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Immunology and Infection

La recolección selectiva de leucocitos marginando-pulmonar

Published: March 11, 2016 doi: 10.3791/53849
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Sagol School of Neuroscience & School of Psychological Sciences, Tel-Aviv University
* These authors contributed equally

Introduction

Los leucocitos se adhieren a los capilares de los pulmones (es decir, marginando-pulmonar (MP) leucocitos) 1 se mostraron para exhibir composición de leucocitos distinto y actividad única en comparación con los leucocitos de otros compartimentos inmunes (por ejemplo, la circulación, el bazo, la médula ósea) 2- 4. Por ejemplo, exhiben MP-leucocitos superior natural killer (NK) citotoxicidad frente a varias células tumorales, en comparación con circulantes y esplénicas células NK, así como los niveles diferenciados de ARN mensajero (ARNm) y aumento de la secreción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias. La composición de células también se diferencia de leucocitos circulantes como MP-leucocitos tienen una relación más alta de la inmunidad innata / adaptativa en comparación con los leucocitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de MP-leucocitos, con el fin de estudiar este compartimiento inmune importante y única (población de células), y para elucidate el impacto de las diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas.

Para comprender el significado de esta población única, es importante tener en cuenta que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual circula a través de las funciones in vivo de la inmunidad mediada por células (CMI). Esta capacidad es evidente a pesar del fracaso precedente del sistema inmunológico para controlar el tumor primario, y apoyado por amplia en pruebas in vivo en pacientes con cáncer y en modelos animales 5. Es importante destacar que estos resultados son a menudo incompatibles con los estudios in vitro y ex vivo, que informan que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación de leucocitos en muestras de sangre de seres humanos y animales (medido por ensayos de citotoxicidad) 6,7. Esta discrepancia puede ser atribuida a la existencia in vivo de poblaciones de leucocitos distintos, tales como los antesmencionada población de leucocitos MP, y concretamente su subpoblación de células NK activadas 3. De hecho, las células tumorales (singénicos MADB106), que se encontraron ser resistente a la circulación y leucocitos esplénicos, se demostró que la lisis por las células NK MP-3,8. Por lo tanto, las células supuestamente 'NK-resistentes' MADB106 que hacen metástasis a los pulmones de fischer344 ratas (F344) están controlados por las células MP-NK, pero no por las células NK esplénicas, que comúnmente se estudian dada su facilidad de acceso o circulante.

Purificado y activos MP-leucocitos son inaccesibles a través de los métodos de cosecha estándar de leucocitos de los pulmones, que se basan en la molienda tejido pulmonar o la degradación biológica 9. Nuestro enfoque tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques de procesamiento de tejidos. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente MP-leucocitos, separándolas de otras células que se originan en el parénquima pulmonar, intersticial, y compar bronco-alveolartments. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor conserva la integridad y el medio fisiológico de MP-leucocitos, a diferencia de la molienda y el procesamiento biológico se acerca que dañan las células, alterar su morfología, e inducen la producción y liberación de diversos factores que modulan la actividad inmune y específicamente suprimen NK 10 citotoxicidad.

Los pulmones son un órgano principal objetivo para la metástasis del cáncer y para diversas enfermedades infecciosas. Todas las células malignas circulantes y células infectadas pasan a través de los capilares pulmonares, donde tienen que deformarse e interactuar con las células endoteliales de los capilares y leucocitos residentes. En estas condiciones, las células circulantes pueden ser fácilmente dirigidos por residentes MP-leucocitos. Por tanto, parece biológicamente ventajoso tener leucocitos activados en este compartimiento inmune, y es importante para estudiar este MP-población única en diferentes entornos biológicos, experimentales y clínicos. Es digno de notar que syactivación stemic inmune por varias-respuesta modificadores biológicos (por ejemplo, ácido poliinosínico-policitidílico (poli I: C) o oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) han demostrado para activar MP-leucocitos más de leucocitos circulantes 3, 8,11.

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Protocol

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Tel-Aviv.

1. Protocolo de rata

  1. Preparativos
    1. Organizar 2 mariposa 21 G agujas. Opcionalmente, se preparan 2 mariposa 21 G-agujas romas filo presentando el borde afilado de la aguja.
    2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de tijeras, pinzas afiladas embotado, pinzas hemostáticas, pinzas de dientes de tejidos esterilizados en autoclave a 121 ° C durante al menos 30 minutos en el establecimiento de la gravedad (en seco).
    3. Preparar heparinizada PBS (30 unidades / ml) mediante la adición de 30 unidades de heparina por ml de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Utilizar a temperatura ambiente. 35 ml es el volumen mínimo necesario por animal.
    4. Transmitir heparinizada PBS en las líneas de bombas peristálticas y las agujas de mariposa para evitar burbujas de aire.
  2. La perfusión de los pulmones y la recolección de MP-leucocitos
    1. La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Confirmar la eutanasia por el cese de monitoreo de respiración.
    2. Tras el cese de la respiración, de inmediato abrir las cavidades peritoneales y el pecho con las tijeras y pinzas estériles diente-tejido. Realizar una incisión abdominal en la línea media a lo largo del abdomen hasta el proceso xifoides.
    3. Levantar el esternón utilizando los fórceps, el corte con cautela la caja torácica en ambos lados, sin perforar cualquier órgano interno o grandes vasos sanguíneos. Sujetar una pinza hemostática en el esternón, y rostral plegar la caja torácica para exponer el complejo cardiopulmonar.
    4. Insertar una aguja de mariposa en el ventrículo derecho del corazón, y dentro de aproximadamente un minuto recoger el máximo volumen de sangre en una jeringa (~ 6 ml de un animal de 250 g).
    5. Abrazadera de la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión hacia atrás del hígado (véase la discusión).
    6. Mantenga la aguja mariposa dentro del ventrículo derecho, mientras que la sustitución de la jeringa que contiene la sangre con el tubo de salida de la peristaltic bomba.
    7. Inserte una segunda aguja de mariposa conectada a una jeringa de recolección 5 ml en el ventrículo izquierdo, evitando la penetración del septo interventricular.
    8. Encienda la bomba peristáltica a una velocidad de aproximadamente 5 ml / min y recoger suavemente en la jeringa los primeros mililitros de líquido de perfusión que están contaminadas con sangre. Continuar hasta que el color se vuelve líquido de perfusión de oscuro a rojo pálido. (Descartar el perfuste contaminada con sangre).
    9. Sin cese de la bomba peristáltica, sustituir rápidamente la jeringa de recolección 5 ml con una jeringa de 20 ml cosecha y recoger 20 ml de líquido de perfusión pulmonar que emplea una mayor velocidad de perfusión (hasta 7 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de perfundido en la jeringa de recogida, evitando al mismo tiempo la formación de vacío.
    10. Cese el flujo de la bomba peristáltica.
  3. Extracción leucocitos
    1. Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g.
    2. Aspirar el líquido.
    3. Añadir 10 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido. Repita este paso dos veces. El uso de PBS o medio depende de la consiguiente uso de la muestra.
    4. Añadir 20 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido.
    5. Reconstituir las células a la concentración deseada, con base en el uso de la muestra (FACS, PCR, etc.).

2. Protocolo de ratón

  1. Preparativos
    1. Organizar 2 mariposa 25 G agujas. Opcionalmente, se preparan 2 mariposa 25 G-agujas romas filo presentando el borde afilado de la aguja.
    2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de tijeras, pinzas afiladas embotado, pinzas hemostáticas, pinzas de dientes de tejidos esterilizados en autoclave a 121 ° C durante al menos 30 minutos en el establecimiento de la gravedad (en seco).
    3. Preparar heparinizada PBS (30 unidades / ml) mediante la adición de 30 unidades de heparina por ml de solución de 1x PBS. Utilizar a temperatura ambiente. 25 ml es el volumen mínimo necesario por animal.
    4. Stream heparinizada PBS en las líneas de bombas peristálticas y las agujas de mariposa para evitar burbujas de aire.
  2. La perfusión de los pulmones y la recolección de MP-leucocitos
    1. La eutanasia a los animales por una sobredosis de 8% de isoflurano. Confirmar la eutanasia por el cese de monitoreo de respiración.
    2. Tras el cese de la respiración, de inmediato abrir las cavidades peritoneales y el pecho con las tijeras y pinzas estériles diente-tejido. Realizar una incisión abdominal en la línea media a lo largo del abdomen hasta el proceso xifoides.
    3. Levantar el esternón utilizando los fórceps, el corte con cautela la caja torácica en ambos lados, sin perforar cualquier órgano interno o grandes vasos sanguíneos. Sujetar una pinza hemostática en el esternón, y rostral plegar la caja torácica para exponer el complejo cardiopulmonar.
    4. Abrazadera de la vena cava con una pinza hemostática para evitar la perfusión hacia atrás del hígado (véase la discusión).
    5. Insertar una aguja de mariposa conectada a la tubería de salida de la bomba peristáltica a la derecha ventricle del corazón, y una segunda aguja de mariposa conectada a una jeringa de recolección 2 ml en el ventrículo izquierdo del corazón, avoidingpenetration del tabique interventricular.
    6. Encienda la bomba a una velocidad de aproximadamente 2 ml / min y recoger los primeros ml de líquido de perfusión contaminada con sangre en la jeringa de recolección hasta que el líquido de perfusión se convierte de oscuro a rojo pálido (Descartar el perfuste contaminada con sangre).
    7. Sin cese de la bomba peristáltica, sustituir rápidamente la jeringa de recolección 2 ml con una jeringa de 10 ml de cosecha y recoger 10 ml de líquido de perfusión pulmonar que emplea una mayor velocidad de perfusión (hasta 4 ml / min). Monitorear continuamente el flujo de perfundido en la jeringa de recogida, evitando al mismo tiempo la formación de vacío.
    8. Cese el flujo de la bomba peristáltica.
  3. Extracción leucocitos
    1. Centrifugar el perfundido durante 10 minutos a 400 x g.
    2. Aspirar el líquido.
    3. Añadir 10 ml de PBS o medio de centrifugación a 400,xg durante 10 min, y aspirar el líquido. Repita este paso tres veces. El uso de PBS o medio depende de la consiguiente uso de la muestra.
    4. Añadir 10 ml de PBS o medio, de centrifugación a 400 xg durante 10 min, y aspirar el líquido.
    5. Reconstituir las células a la concentración deseada, con base en el uso de la muestra (FACS, PCR, etc.).

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Representative Results

La exposición MP-compartimiento de una composición de leucocitos subconjunto diferente en comparación con los leucocitos circulantes. Utilizando el análisis de citometría de flujo, se identificaron y se cuantificaron las subpoblaciones de leucocitos para caracterizar la composición de ambos leucocitos circulantes y MP. Granulocitos y linfocitos fueron identificados en base a primero y la cara dispersa. Dentro de los linfocitos, se identificaron NKRP-1 células brillantes como las células NK, CD3 + como las células T, RM1 + como monocitos y CD4 + / CD8 + / CD25 + se utilizaron para la identificación T subpoblaciones de células. inmunocitos innatas, incluyendo los granulocitos, monocitos y células NK, constituían 52% (± 1,52%) de la población MP-leucocitos, en comparación con 27,9% (± 0,66%) en la circulación (p <0,05). Contrariamente, las subpoblaciones de células T, incluyendo CD4 +, las células CD4 + T CD8 +, y regulador (CD4 + CD25 +)células T, así como las células dendríticas, exhibieron porcentajes más bajos en el compartimiento de MP en comparación con la circulación (p <0,005; n = 8). Rendimiento celular en el compartimento de MP de esta cepa constituye de aproximadamente 3 millones de leucocitos (Figura 1).

Dentro de las células NK, dos subpoblaciones son evidentes, basado en el tamaño celular. El uso de un gráfico de dispersión de dispersión hacia adelante por NKRP-1 etiquetado, las células NK se dividieron en células NK pequeñas y grandes. El compartimiento MP exhibe un 3 veces mayor porcentaje de grandes células NK (~ 30%) en comparación con la circulación (~ 10%), mientras que el número total de células NK es similar (Figura 2). Por otra parte, utilizando el 4 hr 51 ensayo estándar de liberación de Cr, se midió la citotoxicidad de NK antitumoral contra varias células tumorales diana 8. En breve, este ensayo se evalúa la cantidad de 51 Cr liberado de las células tumorales como resultado de la citotoxicidad específica de las células NKs. La capacidad de las células NK desde el compartimiento de MP para lisar las células tumorales es mayor que circula células NK (Figura 3), como es evidente tanto contra el MADB106 línea de células singénicas (Figura 3A), y la línea celular estándar YAC-1 (Figura 3B) . Además, la estimulación inmune a través de poli in vivo I: administración C produce un impacto más profundo en la citotoxicidad de NK de las células MP-NK que en las células NK circulantes cuando la línea de células diana MADB106 se utiliza (Figura 3A).

Figura 1
Figura 1. Composición de leucocitos subconjunto diferente caracteriza la MP-compartimiento en comparación con la circulación en las ratas F344. En el compartimiento de MP, la fracción de la inmunidad innata es más grande en comparación con su equivalente en la circulación (52% vs. 28%), mientras que la prevalencia de las células T muestran una diferencia opuesto (p0; 0,005; n = 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Aumento del porcentaje de grandes células NK en el compartimiento de MP en comparación con la circulación células MP-NK mostraron una tres veces mayor porcentaje de grandes células NK en comparación con circulación de las células NK (30% vs. 10%, respectivamente;. P < 0,05), mientras que el número total de células NK es similar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. citotoxicidad Superior NK en el compartimiento de MP en comparación con la circulación.(A) MADB106 células diana - células NK cosechadas desde el compartimiento MP mostraron una citotoxicidad marcada en contra de esta línea celular, mientras que circulan células NK no muestran citotoxicidad in vivo la estimulación inmune por poli I:. C aumenta la citotoxicidad de NK en el compartimiento de MP, pero no en la circulación. (B) las células YAC-1 diana - las células NK cosechadas desde el compartimiento MP mostró una citotoxicidad mayor en comparación con las células NK circulantes contra esta línea celular estándar. la estimulación inmune por poli I: C aumenta la citotoxicidad de NK, tanto en el compartimiento de MP y la circulación. el número de células NK se controlaron para la evaluación de la citotoxicidad. Los datos se expresan como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método presentado en este documento permite la recogida selectiva y el estudio de la población única de MP-leucocitos. En comparación con los leucocitos esplénicos o circulante, la población MP se caracteriza por una composición distinta de subpoblaciones de leucocitos, los niveles de activación más altos, mayor liberación de varias citoquinas, y más altos niveles de ARNm de pro- y citocinas antiinflamatorias 2,3. Específicamente, hemos demostrado que las células MP-NK son más citotóxicos que las células NK circulatorios contra diversas células diana 3,4, y expresan niveles más altos de interferón-γ. En general, nuestros resultados sugieren que los leucocitos MP-NK tienen una citotoxicidad mayor que las células NK circulantes, y por lo tanto puede implicar una mayor importancia biológica en el control de metástasis transmitidas por la sangre y las metástasis pulmonares. Por lo tanto, los leucocitos esplénicos o de circulación no deben ser considerados como el estándar de oro o de la población por defecto para lo que refleja el estado inmunológico, y los estudios en humanos que comcomúnmente se basa únicamente en los leucocitos circulantes deben interpretarse con precaución. Además, como varias enfermedades infligen específicamente los pulmones, la inmunidad debe ser estudiada dentro de este órgano, y el compartimiento de MP debe distinguirse de la intersticial, parénquima, y ​​bronco-alveolar sub-compartimientos, como de hecho es el caso usando nuestro enfoque de perfusión.

Para asegurar el éxito de este procedimiento, es crucial para (i) abrir las cavidades abdominales y torácicas rápidamente tras el cese completo de la respiración, para mantener una presión arterial que permite la extracción de sangre cardiaco máximo, y (ii) abstenerse de un adicional no deseable perforación del ventrículo del corazón mediante el uso de agujas de mariposa romos-filo. Otro obstáculo clave es la posible contaminación de la sangre dentro de la perfusión pulmonar. Como los primeros mililitros de líquido de perfusión de pulmón están contaminados con sangre cardiaca, que deben desecharse como se ha demostrado. Para lograr la estandarización entre los animals, el criterio para comenzar a recoger el perfundido MP se basa en la transición de color de rojo oscuro a rojo pálido. Además, se recomienda para sujetar la vena cava con una pinza hemostática no dentada, para evitar la perfusión hacia atrás del hígado, especialmente si se quiere recoger también marginando células hepáticas a través de la perfusión sucesiva del hígado. Mientras que la recogida de la perfundido desde el ventrículo izquierdo, es crucial no penetrar en el tabique interventricular. Por último, la heparina en el PBS utilizado para la perfusión es crucial para la desconexión de la población MP-leucocitos desde los capilares, y por lo tanto debe ser utilizado.

Varios fallos pueden presentarse al realizar este procedimiento, pero la mayoría de ellos son corregibles. Si hay una fuga en el lugar de penetración de la aguja en el corazón, se sugiere para sellar el músculo cardíaco ruptura utilizando un fórceps romos de nariz con puntas dentadas que rodean la aguja de mariposa. Si una aguja se desliza hacia fuera, stop la bomba peristáltica, vuelva a insertar la aguja en su lugar de penetración original y reiniciar la bomba. Si el flujo cesa colección, detener la presión de vacío recoger, trasladar la aguja dentro del ventrículo, y reiniciar la colección. Si se infla la aurícula izquierda, y no se reduce por una recogida continua, reducir la tasa de flujo de la bomba. En general, una alta tasa de flujo peristáltica puede dañar la formación de capilares, y los pulmones puede hincharse.

El método descrito en este documento permite una cosecha selectiva de la población de leucocitos MP en un procedimiento relativamente simple. Teniendo en cuenta que esta población presenta características únicas en comparación a los leucocitos de los otros compartimentos inmunes, y que esta población puede tener importancia biológica y clínica para el organismo, se propone la utilización de este método siempre que sea posible, especialmente cuando se estudian los procesos y las enfermedades relacionadas con pulmonares. Es aún desconocido si las células MP, que residen en el pulmón capillaries sobre las células cosecha, han madurado en los pulmones, o si se mantendría sus características a la salida de los pulmones. Como los leucocitos de otros compartimentos puede no reflejar el perfil de la población MP, y ya que no es accesible en los seres humanos, se sugiere además la utilización de este método para dilucidar biomarcadores circulantes específicos que se correlacionan con las características únicas MP.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores y este trabajo fueron apoyados por NIH / NCI subvención # R01CA172138 (a SBE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle OMG 26G
Butterfly needle OMG 21G*3/4"
Syringe Pic solution 1 ml
Syringe Pic solution 2.5 ml
Syringe Pic solution 5 ml
Syringe Pic solution 10 ml
Syringe Pic solution 25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) Sigma Aldrich

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References

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Shaashua, L., Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, S. Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes. J. Vis. Exp. (109), e53849, doi:10.3791/53849 (2016).

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