Introduction
ल्यूकोसाइट्स फेफड़ों की केशिकाओं (यानी, marginating-फेफड़े (मध्य प्रदेश) ल्यूकोसाइट्स) 1 अलग ल्युकोसैट रचना और अद्वितीय गतिविधि प्रदर्शन करने के लिए अन्य प्रतिरक्षा डिब्बों (जैसे, परिसंचरण, तिल्ली, बोन मैरो) से ल्यूकोसाइट्स की तुलना में दिखाया गया 2- का पालन 4। उदाहरण के लिए, MP-ल्यूकोसाइट्स प्रदर्शनी उच्च प्राकृतिक हत्यारा विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ कोशिकाओं (एन.के.) cytotoxicity, घूम और प्लीहा एन.के. कोशिकाओं के साथ-साथ भेदभाव कर मैसेंजर आरएनए (mRNA) के स्तर और समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स की वृद्धि स्राव की तुलना में। कोशिकाओं की संरचना भी घूम ल्यूकोसाइट्स से भेदभाव के रूप में सांसद-ल्यूकोसाइट्स जन्मजात / अनुकूली प्रतिरक्षा के एक उच्च अनुपात घूम ल्यूकोसाइट्स (50% बनाम 30%, क्रमशः) की तुलना में है। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि का लक्ष्य है, MP-ल्यूकोसाइट्स के चुनिंदा कटाई सक्षम इस महत्वपूर्ण और अद्वितीय प्रतिरक्षा डिब्बे (सेल की आबादी) का अध्ययन करने के क्रम में, और eluc करने के लिए हैइन विशिष्ट कोशिकाओं पर विभिन्न जोड़तोड़ (जैसे, प्रतिरक्षा सक्रियण) के प्रभाव idate।
इस अनूठी आबादी के महत्व को समझने के लिए, यह है कि प्रतिरक्षा प्रणाली सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा (सीएमआई) के vivo कार्यों के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं, micrometastases, और अवशिष्ट रोग घूम नियंत्रित कर सकते हैं नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस क्षमता प्रतिरक्षा प्रणाली की विफलता मिसाल प्राथमिक ट्यूमर को नियंत्रित करने के बावजूद स्पष्ट है, और कैंसर रोगियों और पशु मॉडल में 5 विवो साक्ष्य के रूप में पर्याप्त द्वारा समर्थित है। महत्वपूर्ण बात है, इन निष्कर्षों को अक्सर (cytotoxicity assays के द्वारा मापा जाता है) 6.7 इन विट्रो और पूर्व vivo अध्ययन है, जो रिपोर्ट है कि सबसे ऑटोलॉगस ट्यूमर कोशिकाओं को मानव और जानवरों से रक्त के नमूनों में ल्यूकोसाइट्स घूम द्वारा cytotoxicity के लिए प्रतिरोधी रहे हैं के साथ असंगत हैं। इस विसंगति को इस तरह आगे के रूप में अलग ल्युकोसैट आबादी, के vivo अस्तित्व के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता हैउल्लेख सांसद ल्युकोसैट आबादी, और विशेष रूप से सक्रिय एन.के. कोशिकाओं 3 के अपने उप-जनसंख्या। दरअसल, syngeneic ट्यूमर कोशिकाओं (MADB106) है, जो घूम और प्लीहा ल्यूकोसाइट्स के लिए प्रतिरोधी हो पाए गए, सांसद एनके कोशिकाओं 3,8 द्वारा lysed होना दिखाया गया था। इस प्रकार, कथित तौर पर 'एन.के. प्रतिरोधी' MADB106 कोशिकाओं है कि fischer344 (F344) चूहों के फेफड़ों के लिए metastasize, लेकिन घूम या प्लीहा एनके कोशिकाओं है, जो आमतौर पर उपयोग के अपने आसानी दिए गए अध्ययन कर रहे हैं के द्वारा नहीं सांसद एनके कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं।
शुद्ध और सक्रिय सांसद ल्यूकोसाइट्स फेफड़े, जो फेफड़े के ऊतकों पीस या जैविक क्षरण 9 के आधार पर कर रहे हैं से ल्यूकोसाइट्स की कटाई मानक तरीकों के माध्यम से दुर्गम हैं। हमारा दृष्टिकोण ऊतक प्रसंस्करण दृष्टिकोण की तुलना में दो प्रमुख फायदे हैं। सबसे पहले, छिड़काव दृष्टिकोण चुनिंदा फसल MP-ल्यूकोसाइट्स, उन्हें अन्य कोशिकाओं है कि फेफड़ों parenchymal, मध्य से ही शुरू, और ब्रांको-वायुकोशीय compar से अलगtments। दूसरा, छिड़काव तकनीक बेहतर अखंडता और सांसद ल्यूकोसाइट्स की शारीरिक परिवेश, पीस और जैविक प्रसंस्करण के विपरीत दृष्टिकोण को बरकरार रखता है कि क्षति कोशिकाओं, उनकी आकृति विज्ञान में परिवर्तन, और उत्पादन और विभिन्न कारकों है कि प्रतिरक्षा गतिविधि मिलाना और विशेष रूप से एन.के. को दबाने की रिहाई के लिए प्रेरित cytotoxicity 10।
फेफड़ों के कैंसर मेटास्टेसिस के लिए और विभिन्न संक्रामक रोगों के लिए एक प्रमुख लक्ष्य अंग हैं। सभी घूम घातक कोशिकाओं और संक्रमित कोशिकाओं को फेफड़ों केशिकाओं, जहां वे ख़राब करना और केशिका endothelial कोशिकाओं और निवासी ल्यूकोसाइट्स के साथ बातचीत करने की जरूरत है के माध्यम से गुजरती हैं। इन शर्तों के तहत, घूम कोशिकाओं को आसानी निवासी MP-ल्यूकोसाइट्स द्वारा निशाना बनाया जा सकता है। इस प्रकार यह जैविक रूप से इस प्रतिरक्षा डिब्बे में सक्रिय ल्यूकोसाइट्स राशि के लिए फायदेमंद लगता है, और यह अलग है, जैविक प्रयोगात्मक और नैदानिक सेटिंग में इस अनूठी MP-आबादी का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसा नहीं है कि एसवाई नोट करने के लिए योग्य हैविभिन्न जैविक प्रतिक्रिया-संशोधक द्वारा stemic प्रतिरक्षा सक्रियण (जैसे, polyinosinic-polycytidylic एसिड (पाली मैं: सी) या टाइप-सी सीपीजी oligodeoxynucleotides (सीपीजी-सी ODN)), सांसद-ल्यूकोसाइट्स घूम ल्यूकोसाइट्स 3 की तुलना में अधिक सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है 8,11।
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Protocol
पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) तेल अवीव विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. चूहा प्रोटोकॉल
- तैयारी
- 2 तितली 21 जी सुइयों की व्यवस्था। वैकल्पिक रूप से, सुई की तेज धार दाखिल करके 2 कुंद धार तितली 21 जी सुइयों तैयार करते हैं।
- कैंची की 2 जोड़े, पा धार संदंश, hemostat, दांत-ऊतक संदंश गुरुत्वाकर्षण (सूखा) स्थापित करने पर कम से कम 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव द्वारा निष्फल: सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित।
- फॉस्फेट बफर खारा (1x पीबीएस) समाधान के प्रति मिलीलीटर हेपरिन की 30 इकाइयों को जोड़कर heparinized पीबीएस (30 इकाइयों / एमएल) तैयार करें। आरटी पर प्रयोग करें। 35 मिलीलीटर की मात्रा कम से कम प्रति पशु की जरूरत है।
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप लाइनों और तितली सुइयों में heparinized पीबीएस स्ट्रीम हवा के बुलबुले से बचने के लिए।
- फेफड़े और सांसद ल्यूकोसाइट्स के संग्रह का छिड़काव
- 8% isoflurane की अधिक मात्रा से पशु euthanize। निगरानी सांस लेने समापन से इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
- श्वसन की समाप्ति पर, तुरंत बाँझ कैंची और दांत-ऊतक संदंश का उपयोग पेरिटोनियल और सीने गुहाओं खुला। जिफाएडा प्रक्रिया को पेट के साथ एक midline पेट चीरा प्रदर्शन करना।
- उरोस्थि संदंश का प्रयोग, सावधानी से दोनों पक्षों पर रिब पिंजरे काटने लिफ्ट, किसी भी आंतरिक अंग या बड़े रक्त वाहिकाओं puncturing के बिना। उरोस्थि पर एक hemostat दबाना, और rostrally हृदय जटिल बेनकाब करने के लिए रिब पिंजरे गुना।
- दिल के सही वेंट्रिकल में एक तितली सुई डालें, और लगभग एक मिनट के भीतर एक सिरिंज में (एक 250 ग्राम जानवर से 6 मिलीलीटर ~) रक्त के अधिक से अधिक मात्रा में इकट्ठा।
- एक hemostat के साथ रग कावा दबाना जिगर (चर्चा देखने के लिए) के पिछड़े छिड़काव से बचने के लिए।
- सही वेंट्रिकल के भीतर तितली सुई पकड़ो, जबकि पी की बहिर्वाह पाइप के साथ रक्त युक्त सिरिंज की जगहeristaltic पंप।
- बाएं वेंट्रिकल में एक 5 मिलीलीटर सिरिंज कटाई से जुड़ा एक दूसरा तितली सुई डालें, interventricular पट के प्रवेश से परहेज।
- लगभग 5 मिलीग्राम / मिनट की गति क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप को चालू करें और perfusate कि खून से दूषित कर रहे हैं के पहले मिलीलीटर सिरिंज में धीरे इकट्ठा। जारी रखें जब तक perfusate रंग लाल पीला अंधेरे से बदल जाता है। (त्यागें रक्त दूषित perfuste)।
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की समाप्ति के बिना, तेजी से एक 20 मिलीलीटर सिरिंज कटाई के साथ 5 मिलीलीटर सिरिंज कटाई की जगह है और फेफड़ों perfusate छिड़काव के एक उच्च गति (अप करने के लिए 7 मिलीग्राम / मिनट) रोजगार के 20 मिलीलीटर इकट्ठा। जबकि वैक्यूम गठन से परहेज लगातार एकत्रित सिरिंज में perfusate प्रवाह की निगरानी।
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के प्रवाह रहेगा।
- ल्यूकोसाइट्स निष्कर्षण
- पर 400 × छ 10 मिनट के लिए perfusate अपकेंद्रित्र।
- तरल पदार्थ aspirate।
- 10 मिनट के लिए 400 XG पर 10 मिलीलीटर पीबीएस या मध्यम, सेंट्रीफ्यूज जोड़ें, और तरल पदार्थ aspirate। इस कदम दो बार दोहराएँ। पीबीएस या माध्यम का उपयोग नमूना के फलस्वरूप उपयोग पर निर्भर करता है।
- 10 मिनट के लिए 400 XG पर 20 मिलीलीटर पीबीएस या मध्यम, सेंट्रीफ्यूज जोड़ें, और तरल पदार्थ aspirate।
- वांछित एकाग्रता के लिए कोशिकाओं, नमूना उपयोग (FACS, पीसीआर, आदि) के आधार पर पुनर्गठित।
2. माउस प्रोटोकॉल
- तैयारी
- 2 तितली 25 जी सुइयों की व्यवस्था। वैकल्पिक रूप से, सुई की तेज धार दाखिल करके 2 कुंद धार तितली 25 जी सुइयों तैयार करते हैं।
- कैंची की 2 जोड़े, पा धार संदंश, hemostat, दांत-ऊतक संदंश गुरुत्वाकर्षण (सूखा) स्थापित करने पर कम से कम 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव द्वारा निष्फल: सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित।
- 1x पीबीएस समाधान के प्रति मिलीलीटर हेपरिन की 30 इकाइयों को जोड़कर heparinized पीबीएस (30 इकाइयों / एमएल) तैयार करें। आरटी पर प्रयोग करें। 25 मिलीलीटर की मात्रा कम से कम प्रति पशु की जरूरत है।
- streहवा के बुलबुले से बचने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप लाइनों और तितली सुइयों में पीबीएस heparinized रहा हूँ।
- फेफड़े और सांसद ल्यूकोसाइट्स के संग्रह का छिड़काव
- 8% isoflurane की अधिक मात्रा से पशु euthanize। निगरानी सांस लेने समापन से इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
- श्वसन की समाप्ति पर, तुरंत बाँझ कैंची और दांत-ऊतक संदंश का उपयोग पेरिटोनियल और सीने गुहाओं खुला। जिफाएडा प्रक्रिया को पेट के साथ एक midline पेट चीरा प्रदर्शन करना।
- उरोस्थि संदंश का प्रयोग, सावधानी से दोनों पक्षों पर रिब पिंजरे काटने लिफ्ट, किसी भी आंतरिक अंग या बड़े रक्त वाहिकाओं puncturing के बिना। उरोस्थि पर एक hemostat दबाना, और rostrally हृदय जटिल बेनकाब करने के लिए रिब पिंजरे गुना।
- एक hemostat के साथ रग कावा दबाना जिगर (चर्चा देखने के लिए) के पिछड़े छिड़काव से बचने के लिए।
- सही वेंचर में एक तितली क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का बहिर्वाह पाइप से जुड़ा सुई डालेंदिल की tricle, और एक दूसरे तितली दिल, interventricular पट की avoidingpenetration के बाएं वेंट्रिकल में एक 2 मिलीलीटर सिरिंज कटाई से जुड़ा सुई।
- लगभग 2 मिलीग्राम / मिनट की गति के लिए पंप पर बारी और जब तक perfusate लाल पीला (त्यागें रक्त दूषित perfuste) अंधेरे से बदल जाता है कटाई सिरिंज में खून से दूषित perfusate की पहली मिलीलीटर इकट्ठा।
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की समाप्ति के बिना, तेजी से एक 10 मिलीलीटर कटाई सिरिंज के साथ 2 मिलीलीटर सिरिंज कटाई की जगह है और फेफड़ों perfusate छिड़काव के एक उच्च गति (अप करने के लिए 4 मिलीग्राम / मिनट) रोजगार के 10 मिलीलीटर इकट्ठा। जबकि वैक्यूम गठन से परहेज लगातार एकत्रित सिरिंज में perfusate प्रवाह की निगरानी।
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के प्रवाह रहेगा।
- ल्यूकोसाइट्स निष्कर्षण
- पर 400 × छ 10 मिनट के लिए perfusate अपकेंद्रित्र।
- तरल पदार्थ aspirate।
- 400 में 10 मिलीलीटर पीबीएस या मध्यम, सेंट्रीफ्यूज जोड़े10 मिनट के लिए XG, और तरल पदार्थ aspirate। इस कदम के तीन बार दोहराएँ। पीबीएस या माध्यम का उपयोग नमूना के फलस्वरूप उपयोग पर निर्भर करता है।
- 10 मिनट के लिए 400 XG पर 10 मिलीलीटर पीबीएस या मध्यम, सेंट्रीफ्यूज जोड़ें, और तरल पदार्थ aspirate।
- वांछित एकाग्रता के लिए कोशिकाओं, नमूना उपयोग (FACS, पीसीआर, आदि) के आधार पर पुनर्गठित।
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Representative Results
सांसद डिब्बे प्रदर्शनी एक अलग ल्युकोसैट सबसेट रचना ल्यूकोसाइट्स घूम की तुलना में। प्रवाह cytometry विश्लेषण का प्रयोग, ल्युकोसैट उप-जनसंख्या की पहचान की और दोनों घूम और सांसद ल्यूकोसाइट्स की संरचना को चिह्नित करने के लिए मात्रा निर्धारित किया गया। Granulocytes और लिम्फोसाइटों आगे और पक्ष scatters के आधार पर पहचान की गई। लिम्फोसाइटों के भीतर, NKRP -1 उज्ज्वल कोशिकाओं एन.के. कोशिकाओं, टी कोशिकाओं के रूप में CD3 +, monocytes के रूप में RM1 +, और सीडी 4 + / सीडी 8 + / CD25 के रूप में पहचान की गई + टी सेल उप-जनसंख्या की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया। granulocytes, monocytes, और एन.के. कोशिकाओं सहित जन्मजात immunocytes, परिसंचरण (पी <0.05) में 27.9% (± 0.66%) की तुलना में, सांसद-ल्यूकोसाइट्स की आबादी का 52% (± 1.52%) का गठन किया। इसके विपरीत, सहित सीडी 4+, सीडी 4 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं, और विनियामक (सीडी 4 + CD25 +) टी सेल उप-जनसंख्या,टी कोशिकाओं, साथ ही वृक्ष के समान कोशिकाओं के संचलन की तुलना में सांसद डिब्बे में कम प्रतिशत का प्रदर्शन (पी <0.005, n = 8)। इस तनाव के सांसद डिब्बे में सेल उपज लगभग 3 लाख ल्यूकोसाइट्स (चित्रा 1) का गठन।
एन.के. कोशिकाओं के भीतर, दो उप-जनसंख्या सेल के आकार के आधार पर स्पष्ट कर रहे हैं। NKRP -1 लेबलिंग से आगे तितर बितर का एक तितर बितर साजिश का प्रयोग, एन.के. कोशिकाओं छोटे और बड़े एन.के. कोशिकाओं में विभाजित किया गया। सांसद डिब्बे, बड़े एन.के. कोशिकाओं (~ 30%) परिसंचरण (~ 10%) की तुलना में 3 गुना उच्च प्रतिशत दर्शाती है, जबकि एनके कोशिकाओं की कुल संख्या (चित्रा 2) के समान है। इसके अलावा, मानक 4 घंटा 51 करोड़ रिलीज परख का उपयोग, एन.के. कई लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ विरोधी ट्यूमर cytotoxicity 8 मापा गया था। शीघ्र ही, इस परख 51 करोड़ की राशि एन.के. सेल द्वारा विशिष्ट cytotoxicity का एक परिणाम के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं से जारी का आकलनएस। सांसद डिब्बे से एन.के. कोशिकाओं की क्षमता ट्यूमर कोशिकाओं lyse करने के लिए एन.के. कोशिकाओं घूम (चित्रा 3), दोनों MADB106 syngeneic सेल लाइन (चित्रा 3 ए) के खिलाफ के रूप में स्पष्ट की तुलना में अधिक है, और छुटकारा -1 मानक सेल लाइन (चित्रा 3 बी) । इसके अलावा, इन विवो पाली के माध्यम से प्रतिरक्षा उत्तेजना मैं: सी प्रशासन एन.के. कोशिकाओं घूम जब MADB106 लक्ष्य सेल लाइन (चित्रा 3 ए) का इस्तेमाल किया जाता है पर से सांसद एनके कोशिकाओं के एन.के. cytotoxicity पर एक और अधिक गहरा प्रभाव पैदा करता है।
चित्रा 1. विभिन्न ल्युकोसैट सबसेट रचना F344 चूहों में रक्त परिसंचरण की तुलना में सांसद डिब्बे की विशेषता है। सांसद डिब्बे में, जन्मजात उन्मुक्ति के अंश, परिसंचरण (52% बनाम 28%) में अपने समकक्ष की तुलना में जबकि टी कोशिकाओं के प्रसार के एक विपरीत अंतर दिखा रहे हैं बड़ा है (P0; 0.005; एन = 8)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 2. संचलन की तुलना में सांसद डिब्बे में वृद्धि की बड़ी एन.के. कोशिकाओं का प्रतिशत सांसद एन.के. कोशिकाओं का प्रदर्शन तीन गुना, एन.के. कोशिकाओं की तुलना में घूम बड़े एनके कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत (30% बनाम 10% क्रमशः;। पी < 0.05) है, जबकि एनके कोशिकाओं की कुल संख्या समान है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा संचलन की तुलना में सांसद डिब्बे में 3 उच्च एन.के. cytotoxicity।(ए) MADB106 लक्ष्य कोशिकाओं - एन.के. कोशिकाओं सांसद डिब्बे से काटा इस सेल लाइन के खिलाफ एक उल्लेखनीय cytotoxicity का प्रदर्शन किया है, जबकि घूम एन.के. कोशिकाओं कोई cytotoxicity दिखाने में विवो पाली द्वारा प्रतिरक्षा उत्तेजना मैं:। सी एन के cytotoxicity सांसद डिब्बे में बढ़ जाती है, लेकिन नहीं संचलन में। (बी) छुटकारा -1 लक्ष्य कोशिकाओं - एन.के. कोशिकाओं सांसद डिब्बे से काटा इस मानक सेल लाइन के खिलाफ एन.के. कोशिकाओं की तुलना में एक उच्च घूम cytotoxicity का प्रदर्शन किया। पाली द्वारा प्रतिरक्षा उत्तेजना मैं: सी दोनों सांसद डिब्बे और संचलन में एन.के. cytotoxicity बढ़ जाती है। एन.के. सेल नंबर cytotoxicity मूल्यांकन के लिए नियंत्रित किया गया। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि चयनात्मक कटाई में सक्षम बनाता है और सांसद ल्यूकोसाइट्स की अनूठी जनसंख्या का अध्ययन। घूम या प्लीहा ल्यूकोसाइट्स की तुलना में, सांसद आबादी ल्युकोसैट उप-जनसंख्या के एक विशिष्ट संरचना, उच्च सक्रियण स्तर, विभिन्न साइटोकिन्स के उच्च रिहाई, और समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स 2,3 के उच्च mRNA स्तर की विशेषता है। विशेष रूप से, हम पता चला है कि सांसद एनके कोशिकाओं विभिन्न लक्ष्य कोशिकाओं 3,4 के खिलाफ संचार एन.के. कोशिकाओं की तुलना में अधिक साइटोटोक्सिक हैं, और इंटरफेरॉन γ के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। कुल मिलाकर, हमारे परिणाम बताते हैं कि सांसद एनके ल्यूकोसाइट्स एन.के. कोशिकाओं घूम, और इस प्रकार रक्त जनित मेटास्टेसिस और फेफड़े के मेटास्टेसिस को नियंत्रित करने में अधिक से अधिक जैविक महत्व संकेत हो सकता है की तुलना में एक अधिक से अधिक cytotoxicity है। इसलिए, प्लीहा या घूम ल्यूकोसाइट्स सोने के मानक या प्रतिरक्षात्मक स्थिति को दर्शाती के लिए डिफ़ॉल्ट आबादी, और मानव अध्ययन के रूप में नहीं माना जाना चाहिए कि कॉमmonly ल्यूकोसाइट्स घूम सावधानी से व्याख्या की जानी चाहिए पर पूरी तरह भरोसा करते हैं। इसके अलावा, के रूप में विभिन्न रोगों के लिए विशेष रूप से फेफड़ों दण्ड, प्रतिरक्षा इस अंग के भीतर अध्ययन किया जाना चाहिए, और सांसद डिब्बे मध्य, parenchymal, और जंगली घोड़ा-वायुकोशीय उप डिब्बों से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए, के रूप में वास्तव में हमारे दृष्टिकोण का उपयोग कर छिड़काव मामला है।
इस प्रक्रिया की सफलता के आश्वासन के लिए, यह (मैं) पेट और छाती गुहाओं खोलने तेजी से श्वसन की पूर्ण समाप्ति के बाद, एक रक्तचाप कि अधिक से अधिक हृदय रक्त संग्रह में सक्षम बनाता है बनाए रखने के लिए, और (ii) एक अवांछनीय अतिरिक्त से परहेज करने के लिए महत्वपूर्ण है कुंद धार तितली सुइयों के इस्तेमाल के माध्यम से दिल वेंट्रिकल के छिद्र। एक अन्य प्रमुख बाधा फेफड़ों perfusate के भीतर रक्त की क्षमता का संक्रमण है। के रूप में फेफड़ों perfusate की पहली मिलीलीटर हृदय रक्त के साथ दूषित कर रहे हैं, वे के रूप में प्रदर्शन किया खारिज किया जाना चाहिए। ani के बीच मानकीकरण प्राप्त करने के लिएMals, सांसद perfusate का संग्रह शुरू करने के लिए कसौटी लाल पीला गहरे लाल रंग से संक्रमण पर आधारित है। इसके अलावा, यह एक गैर दाँतेदार hemostat के साथ रग कावा दबाना, जिगर के पिछड़े छिड़काव से बचने के लिए सिफारिश की है, खासकर अगर एक भी जिगर की लगातार छिड़काव के माध्यम से यकृत कोशिकाओं marginating इकट्ठा करना चाहती है। बाएं वेंट्रिकल से perfusate एकत्रित करते हैं, यह interventricular पट घुसना करने के लिए नहीं महत्वपूर्ण है। पिछले है, पीबीएस में हेपरिन छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया केशिकाओं से सांसद-ल्यूकोसाइट्स आबादी डिस्कनेक्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन कई खराबी हो सकती है, लेकिन उनमें से ज्यादातर सुधार-। अगर दिल में सुई के प्रवेश स्थल से एक रिसाव है, यह तितली सुई आसपास के दाँतेदार सुझावों के साथ एक कुंद नाक संदंश का उपयोग उठी हृदय की मांसपेशी सील करने के लिए सुझाव दिया है। एक सुई बाहर निकल जाता है, तो एसटूपी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, फिर से डालने के लिए अपने मूल प्रवेश साइट में सुई, और पंप को पुनः आरंभ। संग्रह प्रवाह रहता है, तो, एकत्रित वैक्यूम दबाव को रोकने वेंट्रिकल के भीतर सुई स्थानांतरित करना, और संग्रह को पुनः आरंभ। बाएं आलिंद फुलाया जाता है, और एक सतत संग्रह से कम नहीं है, तो पंप के प्रवाह की दर कम है। सामान्य तौर पर, एक उच्च प्रवाह की दर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला केशिका गठन नुकसान हो सकता है, और फेफड़ों में सूजन हो सकता है।
विधि वर्णित एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया में सांसद ल्युकोसैट आबादी का एक चयनात्मक कटाई सक्षम बनाता है। यह देखते हुए कि इस आबादी अन्य प्रतिरक्षा डिब्बों से ल्यूकोसाइट्स की तुलना में अद्वितीय विशेषताओं को दर्शाती है, और इस आबादी जीव के लिए जैविक और नैदानिक महत्व हो सकता है कि, हम इस विधि का उपयोग करें जब संभव है, खासकर जब फेफड़े से संबंधित प्रक्रियाओं और बीमारियों के अध्ययन का प्रस्ताव है। यह अभी तक है कि क्या सांसद कोशिकाओं है, जो फेफड़ों capill में रहते अज्ञात हैमेष कोशिकाओं कटाई पर, फेफड़ों में परिपक्व है, या वे फेफड़ों छोड़ने पर उनकी विशेषताओं बनाए रखना होगा कि क्या। अन्य डिब्बों से ल्यूकोसाइट्स रूप में सांसद आबादी का प्रोफ़ाइल प्रतिबिंबित नहीं कर सकते, क्योंकि यह मानव में सुलभ नहीं है, हम आगे इस पद्धति का उपयोग विशिष्ट घूम बायोमार्कर कि अद्वितीय विशेषताओं के साथ संबंध स्थापित सांसद स्पष्ट करने के लिए सुझाव देते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों और इस काम से एनआईएच / NCI अनुदान # R01CA172138 (SBE करने के लिए) समर्थित थे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
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