinera 100 ng (0,011 pmol) av linjäriserad vektor, 50 ng (0,2 pmol) av MtU6 promotor, 12 ng (0,2 pmol) av byggnadsställning, en il (0,2 pmol) av utspädd gRNA oligo (s), och vatten till en volym av 5 | j, l. Tillsätt 5 pl 2x high fidelity DNA montering Master Mix, blanda väl och spinn ner. Inkubera reaktionen under 60 min i50 ° C termisk cykler. Placera sedan reaktionen på is.
    Obs: reaktionsvolymerna kan ökas för att rymma låga DNA-utbyten.
  5. Omvandla 2 ul av reaktions in i kompetenta E. coli-celler med användning av standardtekniker och platta på LB kompletterat med 50 mg L -1 kanamycin (Kan 50). Växa pläterade-celler vid 37 ° C över natten. Spara återstående DNA enheten reaktion vid -20 ° C.
  6. Koloni skärmen genom PCR med användning av primers StUbi3P218R och ISceIR. Späd en alikvot av den återstående DNA aggregatet reaktion med vatten 1: 5. Använda 1 fil som en positiv kontroll för kolonin skärm och ett ng av cirkulär p201N: Cas9 plasmid som en no-insert kontroll.
    1. PCR förstärka de villkor; 95 ° C under 3 min; 31 cykler (95 ° C under 30 sekunder, 58 ° C under 30 sek, 72 ° C under 30 sek); och vid 72 ° C under 5 min. Visualisera PCR-produkter på en 1% agarosgel. Se till att rätt insättningar har ett band vid 725 bp och vektorer witHout insatser (t.ex. uncut vector) kommer att ha en 310-bp band.
  7. Odla positiva kolonier i LB Kan 50 flytande kulturer över natten vid 37 ° C och rena plasmider enligt tillverkarens anvisningar. Sanger-sekvens plasmider med StUbi3P218R primer och rikta kromatogram till MtU6 promotor, mål och ställningssekvenser för att garantera att inga fel infördes under kloning.
  8. Utför ett diagnostiskt smälta genom uppslutning ~ 1 mikrogram av plasmid med EcoRV och Sty I. Visualisera på en 0,8% agarosgel. Fragment (i bp) är: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, och 174.
  9. Använd DNA montering att konstruera vektorer med flera gRNAs.
    1. Att konstruera en vektor med två gRNA kassetter, PCR amplifiera den första-positionen gRNA med primers Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR och den andra-positionen gRNA med primrarna UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR från 1 ng av var och en av de respektiveplasmider konstrueras i steg 1.1 - 1.8. Använda PCR-betingelser i steg 1.3.3. Visualisera ~ 3 il alikvoter av PCR-produkter på en 1% agarosgel för att bekräfta amplifiering. Amplikoner är ~ 500 bp.
    2. Kombinera och blanda ungefär lika mängder av un-renad PCR-produkter i en 200 ^ rör (vanligen 3-4 pl av vardera). För montering, tillsätt 1 pl kombinerade PCR-produkter, 50 ng Swa I och Spe I linjäriserad p201N: Cas9, laboratoriekvalitet vatten till 2,5 l och 2,5 l 2x high fidelity DNA montering Master Mix. Inkubera i en 50 ° C värmecykeln med 15 min.
      Obs: manualer DNA monterings rekommenderar en 15 min inkubation under 2 - 3 fragment.
    3. Omvandla 1 - 2 | j, l i kompetenta E. coli-celler och platta på LB Kan 50. Växa strukna cellerna vid 37 ° C över natten. Spara den återstående reaktionen vid -20 ° C.
    4. Koloni skärmen genom PCR med primers StUbi3P218R och ISceIR med samma villkor som steg 1,6. korrekta cLones kommer att ha en 1200 bp amplikon. Växa positiva kolonier i LB Kan 50 flytande kulturer över natten och renar plasmider.
    5. Sanger sekvens plasmider med primers StUbi3P218R (täcker första position gRNA) och p201R (täcker andra positionen gRNA). Rikta kromatogram till MtU6 promotor, mål och ställningssekvenser. Diagnostisk smälta med Eco RV och Styl kommer att resultera i följande fragment (i bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. fetstil fragment innehåller andra gRNA.
  10. Efter mötet alla kvalitetskontroll förväntningar förvandla plasmider i Agrobacterium rhizogenes stam ARqua1 15. Tillsätt 1 pl av plasmiden prep till 50 pl elektro celler och electroporate i en 1 mm kyvett med inställningarna: 2,4 kV, 25 uF, och 200 Ω. Återvinna cellerna i ~ 500 | il av SOC och skaka vid 28 ° C under 2 h. Platta på LB Kan 50 och gro vid 28 ° C under 2 dagar. Utför koloni skärmen med samma primers och PCR-betingelser som 1.3.3. Gör glycerolstam från positiva kloner.

2. Hårig Root Transformation

  1. Sterilisera tomatfrön i 20% hushållsblekmedel i 15 min, med konstant blandning. I ett laminärt flöde huva, ta bort blekmedel och tvätta i sterilt laboratoriekvalitet vatten 3 gånger.
  2. Plate 30 frön i en GA-7 låda innehållande ½ MS media (2,22 g L -1 MS salter + Gamborg vitaminer, 10 g L -1 sackaros, 3 g L -1 gellangummi, pH 5,8). Gro för ~ 2 dagar i mörker, sedan flytta GA-7 lådor för ljus. Odla plantor för ~ 4 dagar i ljuset.
  3. Dagen före omvandling, strimma ut A. rhizogenes kulturer på fast LB Kan 50 och växa vid 28 ° C över natten.
  4. Day of transformation, i laminärt flöde huva montera sterila material: 12 ml odlingsrör, 50 ml koniska rör, ½ MS vätska (ingen gellan gum), 200 | iM acetosyringon, filterpapper, Petri-skålar, pincett och skalpell, pipetter och pipettspetsar. Tillsätt 25 pl av acetosyringon till 50 ml ½ MS och häll ~ 6 ml i varje kultur rör.
  5. Använd en böjd 200 l spets för att skrapa A. rhizogenes celler från plattan och återsuspendera i 6 ml ½ MS vätska. Vortex röret helt resuspendera cellerna. Efter återsuspendering av celler från varje vektor, mäta den optiska densiteten (OD) av 1 ml celler vid en fixerad våglängd av 600 nM. Säkerställa OD är mellan 0,2 och 0,4; späda ut eller lägga till fler celler som är nödvändigt. Upprepa för varje konstruktion.
  6. Lägg ~ 2 ml ½ MS vätska till en petriskål med ett sterilt filterpapper. Punkthjärtbladen från plantorna och plats på fuktat filterpapper. När alla hjärtbladen har samlats in, klippa distala ~ 1 cm bort av hjärtbladen, vilket resulterar i Cotyledon bitar med två skurna ändarna. Lägg explantat till A. rhizogenes lösningar, blanda och inkubera i 20 minutermed enstaka vända.
    Obs: Cirka 12 explantat per konstruktion används rutinmässigt, men så många som 80 explantat har ympats i 6 ml A. rhizogenes-lösning.
  7. Under A. rhizogenes inkubation, tillsätt filterpapper till petriskålar, en per konstruktion omvandlas. Också ställa ½ MS fasta medier, ingen antibiotika, i laminärt flöde huva för att torka.
  8. Skopa kotyledoner av A. rhizogenes lösning med steril pincett och placera på torrt filterpapper. Täck med Petri lock för att säkerställa vävnader inte torkar ut när man går vidare till nästa transformation. Blot kotyledoner på filterpapper och överföring, abaxial sidan uppåt, till ½ MS media. Wrap plattor med kirurgisk tejp och co-kultivera i mörker vid rumstemperatur under 2 dagar.
  9. Efter samodling, överförings kotyledoner, abaxial sidan uppåt, till ½ MS-medium kompletterat med 300 mg L -1 tikarcillin / klavulansyra (Tim 300, för att förhindra tillväxt av residUAL A. rhizogenes) och Kan 50 (för val anläggning) och linda med kirurgtejp. Bibehålla kulturer enligt lysrör vid rumstemperatur med en 16-timmars fotoperiod.
  10. Efter ~ 1,5 - 2 veckor rötter åtminstone 2 cm i längd ut från hjärtbladen med hjälp av steril pincett och en skalpell och överfördes till ½ MS Kan 50 Tim 300 media. Överför 10 till 15 rötter till en enda platta. Markera positionen för de grundläggande tips med en markör, wrap med kirurgisk tejp, och underhålla i odlingsrummet.
  11. Efter en vecka, är transformerade rötter ses växer på selektivt medium. Skörda en delprov av transformerade rötter för DNA-extraktion med hjälp av föredragna DNA-utvinningsmetod. Obs: Plattor med hjärtblad kan förvaras i 2 - 3 vecko skördar, varefter pekar rötterna växa till en tilltrasslad röra och är svåra att isolera. Icke skördade rot vävnader kan upprätthållas på obestämd tid. En mängd analyser kan utföras på det isolerade DNA-provets för att bestämma DNA mutationsfrekvens och typ. Resultat från några sådana analyser beskrivs nedan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Crispr vektorkonstruktion med DNA enheten genererar typiskt tiotals till hundratals oberoende kloner. Koloni screening genom PCR identifierar lätt korrekta kloner och kan skilja mellan plasmider med och utan insatser (Figur 2A) som är användbar för felsökning. Vanligtvis alla klonerna innehåller en insats och en användare kan välja att hoppa över koloniscreeningsstegen helt och hållet. Diagnostiska digere (figur 2b) och Sanger-sekvensering används för kvalitetskontroll. När fel inträffar, de är oftast observeras i de överlappande DNA-regioner, det vill säga, den 5 'änden av MtU6 promotorn, gRNA, eller 3'-änden av ställningen sekvensen. Om flera gRNA oligos slås samman till en enda reaktion, är gRNAs bestäms av Sanger-sekvensering. Införlivandet av enskilda gRNAs är jämnt fördelade och de flesta av de gRNAs kan isoleras från en enda transformation (Figur 2C (figur 2C).

Tomat håriga rötter observeras vanligtvis en till två veckor efter transformation (figur 3A). Rötter ≥2 cm i längd skärs ut och överfördes till selektivt medium och kanamycinresistenta rötter kan identifieras en vecka senare (figur 3B). De flesta rötter kommer att växa till en viss grad på selektiva medier och rottillväxt i transformerade rötter kan variera; om möjligt, välja de mest kraftigt växande rötter för analys. En till två kanamycinresistenta rötter typiskt återvinns per cotyledon ympas. Med regelbundna överföringar kan transformerade rötter upprätthållas på obestämd tid på selektiva medier.

DNA extraheras från kanamycinresistenta rötter och PCR används för att amplify målregionen (er). PCR-produkter kan användas i en mängd olika analyser för att bestämma mutations effektivitet, såsom kloning och sekvensering (fig 3C), restriction fragment length polymorphism analys, polyakrylamidgelelektrofores 16 (fig 3D), T7E1 endonukleas 16, eller high-throughput amplikon sekvense 10. Som rapporteras i andra crispr-växtsystem 6, beroende på gRNA / målsekvensen vald, kan observeras en rad mutationer och mutationsverkningsgrader.

Figur 1
. Figur 1. Principen om crispr Assembly i DNA monterings reaktion, fyra DNA blandas; p201N: Cas9 arise med Swa I och Spe I (svart cirkel), MtU6 promotor (grön pil), Scaffold (gul bar) och 60-mer gRNA oligo innehåller GN 19 målsekvensen (blue bar). Ändarna av varje DNA-molekyl överlappar 20 bp med den intilliggande stycke. DNA montering reaktion rekombinerar dessa DNA till en enda, cirkulär molekyl. Den StUbi3p218R och ISceIR primer bindningsställen anges med svarta pilar, den 2x35S: är Cas9 kassett lila, den StUbi3: nptll kassett är orange och vänster och höger gränser indikeras med grå staplar. Anm: Vector. Kartan är inte skalenliga Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Colony Screening och plasmid kvalitetskontroll. A) Koloni screening av 20 kloner från DNA montering och transformation. M, 100-bp-stege; +, P201N: Cas9: GFPT2 positiv kontroll; NI, p201N: Cas9 ingen insats kontroll; GA, utspädda DNA montering reaktion; NT, ingen mall kontroll. B) representant uppslutning av fyra p201N: Cas9: gRNA vektorer med restriktionsenzymema EcoRV och Sty I. M, 2-log stege. C) Jämförelse av trohet av standarden och high-fidelity DNA monterings mixar och distribution av återvunna vektorer när 11 gRNA oligos slogs samman till en enda reaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Hårig Root kulturer och detektion av DNA-modifiering. A) håriga rötter kan ses som kommer ut från hjärtblad 11 dagar efter transformation. B) Rötter selekteras på ½ MS Kan 50 media för ungefär en vecka. Grå staplar anger position rotspetsar vid plätering. C) Exempel på kloning ochsekvensering för att bestämma DNA-mutationer med två olika gener mål i fyra olika hårig-rot händelser. Grå rutan betecknar GN 20 GG målsekvens, Δ indikerar typ av mutation, och antalet kloner med den angivna mutationen. D) Exempel på polyakrylamidgelelektrofores för att bestämma DNA-mutationer. Stora deletioner och heteroduplex band indikerar närvaron av DNA-mutationer vid målsekvenserna. Sex av 12 oberoende händelser bedömdes som mutanter (Δ). WT, vildtyp kontroll; NT, ingen mall kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av National Science Foundation IOS-1025642 (GBM). Vi tackar Maria Harrison för att tillhandahålla ARqua1 stammen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) New England Biolabs E5520
p201N:Cas9 Addgene 59175 The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes.
pUC gRNA Shuttle Addgene 47024
SwaI New England Biolabs R0604S
SpeI New England Biolabs R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification Zymo Research D4003
NEB Buffer 2.1 New England Biolabs B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4) New England Biolabs B7204S
NEB Buffer 3.1 New England Biolabs B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) Epoch Life Sciences 1910-050/250
EcoRV-HF® New England Biolabs R3195S
StyI-HF® New England Biolabs R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins Phytotechnology Laboratories M404
Phytagel™ (gellan gum) Sigma Aldrich P8169
GA-7 Boxes Sigma Aldrich V8505
Micropore™ surgical tape 3M 1535-0
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) Various 0029-6571-26
Primers 5' → 3'
SwaI_MtU6F  GATATTAATCTCTTCGATGA
AATTT
ATGCCTATCTTATAT
GATCAATGAGG
MtU6R   AAGCCTACTGGTTCGCTTG
AAG
ScaffoldF  GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
AAGTT
SpeI_Scaffold R GTCATGAATTGTAATACGACTC
A
AAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R  ACATGCACCTAATTTCACTA
GATGT
ISceIR GTGATCGATTACCCTGTTAT
CCCTAG
Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid
UNS1_Scaffold R  GAGAATGGATGCGAGTAATGAA
AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F   CATTACTCGCATCCATTCTCAT
GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R  CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  3. Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
  4. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
  5. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
  6. Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
  7. Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
  8. Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
  9. Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
  10. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
  11. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  12. Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
  13. Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
  14. Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
  15. Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
  16. Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
  17. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
  18. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  19. Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
  20. Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  21. Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
  22. Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
  23. Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
  24. Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
  25. Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
  26. Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).

Tags

Molecular Biology , genteknik genom redigering DNA montering växtbioteknik växttransformation
Hög genomströmning crispr Vektorkonstruktion och karakterisering av DNA Ändringar av Generation tomat håriga Roots
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacobs, T. B., Martin, G. B.More

Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843, doi:10.3791/53843 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter