Introduction
Os leucócitos aderentes para os capilares dos pulmões (isto é, marginating-pulmonar (MP) leucócitos) foram 1 mostrado exibir composição distinta de leucócitos e a actividade única em comparação com os leucócitos a partir de outros compartimentos do sistema imunológico (por exemplo, circulação, do baço, da medula óssea) 2- 4. Por exemplo, exposição de MP-leucócitos maior células assassinas naturais (NK) a citotoxicidade contra diversas células tumorais, em comparação com células circulantes e esplénicos NK, bem como os níveis de RNA mensageiro (mRNA) diferenciadas e aumento da secreção de citoquinas pró-inflamatórias e anti. A composição das células também é diferenciado a partir de leucócitos circulantes como MP-leucócitos têm uma proporção mais elevada de imunidade inata / adaptativa em comparação com os leucócitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de MP-leucócitos, a fim de estudar este compartimento imunológica importante e original (população de células), e a elucIdate o impacto das diversas manipulações (por exemplo, ativação imune) sobre essas células específicas.
Para compreender o significado deste população original, é importante notar que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula através de funções in vivo de imunidade mediada por células (CMI). Esta capacidade é evidente, apesar da falha precedente do sistema imunitário para controlar o tumor primário, e suportado por um amplo evidências in vivo em doentes com cancro e em modelos animais 5. Mais importante, estes resultados são muitas vezes inconsistentes com estudos in vitro e ex vivo, que reportam que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade por leucócitos em amostras de sangue em circulação a partir de seres humanos e animais (medido por ensaios de citotoxicidade) 6,7. Esta discrepância pode ser atribuída à existência in vivo, de populações de leucócitos distintas, tais como o supramencionado população de leucócitos MP e, especificamente, a sua subpopulação de células NK activadas 3. Com efeito, as células singeneicas de tumor (MADB106), que se verificou ser resistente à circulante e leucócitos esplénicas, foram mostrados para serem lisadas por células NK-MP 3,8. Assim, as células '' resistentes a NK-alegadamente MADB106 que metastizam para os pulmões de ratos fischer344 (F344) são controlados por células NK-MP, mas não por células NK circulantes ou esplénicas, que são vulgarmente estudada, dada a sua facilidade de acesso.
Purificada e activas MP-leucócitos são inacessíveis através dos métodos de colheita padrão de leucócitos a partir dos pulmões, os quais são baseados na moedura de tecido pulmonar ou degradação biológica 9. A nossa abordagem tem duas vantagens principais em comparação com abordagens de processamento de tecidos. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente MP-leucócitos, separando-os de outras células que se originam a partir do parênquima pulmonar, intersticial e compar bronco-alveolartimentos. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade e o meio fisiológico de MP-leucócitos, ao contrário da moagem e processamento biológico abordagens que danificam as células, alteram a sua morfologia, e induzem a produção e libertação de vários factores que modulam a actividade imunológica e especificamente suprimem NK citotoxicidade 10.
Os pulmões são um dos principais alvos de metástase do câncer e para várias doenças infecciosas. Todas as células malignas circulantes e células infectadas passar através dos capilares pulmonares, onde eles precisam deformar e interagir com as células endoteliais capilares e leucócitos residentes. Sob estas condições, as células circulantes podem ser facilmente alvo de MP-leucócitos residentes. Parece, portanto, biologicamente vantajoso ter leucócitos activados neste compartimento imune, e é importante para estudar esta MP-população única em diferentes configurações biológicos, experimentais, e clínicos. É digno de nota que syactivação stemic imune por vários-resposta-modificadores biológicos (por exemplo, ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) ter mostrado activar MP-leucócitos mais de leucócitos circulantes 3, 8,11.
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Protocol
Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv.
1. Protocolo Rat
- preparativos
- Organizar 2 borboleta 21 agulhas G. Opcionalmente, prepare 2 borboleta 21 g agulhas gumes contundentes mediante a apresentação da borda afiada da agulha.
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos: 2 pares de tesouras, fórceps embotados-gumes, hemostática, fórceps dente-de tecidos esterilizadas por autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco).
- Prepare heparinizado PBS (30 unidades / ml) por adição de 30 unidades de heparina por ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS 1x). Use a RT. 35 ml é o volume mínimo necessário por animal.
- Transmitir heparinizado PBS para as linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para evitar bolhas de ar.
- Perfusão dos Pulmões e recolha de MP-leucócitos
- Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Confirmar eutanásia por cessação de monitorização de respiração.
- Após interrupção da respiração, abra imediatamente as cavidades peritoneal e no peito, usando a tesoura estéreis e pinças dente de tecidos. Realizar uma incisão abdominal na linha média ao longo do abdómen até o processo xifóide.
- Levante o esterno usando a pinça, cuidadosamente cortar a caixa torácica em ambos os lados, sem perfurar qualquer órgão interno ou grandes vasos sanguíneos. Fixe uma pinça hemostática sobre o esterno, e rostralmente dobrar a caixa torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
- Inserir uma agulha de borboleta dentro do ventrículo direito do coração, e no prazo de, aproximadamente, um minuto recolher o volume máximo de sangue para uma seringa (~ 6 ml a partir de 250 g de origem animal).
- Prender a veia cava com uma pinça hemostática para evitar trás perfusão do fígado (ver discussão).
- Segure a agulha borboleta dentro do ventrículo direito ao substituir a seringa contendo o sangue com o tubo de saída do pbomba eristaltic.
- Inserir uma segunda agulha borboleta ligada a uma seringa de 5 mL de colheita para o ventrículo esquerdo, evitando a penetração do septo interventricular.
- Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de cerca de 5 ml / min e recolhem suavemente para dentro da seringa os primeiros ml de perfusato que estão contaminados com sangue. Continue até que a cor perfusato muda de escuro para vermelho pálido. (Descartar o perfuste contaminados com sangue).
- Sem abandono da bomba peristáltica, rapidamente substituir a seringa de 5 mL com uma seringa de colheita de 20 ml de colheita e recolher 20 ml de perfusato pulmão empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 7 ml / min). monitorizar continuamente o fluxo de perfundido para a seringa de recolha, evitando ao mesmo tempo a formação de vácuo.
- Cessar o fluxo da bomba peristáltica.
- leucócitos Extração
- Centrifuga-se o perfusado durante 10 min a 400 x g.
- Aspirar o fluido.
- Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido. Repita esta etapa duas vezes. O uso de PBS ou meio depende da consequente utilização da amostra.
- Adicionar 20 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido.
- Reconstituir as células na concentração desejada, com base na utilização da amostra (FACS, PCR, etc.).
2. Rato Protocolo
- preparativos
- Organizar 2 borboleta 25 agulhas G. Opcionalmente, prepare 2 borboleta 25 g agulhas gumes contundentes mediante a apresentação da borda afiada da agulha.
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos: 2 pares de tesouras, fórceps embotados-gumes, hemostática, fórceps dente-de tecidos esterilizadas por autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco).
- Prepare heparinizado PBS (30 unidades / ml) por adição de 30 unidades de heparina por ml de solução de PBS 1x. Use a RT. 25 ml é o volume mínimo necessário por animal.
- streestou heparinizado PBS para as linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para evitar bolhas de ar.
- Perfusão dos Pulmões e recolha de MP-leucócitos
- Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Confirmar eutanásia por cessação de monitorização de respiração.
- Após interrupção da respiração, abra imediatamente as cavidades peritoneal e no peito, usando a tesoura estéreis e pinças dente de tecidos. Realizar uma incisão abdominal na linha média ao longo do abdómen até o processo xifóide.
- Levante o esterno usando a pinça, cuidadosamente cortar a caixa torácica em ambos os lados, sem perfurar qualquer órgão interno ou grandes vasos sanguíneos. Fixe uma pinça hemostática sobre o esterno, e rostralmente dobrar a caixa torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
- Prender a veia cava com uma pinça hemostática para evitar trás perfusão do fígado (ver discussão).
- Inserir uma agulha borboleta ligado ao tubo de saída da bomba peristáltica para a direita ventricle do coração, e uma segunda agulha borboleta ligada a uma seringa de 2 ml de colheita para o ventrículo esquerdo do coração, avoidingpenetration do septo interventricular.
- Ligue a bomba a uma velocidade de aproximadamente 2 ml / min e recolher os primeiros ml de perfusato contaminados com sangue na seringa a colheita até que o perfusato muda de escuro para vermelho pálido (Descartar o perfuste contaminados com sangue).
- Sem abandono da bomba peristáltica, rapidamente substituir a 2 ml de seringa de colheita com uma seringa de 10 ml de colheita e recolher 10 ml de perfusato pulmão empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 4 ml / min). monitorizar continuamente o fluxo de perfundido para a seringa de recolha, evitando ao mesmo tempo a formação de vácuo.
- Cessar o fluxo da bomba peristáltica.
- leucócitos Extração
- Centrifuga-se o perfusado durante 10 min a 400 x g.
- Aspirar o fluido.
- Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400xg durante 10 min, e aspirar o fluido. Repita este passo três vezes. O uso de PBS ou meio depende da consequente utilização da amostra.
- Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido.
- Reconstituir as células na concentração desejada, com base na utilização da amostra (FACS, PCR, etc.).
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Representative Results
A exposição MP-compartimento uma composição de leucócitos subconjunto diferente em comparação com leucócitos circulantes. Usando a análise de citometria de fluxo, as subpopulações de leucócitos foram identificados e quantificados para caracterizar a composição de ambas as circulante e leucócitos MP. Granulócitos e linfócitos foram identificados com base na frente eo lado espalha. Dentro dos linfócitos, NKRP-1 células vivas foram identificadas como células NK, CD3 + como células T, como RM1 +, monócitos e células T CD4 + / CD8 + / CD25 + foram utilizadas para a identificação de subpopulações de células. imunócitos inatas, incluindo granulócitos, monócitos e células NK, constituía 52% (± 1,52%) da população MP-leucócitos, comparado com 27,9% (± 0,66%) na circulação (p <0,05). Contrariamente, as subpopulações de células T, incluindo células T CD4 +, células T CD4 + CD8 +, e reguladora (CD4 + CD25 +)células T, bem como células dendríticas, apresentaram percentagens inferiores no compartimento de MP em comparação com a circulação (p <0,005; n = 8). Rendimento celular no compartimento MP desta estirpe constituem de aproximadamente 3 milhões de leucócitos (Figura 1).
Dentro das células NK, duas subpopulações são evidentes, com base no tamanho da célula. Usando um gráfico de dispersão de dispersão para a frente por NKRP-1 rotulagem, as células NK foram divididos em células NK pequenas e grandes. O compartimento MP exibe uma percentagem de 3 vezes mais elevada de grandes células NK (~ 30%) em comparação com a circulação (~ 10%), enquanto o número total de células NK é semelhante (Figura 2). Além disso, utilizando o ensaio padrão de libertação de 51Cr de 4 h, NK citotoxicidade antitumoral contra várias células tumorais alvo foi medida 8. Em breve, este teste avalia a quantidade de 51Cr libertado de células tumorais como resultado da citotoxicidade específica pela célula NKs. A capacidade das células NK do compartimento de MP para lisar as células de tumor é maior do que as células NK em circulação (Figura 3), como evidente contra tanto o MADB106 linha celular singénica (Figura 3A), e a linha de células padrão YAC-1 (Figura 3B) . Além disso, a estimulação imune in vivo por meio de poli I: C administração produz um impacto mais profundo sobre a citotoxicidade NK de células MP-NK do que em células NK circulantes, quando a linha de células alvo MADB106 é usado (Figura 3A).
Figura 1. Composição de leucócitos subconjunto diferente caracteriza o MP-compartimento em comparação com a circulação em ratos F344. No compartimento do MP, a fracção da imunidade inata é maior em comparação com o seu equivalente em circulação (52% vs. 28%), enquanto que a prevalência de células T exibem uma diferença oposto (p0; 0.005; n = 8). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O aumento da percentagem de células NK grandes no compartimento de MP em comparação com a circulação células MP-NK apresentaram um de três vezes mais elevada percentagem de células NK em comparação com grandes células circulantes NK (30% vs 10%, respectivamente;. P < 0,05), enquanto o número total de células NK é semelhante. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. NK citotoxicidade superior no compartimento de MP em comparação com a circulação.(A) MADB106 células alvo - células NK colhidas a partir do compartimento de MP exibiram uma citotoxicidade significativa contra esta linha de células, enquanto que circulam células NK não mostram nenhuma citotoxicidade in vivo estimulação imunitária por poli I:. C aumenta NK citotoxicidade no compartimento de MP, mas não na circulação. (B) As células YAC-1 alvo - células NK colhidas a partir do compartimento de MP apresentaram uma citotoxicidade superior em comparação com as células NK circulantes contra esta linha de células padrão. estimulação imune por poli I: C aumenta NK citotoxicidade tanto compartimento do MP ea circulação. o número de células NK foram controlados para avaliação da citotoxicidade. Os dados são expressos como média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método aqui apresentado permite a colheita selectiva e estudo da população única de MP-leucócitos. Em comparação com circulante ou leucócitos esplénicas, a população MP é caracterizada por uma composição distinta de subpopulações de leucócitos, níveis de activação mais elevadas, maior libertação de várias citocinas, e mais elevados os níveis de mRNA de citocinas pró- e anti-inflamatórios 2,3. Especificamente, mostraram que as células NK-MP são mais citotóxicos do que as células circulatórias NK contra várias células alvo 3,4, e expressam os níveis mais elevados de interferão-γ. Em geral, os nossos resultados sugerem que os leucócitos MP-NK tem uma citotoxicidade maior que circula células NK, e, portanto, pode implicar um significado biológico mais preponderante no controlo metástases transmitidas pelo sangue e metástases pulmonares. Portanto, leucócitos esplénicos ou circulantes não deve ser considerada como o padrão ouro ou população padrão para refletir estado imunológico, e estudos em humanos que commumente depender exclusivamente dos leucócitos circulantes devem ser interpretados com cautela. Além disso, como várias doenças especificamente provocado os pulmões, a imunidade deve ser estudada dentro deste órgão, e o compartimento MP deve ser distinguido do intersticial, parênquima e sub-compartimentos bronco-alveolar, como, aliás, é o caso, utilizando a nossa abordagem de perfusão.
Para garantir o sucesso deste procedimento, é crucial para (i) abrir cavidades abdominais e torácicas rapidamente após a cessação completa da respiração, para manter uma pressão arterial que permite a coleta de sangue cardíaco máximo, e (ii) que se abstenha de um adicional indesejável perfuração do ventrículo do coração através do uso de agulhas borboleta arestas embotadas. Outro obstáculo fundamental é a potencial contaminação do sangue dentro do perfusato pulmão. Como os primeiros ml de perfusato pulmão estão contaminados com sangue cardíaco, que deve ser descartada como demonstrado. Para alcançar a normalização entre aniMals, o critério para iniciar a recolha do perfundido MP baseia-se na transição de cor de vermelho escuro para vermelho pálido. Além disso, recomenda-se a prender a veia cava com uma pinça hemostática não-serrilhada, a fim de evitar a perfusão do fígado para trás, especialmente se se deseja recolher também marginating células hepáticas através de perfusão sucessiva do fígado. Durante a recolha do perfundido a partir do ventrículo esquerdo, não é crucial para penetrar o septo interventricular. Por último, a heparina em PBS utilizada para a perfusão é crucial para a activação da população MP-leucócitos dos vasos capilares, e, por conseguinte, deve ser utilizada.
Várias falhas podem ocorrer quando executar este procedimento, mas a maioria deles são corrigíveis. Se houver uma fuga do local de penetração da agulha no interior do coração, sugere-se a selar o músculo cardíaco rompido utilizando um fórceps sem corte de nariz com pontas serrilhadas em torno da agulha de borboleta. Se uma agulha desliza para fora, stop a bomba peristáltica, re-inserir a agulha no seu local de penetração do original, e reinicie a bomba. Se o fluxo de recolha cessa, travar a pressão de vácuo coleta, mudar a agulha dentro do ventrículo, e reiniciar o coleção. Se o átrio esquerdo é inflado, e não é reduzido por um conjunto contínuo, reduzir a taxa de fluxo da bomba. Em geral, uma taxa de fluxo de alta peristáltica pode prejudicar a formação capilar, e os pulmões podem ficar inchadas.
O método aqui descrito permite uma colheita selectiva da população de leucócitos MP num procedimento relativamente simples. Dado que esta população exibe características originais em comparação com os leucócitos a partir de outros compartimentos do sistema imunológico, e que esta população pode ter importância biológica e clínica para o organismo, é proposta a utilização deste método quando possível, especialmente quando se estudam processos e doenças relacionadas com a pulmonares. É ainda desconhecido se as células MP, que residem na capill pulmãoaries sobre as células colheita, amadureceram nos pulmões, ou se eles iriam manter as suas características aquando da sua saída dos pulmões. Como leucócitos a partir de outros compartimentos podem não reflectir o perfil da população MP, e uma vez que não é acessível em seres humanos, sugere-se adicionalmente a utilização deste método para elucidar biomarcadores circulantes específicos que se correlacionam com as características únicas MP.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores e este trabalho foram apoiados pelo NIH / NCI conceder # R01CA172138 (a SBE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O'Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
