Selektiv Skörd av Marginating-lung leukocyter

Introduction

Leukocyter som fastnat på kapillärerna i lungorna (dvs, marginating-pulmonell (MP) leukocyter) ¹ visades att uppvisa distinkta leukocyt komposition och unik aktivitet jämfört med leukocyter från andra immun fack (t.ex., cirkulation, mjälte, benmärg) ^{2- 4.} Till exempel, MP-leukocyter uppvisar högre naturliga mördar (NK) -celler cytotoxicitet mot olika tumörceller, jämfört med cirkulerande och mjält-NK-celler, såväl som differentierade budbärar-RNA (mRNA) -nivåer och ökad utsöndring av pro- och anti-inflammatoriska cytokiner. Sammansättningen av celler är också differentierad från cirkulerande leukocyter som MP-leukocyter har ett högre förhållande mellan medfödda / adaptiv immunitet jämfört med cirkulerande leukocyter (50% vs. 30%, respektive). Målet med den metod som presenteras här är att möjliggöra selektiv skörd av MP-leukocyter, för att studera denna viktiga och unika immun fack (cellpopulation), och att elucIDATE effekterna av olika manipulationer (t.ex. immunaktivering) på dessa specifika celler.

För att förstå betydelsen av denna unika befolkning, är det viktigt att notera att immunsystemet kan styra cirkulerande tumörceller, mikrometastaser och kvarvarande sjukdom genom in vivo-funktioner cellmedierad immunitet (CMI). Denna förmåga är uppenbart trots prejudikat fel i immunsystemet för att styra den primära tumören, och med stöd av riklig in vivo bevis hos cancerpatienter och djurmodeller ^5. Viktigt är dessa resultat är ofta oförenliga med in vitro och ex vivo studier, som rapporterar att de flesta autologa tumörceller är resistenta mot cytotoxicitet genom cirkulerande leukocyter i blodprov från människor och djur (mätt med cytotoxicitetsanalyser) ^6,7. Denna diskrepans kan tillskrivas förekomsten av olika leukocytpopulationer, såsom ovan in vivoovannämnda MP leukocytpopulationen, och särskilt dess subpopulation av aktiverade NK-celler ^3. Faktum är syngena tumörceller (MADB106), som befanns vara resistenta mot cirkulerande och mjälten leukocyter, visade sig lyseras av MP-NK-celler ^3,8. Således är de påstått "NK-resistenta" MADB106 celler som metastasera till lungorna hos fischer344 (F344) råttor kontrolleras av MP-NK-celler, men inte genom att cirkulera eller mjälte NK-celler, som vanligtvis studeras med tanke på deras lättillgänglighet.

Renade och aktiva MP-leukocyter är otillgängliga genom de standardskördemetoder av leukocyter från lungorna, som är baserade på lungvävnad slipning eller biologisk nedbrytning ^9. Vår strategi har två stora fördelar jämfört med vävnadsbearbetningsmetoder. För det första perfusion metod skördar selektivt MP-leukocyter, som skiljer dem från andra celler som härrör från lunga parenkymala, interstitiell och bronko-alveolär jämtments. För det andra, perfusion tekniken bättre bevarar integriteten och den fysiologiska miljön i MP-leukocyter, till skillnad från slipning och biologisk bearbetning närmar sig skadar celler, förändrar deras morfologi och inducera produktion och frisättning av olika faktorer som modulerar immunaktivitet och specifikt undertrycker NK cytotoxicitet ^10.

Lungorna är en stor målorgan för cancermetastaser och för olika infektionssjukdomar. Alla cirkulerande maligna celler och infekterade celler passera genom lungkapillärerna, där de behöver för att deformera och interagera med kapillära endotelceller och bosatta leukocyter. Under dessa förhållanden kan cirkulerande celler lätt måltavla bosatta MP-leukocyter. Det verkar således biologiskt fördelaktigt att ha aktiverade leukocyter i detta immun fack, och det är viktigt att studera denna unika MP-befolkningen i olika biologiska, experimentella och kliniska inställningar. Det är värt att notera att systemic immunaktivering genom olika biologiska-svar-modifierare (t.ex. polyinosinic-polycytidylsyra (poly-I: C) eller typ-C CpG oligodeoxinukleotider (CpG-C ODN)) har visats aktivera MP-leukocyter mer än cirkulerande leukocyter ^{3, 8,11.}

Protocol

Förfaranden med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Tel Aviv University.

1. Rat Protocol

1. preparat
   1. Ordna 2 fjäril 21 G nålar. Eventuellt förbereda 2 trubbiga fjäril 21 G nålar genom att lämna in den skarpa kanten av nålen.
   2. Sterilisera kirurgiska instrument: 2 saxar, trubbiga kanter pincett, hemostat, tandvävnads pincett steriliseras genom autoklav vid 121 ° C under minst 30 minuter på (torr) inställning allvar.
   3. Förbereda hepariniserat PBS (30 enheter / ml) genom att tillsätta 30 enheter heparin per ml fosfatbuffrad koksaltlösning (1 x PBS) -lösning. Använd vid RT. 35 ml är den minimala volymen som krävs per djur.
   4. Stream heparin PBS i den peristaltiska pumpen linjer och fjärilen nålar för att undvika luftbubblor.
2. Perfusion av lungorna och Insamling av MP-leukocyter
   1. Avliva djuret genom en överdos av 8% isofluran. Bekräfta dödshjälp genom att övervaka andnings upphörande.
   2. Vid upphörande av andning, omedelbart öppna peritoneala och bröst håligheter med hjälp av steril sax och tandvävnads pincett. Utför en mittlinje buksnitt längs buken upp till xiphoid processen.
   3. Lyft bröstbenet med hjälp av pincett, försiktigt skära bröstkorgen på båda sidor, utan att punktera några inre organ eller stora blodkärl. Klämma en hemostat på bröstbenet, och rostrally vika bröstkorgen för att exponera hjärt-komplexet.
   4. Sätt en fjärilsnål i höger kammare i hjärtat, och inom ungefär en minut samla den maximala volymen av blod i en spruta (~ 6 ml från en 250 g djur).
   5. Kläm fast hålvenen med en hemostat för att undvika bakåt perfusion av levern (se diskussion).
   6. Håll fjärilsnål i den högra ventrikeln medan ersätter sprutan innehållande blodet med utloppsröret av peristaltic pump.
   7. Mata in en andra fjärilsnål ansluten till en skörd spruta 5 ml in i den vänstra ventrikeln, undvika penetrering av kammarskiljeväggen.
   8. Slå på den peristaltiska pumpen med en hastighet av ca 5 ml / min och försiktigt samla in i sprutan de första milliliter perfusat som är förorenade med blod. Fortsätt tills perfusatet färgen skiftar från mörkt till ljust rött. (Kasta blod-förorenade perfuste).
   9. Utan upphörande av den peristaltiska pumpen, snabbt ersätta den skörd sprutan 5 ml med en 20 ml skörd spruta och samla in 20 ml av lung perfusat som utnyttjar en högre hastighet av perfusion (upp till 7 ml / min). Kontinuerligt övervaka perfusatet flöde in i uppsamlingssprutan, samtidigt som man undviker vakuumbildning.
   10. Upphöra med flödet av den peristaltiska pumpen.
3. leukocyter Extraktion
   1. Centrifugera perfusatet under 10 min vid 400 x g.
   2. Aspirera fluid.
   3. Tillsätt 10 ml PBS eller medium centrifugera vid 400 xg under 10 min och aspirera vätska. Upprepa detta steg två gånger. Användning av PBS eller medium beror på den därav följande användningen av provet.
   4. Tillsätt 20 ml PBS eller medium centrifugera vid 400 xg under 10 min och aspirera vätska.
   5. Rekonstituera cellerna till den önskade koncentrationen, baserat på provanvändning (FACS, PCR, etc.).

2. musprotokollet

1. preparat
   1. Ordna 2 fjäril 25 G nålar. Eventuellt förbereda 2 trubbiga fjäril 25 G nålar genom att lämna in den skarpa kanten av nålen.
   2. Sterilisera kirurgiska instrument: 2 saxar, trubbiga kanter pincett, hemostat, tandvävnads pincett steriliseras genom autoklav vid 121 ° C under minst 30 minuter på (torr) inställning allvar.
   3. Förbereda hepariniserat PBS (30 enheter / ml) genom att tillsätta 30 enheter heparin per ml 1 x PBS-lösning. Använd vid RT. 25 ml är den minimala volymen som krävs per djur.
   4. Streär hepariniserat PBS i den peristaltiska pumpen linjer och fjärilen nålar för att undvika luftbubblor.
2. Perfusion av lungorna och Insamling av MP-leukocyter
   1. Avliva djuret genom en överdos av 8% isofluran. Bekräfta dödshjälp genom att övervaka andnings upphörande.
   2. Vid upphörande av andning, omedelbart öppna peritoneala och bröst håligheter med hjälp av steril sax och tandvävnads pincett. Utför en mittlinje buksnitt längs buken upp till xiphoid processen.
   3. Lyft bröstbenet med hjälp av pincett, försiktigt skära bröstkorgen på båda sidor, utan att punktera några inre organ eller stora blodkärl. Klämma en hemostat på bröstbenet, och rostrally vika bröstkorgen för att exponera hjärt-komplexet.
   4. Kläm fast hålvenen med en hemostat för att undvika bakåt perfusion av levern (se diskussion).
   5. Sätt en fjärilsnål ansluten till utloppsröret av den peristaltiska pumpen i rätt ventricle av hjärtat, och en andra fjärilsnål ansluten till en skörd spruta 2 ml i den vänstra ventrikeln av hjärtat, avoidingpenetration av kammarskiljeväggen.
   6. Slå på pumpen till en hastighet av cirka 2 ml / min och samla de första milliliter blod-förorenade perfusat i avverknings sprutan tills perfusatet skiftar från mörkt till ljust rött (Kasta blod-förorenade perfuste).
   7. Utan upphörande av den peristaltiska pumpen, snabbt ersätta den skörd sprutan 2 ml med en 10 ml skörd spruta och samla 10 ml lung perfusat som utnyttjar en högre hastighet av perfusion (upp till 4 ml / min). Kontinuerligt övervaka perfusatet flöde in i uppsamlingssprutan, samtidigt som man undviker vakuumbildning.
   8. Upphöra med flödet av den peristaltiska pumpen.
3. leukocyter Extraktion
   1. Centrifugera perfusatet under 10 min vid 400 x g.
   2. Aspirera fluid.
   3. Tillsätt 10 ml PBS eller medium centrifugera vid 400xg under 10 min och aspirera vätska. Upprepa detta steg tre gånger. Användning av PBS eller medium beror på den därav följande användningen av provet.
   4. Tillsätt 10 ml PBS eller medium centrifugera vid 400 xg under 10 min och aspirera vätska.
   5. Rekonstituera cellerna till den önskade koncentrationen, baserat på provanvändning (FACS, PCR, etc.).

Representative Results

MP-facket uppvisar en annan leukocyter delmängd sammansättning jämfört med cirkulerande leukocyter. Använda flödescytometrianalys, var leukocyt subpopulationer identifieras och kvantifieras för att karakterisera sammansättningen av både cirkulerande och MP leukocyter. Granulocyter och lymfocyter identifierades baserat på framåt och sido skingrar. Inom lymfocyterna var NKRP-1 ^ljusa celler identifieras som NK-celler, CD3 ⁺ som T-celler, RM1 ⁺ som monocyter och CD4 ⁺ / CD8 ⁺ / CD25 ⁺ användes för T-cellspopulationer identifiering. Medfödda immunocyter, inklusive granulocyter, monocyter och NK-celler, utgjorde 52% (± 1,52%) av MP-leukocyter population, jämfört med 27,9% (± 0,66%) i cirkulationen (p <0,05). Tvärtom, de T-cell-underpopulationer, inklusive CD4 ^+, CD4 ⁺ CD8 ⁺ T-celler, och reglerande (CD4 ⁺ CD25 ⁺⁾T-celler, såväl som dendritiska celler, uppvisade lägre procentandelar i kombiutrymmet jämfört med cirkulationen (p <0,005, n = 8). Cellutbytet i MP fack av denna stam utgör på cirka 3 miljoner leukocyter (Figur 1).

Inom NK-celler, två subpopulationer är uppenbara, baserat på cellstorleken. Med hjälp av ett punktdiagram över framåtspridning av NKRP-en märkning, var NK-celler delas upp i små och stora NK-celler. MP fack uppvisar en 3-faldigt högre andel stora NK-celler (~ 30%) jämfört med cirkulationen (~ 10%), medan det totala antalet NK-celler är liknande (Figur 2). Dessutom, med hjälp av standard 4 h ⁵¹ Cr-frisättningsanalys, NK antitumör cytotoxicitet mot flera mål-tumörceller mättes ^åtta. Inom kort denna analys bedömer mängden ⁵¹ Cr frisatt från tumörceller som ett resultat av specifik cytotoxicitet genom NK-cells. Förmågan hos NK-celler från kombifacket för att lysera tumörceller är större än cirkulerande NK-celler (Figur 3), såsom framgår mot både den MADB106 syngena cellinje (Figur 3A), och YAC-1-normen-cellinjen (figur 3B) . Dessutom immunstimulering genom in vivo poly-I: C administrering ger en mer djupgående inverkan på NK cytotoxiciteten hos MP-NK-celler än på cirkulerande NK-celler när MADB106 målcell linje används (figur 3A).

Figur 1. Olika leukocyter delmängd komposition kännetecknar MP-facket jämfört med cirkulationen i F344 råttor. I kombifacket, den fraktion av medfödd immunitet är större jämfört med dess motsvarighet i cirkulationen (52% vs. 28%), medan förekomsten av T-celler uppvisar en motsatt skillnad (p0; 0,005; n = 8). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Ökad andelen stora NK-celler i kombiutrymmet jämfört med cirkulationen MP-NK-celler uppvisade en tre gånger högre procentandel av stora NK-celler jämfört med cirkulerande NK-celler (30% mot 10%, respektive;. P < 0,05), medan det totala antalet NK-celler är liknande. klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Högre NK cytotoxicitet i MP utrymmet jämfört med cirkulationen.(A) målceller MADB106 - NK-celler som skördats från kombifacket uppvisade en markant cytotoxicitet mot denna cellinje, medan cirkulerande NK-celler visar ingen cytotoxicitet in vivo immunstimulering av poly I:. C ökar NK cytotoxicitet i MP facket, men inte i cirkulationen. (B) YAC-1-målceller - NK-celler som skördats från kombifacket uppvisade en högre cytotoxicitet jämfört med cirkulerande NK-celler mot denna standard cellinje. Immunstimulering av poly-I: C ökar NK cytotoxicitet i både MP fack och cirkulationen. NK-cell nummer kontrollerades med avseende på cytotoxicitet bedömning. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den metod som presenteras häri möjliggör en selektiv skörd och studera av den unika population av MP-leukocyter. Jämfört med cirkulerande eller mjälten leukocyter, är MP befolkningen kännetecknas av en distinkt sammansättning leukocyt subpopulationer, högre aktiverings högre frisättning av olika cytokiner, och högre mRNA-nivåer av pro- och antiinflammatoriska cytokiner ^2,3. Specifikt har vi visat att MP-NK-celler är mer cytotoxiskt än cirkulations NK-celler mot olika målceller ^3,4 och express högre nivåer av interferon-γ. Totalt sett våra resultat tyder på att MP-NK leukocyter har en större cytotoxicitet än cirkulerande NK-celler, och kan således innebära en större biologisk betydelse vid reglering av blodburna metastaser och pulmonella metastaser. Därför bör mjälten eller cirkulerande leukocyter inte betraktas som den gyllene standarden eller standard population för att reflektera immunologisk status, och humanstudier som commonly enbart förlita sig på cirkulerande leukocyter bör tolkas med försiktighet. Eftersom olika sjukdomar specifikt orsaka lungorna, immunitet bör studeras inom detta organ, och MP utrymmet bör skiljas från interstitiell, parenkymal och bronco-alveolär underavdelningarna, är så verkligen är fallet med hjälp av vår perfusion metod.

För att säkerställa framgången för detta förfarande, är det viktigt att (i) öppna buken och bröstet håligheter snabbt efter fullständigt upphörande av andning, för att upprätthålla ett blodtryck som möjliggör maximal hjärtblodinsamling, och (ii) att avstå från en oönskad extra perforering av hjärtat ventrikeln genom användning av trubbiga fjärilsnålar. En annan viktig hinder är den potentiella kontaminering av blod i lungorna perfusatet. När de första milliliter lung perfusat är förorenade med hjärt blod, bör de kasseras som demonstreras. För att uppnå standardisering mellan animals, är kriteriet för att börja samla MP perfusatet baserat på färgen övergången från mörkt röd till ljusröd. Dessutom, är det rekommenderat att klämma vena cava med en icke-tandad hemostat, för att undvika bakåt perfusion av levern, i synnerhet om man önskar också samla marginating leverceller genom successiv perfusion av levern. Samtidigt samla perfusatet från vänster kammare, är det viktigt att inte tränga skiljeväggen mellan kamrarna. Slutligen heparinet i PBS användes för perfusion är avgörande för att koppla bort MP-leukocyter befolkningen från kapillärerna, och därför måste användas.

Flera fel kan uppstå när du utför den här proceduren, men de flesta av dem är korrigerbara. Om det finns ett läckage från penetration platsen för nålen in i hjärtat, föreslås det att täta brustna hjärtmuskeln med ett trubbigt-nosed pincett med tandade tips kring fjärilsnål. Om en nål glider ut, stop den peristaltiska pumpen, åter in nålen i dess ursprungliga penetration plats och starta pumpen. Om insamling flöde upphör, stoppa uppsamlingsvakuumtryck, flytta nålen i kammaren, och starta om samlingen. Om den vänstra förmaket är uppblåst, och är inte minskas med en kontinuerlig insamling, sänka flödeshastigheten för pumpen. I allmänhet kan en hög peristaltisk flödeshastighet skada kapillärbildning, och lungorna kan bli svullen.

Den metod som beskrivs häri möjliggör en selektiv skörd av MP leukocytpopulationen i en relativt enkel procedur. Med tanke på att denna population uppvisar unika egenskaper i jämförelse med leukocyter från andra immun fack, och att denna population kan ha biologisk och klinisk betydelse för organismen, föreslår vi att använda denna metod när så är möjligt, i synnerhet när man studerar lungrelaterade processer och sjukdomar. Det är ännu inte känt om MP-celler, som uppehåller sig i lungan CAPILLaries på celler skörd har mognat i lungorna, eller om de skulle behålla sina egenskaper när de lämnar lungorna. Som leukocyter från andra avdelningar kan inte återspegla profilen av MP befolkningen, och eftersom det inte är tillgängligt i människor, vidare föreslår vi att använda denna metod för att belysa specifika cirkulerande biomarkörer som korrelerar med de unika MP egenskaper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26G
Butterfly needle	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)	Sigma Aldrich