Introduction
I leucociti aderenti ai capillari dei polmoni (ad esempio, marginating-polmonare (MP) leucociti) 1 sono stati mostrati ad esporre distinti composizione dei leucociti e l'attività unico rispetto ai leucociti da altri comparti del sistema immunitario (ad esempio, la circolazione, milza, midollo osseo) 2- 4. Ad esempio, mostra MP-leucociti superiore cellule natural killer (NK) citotossicità contro varie cellule tumorali, rispetto al circolanti e milza cellule NK, così come i livelli differenziati RNA messaggero (mRNA) e aumento della secrezione di citochine pro e anti-infiammatori. La composizione delle cellule è anche differenziata da leucociti circolanti come MP-leucociti hanno un rapporto più elevato di immunità innata / adattativa rispetto ai leucociti circolanti (50% contro 30%, rispettivamente). L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di consentire la raccolta selettiva di MP-leucociti, per studiare questo compartimento immunitario importante ed unico (popolazione cellulare), e elucIDATE l'impatto delle varie manipolazioni (ad esempio, attivazione immunitaria) su queste cellule specifiche.
Per comprendere il significato di questa popolazione unica, è importante notare che il sistema immunitario può controllare cellule tumorali, micrometastasi e malattia residua che circola attraverso funzioni in vivo di immunità cellulo-mediata (CMI). Questa capacità è evidente nonostante il fallimento precedente del sistema immunitario di controllare il tumore primario, e supportato da ampia evidenza in vivo in pazienti oncologici e modelli animali 5. È importante sottolineare che questi risultati sono spesso in contrasto con in vitro ed ex vivo studi che riportano che la maggior parte delle cellule tumorali autologhe sono resistenti alla citotossicità dai leucociti nei campioni di sangue che circola da esseri umani e gli animali (misurata mediante saggi di citotossicità) 6,7. Questa discrepanza può essere attribuita alla presenza in vivo di popolazioni leucocitarie distinte, come il giàmenzionata popolazione leucocitaria MP, e in particolare la sua sottopopolazione di cellule NK attivate 3. Infatti, le cellule tumorali singenici (MADB106), che sono risultati essere resistenti alla circolazione e leucociti splenici, hanno dimostrato di essere lisate dalle cellule MP-NK 3,8. Così, le cellule MADB106 presumibilmente 'NK-resistenti "che metastatizzano polmoni di fischer344 (F344) ratti sono controllati da cellule MP-NK, ma non da cellule NK spleniche, comunemente studiato a causa della loro facilità di accesso circolante o.
Purificata e attivi MP-leucociti sono inaccessibili attraverso i metodi di raccolta standard dei leucociti dai polmoni, che si basano sulla macinazione tessuto polmonare o degradazione biologica 9. Il nostro approccio ha due grandi vantaggi rispetto agli approcci di lavorazione dei tessuti. Innanzitutto, l'approccio perfusione raccoglie selettivamente MP-leucociti, separandole da altre cellule che provengono dal parenchima polmonare, interstiziale, e compar bronco-alveolaretments. In secondo luogo, la tecnica di perfusione meglio preserva l'integrità e l'ambiente fisiologico MP-leucociti, a differenza della macinazione e trasformazione biologica approcci che danneggiano le cellule, alterano la morfologia e inducono la produzione e il rilascio di vari fattori che modulano l'attività immunitaria e specificamente sopprimono NK citotossicità 10.
I polmoni sono un importante organo bersaglio per le metastasi del cancro e per varie malattie infettive. Tutte le cellule maligne circolanti e cellule infettate passano attraverso i capillari polmonari, dove devono deformarsi e interagire con le cellule endoteliali dei capillari e leucociti residenti. In queste condizioni, le cellule circolanti possono essere facilmente bersaglio di MP-leucociti residenti. Sembra quindi biologicamente vantaggioso avere leucociti attivati in questo compartimento immunitario, ed è importante studiare questo unico MP-popolazione in impostazioni biologici, sperimentali e clinici differenti. E 'degno di nota che syattivazione stemic immune dai vari risposta modificatori biologici (ad esempio, l'acido polyinosinic-policitidilico (poli I: C) o di tipo C CpG oligonucleotidi (CpG-C ODN)) hanno dimostrato di attivare la MP-leucociti più di leucociti circolanti 3, 8,11.
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Protocol
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Tel-Aviv.
1. Protocollo Rat
- preparativi
- Disporre 2 farfalla 21 aghi G. Facoltativamente, preparare 2 farfalla 21 aghi smussati G taglio presentando il bordo tagliente dell'ago.
- Sterilizzare strumenti chirurgici: 2 paia di forbici, pinze smussato-taglio, emostatico, forcipe dente-tessuto sterilizzati in autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco).
- Preparare eparinizzato PBS (30 unità / ml) aggiungendo 30 unità di eparina per ml di soluzione di tampone fosfato (PBS 1x). Utilizzare a temperatura ambiente. 35 ml è il volume minimo necessario per animale.
- Streaming eparina PBS nelle linee pompa peristaltica e gli aghi a farfalla per evitare bolle d'aria.
- Perfusione dei polmoni e la raccolta di MP-leucociti
- Eutanasia l'animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Confermare l'eutanasia dal monitoraggio respirazione cessazione.
- Al momento della cessazione della respirazione, aprire immediatamente le cavità peritoneale e al torace con le forbici sterili e pinze dente-tessuto. Effettuare una incisione addominale mediana lungo l'addome fino al processo xifoideo.
- Sollevare lo sterno con le pinze, con cautela tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati, senza pungere qualsiasi organo interno o grandi vasi sanguigni. Bloccare una pinza emostatica sullo sterno, e rostralmente piegare la gabbia toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.
- Inserire un ago a farfalla nel ventricolo destro del cuore, ed entro circa un minuto raccogliere il massimo volume di sangue in una siringa (~ 6 ml da 250 g animale).
- Bloccare la vena cava con un emostatico per evitare la perfusione a ritroso del fegato (vedi la discussione).
- Tenere l'ago a farfalla nel ventricolo destro durante la sostituzione della siringa contenente il sangue con il tubo di efflusso della ppompa eristaltic.
- Inserire un secondo ago a farfalla collegato ad una siringa da 5 ml raccolta nel ventricolo sinistro, evitando la penetrazione del setto interventricolare.
- Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 5 ml / min e raccogliere delicatamente nella siringa la prima porzione di perfusato che sono contaminati con il sangue. Continuare fino a quando il colore si trasforma perfusato dallo scuro al rosso pallido. (Scartare il perfuste sangue contaminato).
- Senza cessazione della pompa peristaltica, rapidamente sostituire la raccolta siringa da 5 ml con una siringa da 20 ml raccolta e raccogliere 20 ml di perfusato polmone impiegando una maggiore velocità di perfusione (fino a 7 ml / min). Monitorare continuamente il flusso perfusato nella siringa raccolta, evitando la formazione di vuoto.
- Cessare la portata della pompa peristaltica.
- I leucociti Estrazione
- Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 × g.
- Aspirare il fluido.
- Aggiungere 10 ml di PBS o medie, centrifugare a 400 xg per 10 min, e aspirare il liquido. Ripetere questa operazione due volte. L'uso di PBS o mezzo dipende il conseguente impiego del campione.
- Aggiungere 20 ml di PBS o medie, centrifugare a 400 xg per 10 min, e aspirare il liquido.
- Ricostituire cellule alla concentrazione desiderata, basati sull'utilizzo campione (FACS, PCR, etc.).
2. Il protocollo del mouse
- preparativi
- Disporre 2 farfalla 25 aghi G. Facoltativamente, preparare 2 farfalla 25 aghi smussati G taglio presentando il bordo tagliente dell'ago.
- Sterilizzare strumenti chirurgici: 2 paia di forbici, pinze smussato-taglio, emostatico, forcipe dente-tessuto sterilizzati in autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco).
- Preparare eparinizzato PBS (30 unità / ml) aggiungendo 30 unità di eparina per ml di soluzione di PBS 1x. Utilizzare a temperatura ambiente. 25 ml è il volume minimo necessario per animale.
- stream eparinizzato PBS nelle linee pompa peristaltica e gli aghi a farfalla per evitare bolle d'aria.
- Perfusione dei polmoni e la raccolta di MP-leucociti
- Eutanasia l'animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Confermare l'eutanasia dal monitoraggio respirazione cessazione.
- Al momento della cessazione della respirazione, aprire immediatamente le cavità peritoneale e al torace con le forbici sterili e pinze dente-tessuto. Effettuare una incisione addominale mediana lungo l'addome fino al processo xifoideo.
- Sollevare lo sterno con le pinze, con cautela tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati, senza pungere qualsiasi organo interno o grandi vasi sanguigni. Bloccare una pinza emostatica sullo sterno, e rostralmente piegare la gabbia toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.
- Bloccare la vena cava con un emostatico per evitare la perfusione a ritroso del fegato (vedi la discussione).
- Inserire un ago a farfalla collegato al tubo di efflusso della pompa peristaltica nel ven destratricle del cuore, ed un secondo ago a farfalla collegato ad una raccolta siringa da 2 ml nel ventricolo sinistro del cuore, avoidingpenetration del setto interventricolare.
- Accendere la pompa ad una velocità di circa 2 ml / min e raccogliere i primi millilitri di perfusato sangue contaminato nella siringa di raccolta fino a quando il perfusato si trasforma dallo scuro al chiaro rosso (Scartare il perfuste sangue contaminato).
- Senza cessazione della pompa peristaltica, rapidamente sostituire la raccolta siringa da 2 ml con una siringa da 10 ml raccolta e raccogliere 10 ml di perfusato polmone impiegando una maggiore velocità di perfusione (fino a 4 ml / min). Monitorare continuamente il flusso perfusato nella siringa raccolta, evitando la formazione di vuoto.
- Cessare la portata della pompa peristaltica.
- I leucociti Estrazione
- Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 × g.
- Aspirare il fluido.
- Aggiungere 10 ml di PBS o mezzo, centrifugare a 400xg per 10 min, e aspirare il liquido. Ripetere questa operazione tre volte. L'uso di PBS o mezzo dipende il conseguente impiego del campione.
- Aggiungere 10 ml di PBS o medie, centrifugare a 400 xg per 10 min, e aspirare il liquido.
- Ricostituire cellule alla concentrazione desiderata, basati sull'utilizzo campione (FACS, PCR, etc.).
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Representative Results
La mostra MP-vano una diversa composizione dei leucociti sottoinsieme rispetto ai leucociti circolanti. Citometria a flusso di analisi, sottopopolazioni di leucociti sono stati identificati e quantificati per caratterizzare la composizione sia del circolante e leucociti MP. Granulociti e linfociti sono stati identificati sulla base disperde in avanti e laterali. All'interno dei linfociti, NKRP-1 le cellule luminose sono stati identificati come cellule NK, CD3 +, come le cellule T, RM1 + come monociti, e CD4 + / CD8 + / CD25 + sono stati utilizzati per l'identificazione T sottopopolazioni di cellule. immunociti innate, inclusi granulociti, monociti e cellule NK, costituite 52% (± 1,52%) della popolazione MP-leucociti, rispetto al 27,9% (± 0,66%) nella circolazione (p <0.05). Contrariamente, le sottopopolazioni di cellule T CD4 +, tra cui, le cellule CD4 + T CD8 +, e normativo (CD4 + CD25 +)cellule T, così come le cellule dendritiche, esposti percentuali inferiori nel vano MP rispetto alla circolazione (p <0,005; n = 8). Resa cella nel vano MP di questo ceppo costituisce di circa 3 milioni di leucociti (Figura 1).
All'interno delle cellule NK, due sottopopolazioni sono evidenti, in base alle dimensioni delle cellule. Utilizzando un grafico a dispersione di dispersione in avanti da NKRP 1 etichettatura, le cellule NK sono stati divisi in piccoli e grandi cellule NK. Il vano MP presenta a 3 volte più elevata percentuale di grandi cellule NK (~ 30%) rispetto alla circolazione (~ 10%), mentre il numero totale di cellule NK è simile (Figura 2). Inoltre, utilizzando il saggio standard di 4 ore 51 Cr liberatoria NK citotossicità antitumorale contro diverse cellule tumorali bersaglio è stata misurata 8. In breve, questo test valuta la quantità di 51 Cr rilasciata dalle cellule tumorali in seguito a specifica citotossicità da cellule NKS. La capacità delle cellule NK dal vano MP per lisare cellule tumorali è maggiore di cellule NK circolanti (figura 3), come evidente sia contro la MADB106 singenici linea cellulare (Figura 3A), e la linea cellulare standard YAC-1 (Figura 3B) . Inoltre, la stimolazione immunitaria attraverso in vivo poli I: C amministrazione produce un impatto più profondo sulla NK citotossicità delle cellule MP-NK che su cellule NK circolanti quando la linea di cellule bersaglio MADB106 viene utilizzato (Figura 3A).
Figura 1. diversa composizione dei leucociti sottoinsieme caratterizza la MP-vano rispetto alla circolazione nei ratti F344. Nel vano MP, la frazione di immunità innata è più grande rispetto al suo equivalente nella circolazione (52% vs. 28%), mentre la prevalenza di cellule T presentano una differenza opposta (p0; 0,005; n = 8). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. percentuale di grandi cellule NK aumentata nel compartimento MP rispetto alla circolazione cellule MP-NK esposte tre volte più alta percentuale di grandi cellule NK rispetto circolanti cellule NK (30% contro 10%, rispettivamente. P < 0.05), mentre il numero totale di cellule NK è simile. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Higher NK citotossicità nel vano MP rispetto alla circolazione.(A) MADB106 cellule bersaglio - cellule NK raccolte dal vano MP mostravano una marcata citotossicità contro questa linea cellulare, mentre circolanti cellule NK mostrano alcuna citotossicità in vivo stimolazione immunitaria poli I:. C aumenta la citotossicità NK nel vano MP, non però nella circolazione. (B) le cellule YAC-1 bersaglio - cellule NK raccolte dal vano MP mostrato una citotossicità superiore rispetto alle cellule NK circolanti contro questa linea cellulare standard. stimolazione immunitaria poli I: C aumenta la citotossicità NK sia nel vano MP e la circolazione. il numero di cellule NK sono stati controllati per la valutazione citotossicità. I dati sono espressi come media ± SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui presentata consente la raccolta selettiva e studiando della popolazione unica di MP-leucociti. Rispetto al circolante o leucociti splenici, la popolazione MP è caratterizzata da una diversa composizione delle sottopopolazioni di leucociti, livelli di attivazione superiori, maggior rilascio di varie citochine, e più elevati livelli di mRNA di pro- e citochine antinfiammatorie 2,3. In particolare, abbiamo dimostrato che le cellule MP-NK sono più citotossico cellule NK circolatori contro varie cellule bersaglio 3,4, ed esprimono alti livelli di interferone-γ. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che i leucociti MP-NK hanno una citotossicità superiore può implicare un maggior significato biologico nel controllo metastasi attraverso il sangue e le metastasi polmonari cellule NK circolanti, e in tal modo. Pertanto, leucociti splenici o circolanti non devono essere considerati come il gold standard o la popolazione di default per riflettere lo stato immunologico, e studi sull'uomo che comcomunemente si basano esclusivamente su dovrebbero essere interpretati con cautela leucociti circolanti. Inoltre, come varie malattie specificamente inferti i polmoni, l'immunità dovrebbe essere studiato all'interno di questo organo, e il vano MP deve essere distinto dal interstiziale, parenchimale, e sub-comparti Bronco-alveolare, è davvero il caso con il nostro approccio perfusione.
Per assicurare il successo di questa procedura, è fondamentale (i) aprire la cavità addominale e del torace rapidamente dopo completa cessazione della respirazione, per mantenere una pressione del sangue che permette la massima raccolta del sangue cardiaco, e (ii) a non un ulteriore indesiderabile perforazione del ventricolo cuore attraverso l'uso di aghi a farfalla smussati taglio. Un altro ostacolo chiave è la potenziale contaminazione del sangue all'interno del perfusato polmone. Come la prima porzione di perfusato polmone sono contaminati con il sangue cardiaca, devono essere scartati come dimostrato. Per ottenere la standardizzazione tra animals, il criterio per iniziare a raccogliere perfusato MP è basato sulla transizione colore dal rosso scuro al rosso chiaro. Inoltre, si raccomanda di bloccare la vena cava con una pinza emostatica non dentata, per evitare perfusione all'indietro del fegato, soprattutto se si vuole raccogliere anche marginating cellule epatiche attraverso successive perfusione del fegato. Mentre raccoglie perfusato dal ventricolo sinistro, è fondamentale non penetrare il setto interventricolare. Infine, l'eparina in PBS utilizzato per la perfusione è cruciale per scollegare la popolazione MP-leucociti dai capillari, e quindi deve essere utilizzato.
Diversi malfunzionamenti possono verificarsi durante l'esecuzione di questa procedura, ma la maggior parte di loro sono correggibili. Se vi è una perdita dal sito di penetrazione dell'ago nel cuore, si consiglia di sigillare il muscolo cardiaco rottura utilizzando una pinza smussato naso con punte zigrinate circondano l'ago a farfalla. Se un ago scivola fuori, stop la pompa peristaltica, ri-inserire l'ago nel suo sito di penetrazione originale, e riavviare la pompa. Se il flusso di raccolta cessa, fermare la pressione di vuoto di raccolta, spostare l'ago nel ventricolo, e riavviare la collezione. Se l'atrio sinistro è gonfiato, e non viene ridotta di una raccolta continua, abbassare la portata della pompa. In generale, un elevato tasso di flusso peristaltica può danneggiare la formazione capillare e polmoni può diventare gonfio.
Il metodo descritto permette una raccolta selettiva della popolazione leucocitaria MP in un procedimento relativamente semplice. Dato che questa popolazione presenta caratteristiche uniche rispetto ai leucociti da altri compartimenti immunitarie, e che questa popolazione può avere significato biologico e clinica per l'organismo, si propone l'uso di questo metodo quando possibile, soprattutto quando si studiano i processi e malattie polmonari correlati. E 'ancora noto se le cellule MP, che risiedono nel capill polmoneAriete su cellule di raccolta, hanno maturato nei polmoni, o se avrebbe mantenuto le loro caratteristiche in uscita dall'impianto di polmoni. Come leucociti da altri compartimenti non può riflettere il profilo della popolazione MP, e dato che non è accessibile in esseri umani, abbiamo ulteriormente suggeriamo che utilizzano questo metodo per chiarire specifici biomarker circolanti che correlano con le caratteristiche uniche MP.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori e questo lavoro sono stati sostenuti da NIH / NCI concessione # R01CA172138 (a SBE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
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