Summary
Die Validierung der enzymatischen Aktivitäten in biochemischen Wege beteiligt sind, können mit Hilfe der funktionellen Komplementierung Analyse (FCA) erläutert. Beschrieben in diesem Manuskript ist das FCA-Assay der enzymatischen Aktivität von Enzymen involviert in den Metabolismus von Aminosäuren, bakterielle stringenten Antwort und bakterielle Peptidoglycan-Biosynthese zeigen.
Abstract
Funktionelle Komplementierung Assay (FCA) ist ein in - vivo - Test , die häufig verwendet wird , um die Funktion / Rolle der Gene / Enzyme aufzuklären. Diese Technik ist in der Biochemie, Genetik und viele andere Disziplinen sehr verbreitet. Einen umfassenden Überblick über die Technik, um die Lehre der biochemischen Wege zur Ergänzung betreffend Säuren, Peptidoglycan und die bakterielle strenge Reaktion auf Amino ist in diesem Manuskript berichtet. Zwei cDNAs aus der Modellpflanzenorganismus Arabidopsis thaliana , die im Metabolismus von Lysin (L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL) und Tyrosin - Aminotransferase (tyrB) involviert in den Metabolismus von Tyrosin und Phenylalanin sind markiert. Zusätzlich beteiligt sind, die bakterielle Peptidoglycan anabolen Stoffwechselweg wird durch die Analyse des UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (murE) Gen aus dem Bakterium Verrucomicrobium spinosum im Quer beteiligt hervorgehoben-Verknüpfung von Peptidoglycan. Die bakterielle stringent Antwort wird auch durch die Analyse des rsh (r ELA / s poT h omolog) bifunktionellen Gen für eine hyper mukoiden Phänotyp in dem Bakterium Novosphingobium sp berichtet. Vier Beispiele von FCA vorgestellt. Das Video konzentriert sich auf drei von ihnen, nämlich Lysin, Peptidoglykan und die strenge Antwort.
Introduction
Funktionelle Komplementation im Zusammenhang mit der Funktion Aufklären (n) / Rolle (n) eines Gens wird als die Fähigkeit einer bestimmten homologe oder orthologe Gen definiert eine bestimmte Mutante mit einer beobachtbaren Phänotyp zu dem Wildtyp-Zustand, wenn die homologe wiederherzustellen oder orthologen Gen in cis oder trans in den mutierten Hintergrund eingeführt. Diese Technik wurde verwendet, um weithin isolieren und die Funktion (en) / Rolle (n) vieler Gene zu identifizieren. Ein besonderes Beispiel ist die Isolierung und Identifizierung von Orotidin-5-phosphat - Decarboxylase aus Candida albicans unter Verwendung des ura3 - Mutante von S. cerevisiae und die pyrF Mutante von E. coli. 1 Die Autoren haben diese Technik verwendet , um die Funktion der Gene zu erhellen , die in den Stoffwechsel von Aminosäuren, Peptidoglycan und dem stringent Reaktion in ihre Forschungsprogramme beteiligt sind und haben diese Technik in ihre Lehrprogramme in der B eingebautiotechnology und Molecular Bioscience (BMB) Programm am Rochester Institute of Technology (RIT).
Die Autoren lehren Grundlagen der Pflanzenbiochemie / Pathologie (FPBP) (Hudson) und Bioseparations: Principles and Practices (BPP) (Hudson / Savka), zwei obere Abteilung Wahl Labor basierte Kurse im BMB-Programm an der RIT. Da einige der Themen, die in den Kursen diskutiert mit ihren Forschungsinteressen verbunden sind, haben die Autoren viele der Techniken und experimentellen Tools integriert, die in ihren jeweiligen Forschungsprogrammen in diese beiden Labor-basierte Kurse verwendet werden. Ein solches Beispiel ist funktionelle Komplementation als Laborübung der Vortragsmaterialien zu verstärken Bezug Säuremetabolismus von Pflanzen Amino, Peptidoglycan und dem stringent Reaktion Stoffwechsel von Bakterien.
Drei der Aminosäurewege von Pflanzen, die in der FPBB natürlich behandelt werden, sind die von Lysin (lys), Tyrosin(Tyr) und Phenylalanin (Phe). Der lys Weg wird im Rahmen hervorgehoben wegen der Bedeutung der Aminosäure als essentielle Aminosäure für alle Tiere insbesondere Menschen , da Tiere , die genetische Maschinerie fehlt lys de novo zu synthetisieren. Darüber hinaus wurde entdeckt, dass es vor kurzem Pflanzen einen Weg für die Synthese von lys verwenden, die von der von Bakterien signifikant unterscheidet. Diese Entdeckung wurde zum Teil durch funktionelle Komplementierung der E. erleichtert coli Diaminopimelat (dap) , Mutanten unter Verwendung eines Gens , das das Enzym L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL) von der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. 2 ist die Variante Wege für die Synthese von lys durch den Zwischen Diaminopimelat kodiert sind in Fig. 1 gezeigten Zusätzlich erleichtert die Synthese von lys durch die Aspartat - Familie abgeleitet von Aminosäuren , die stark reguliert. 3 neben ihrer Bedeutung in Protein synthesis, die Wege für tyr und phe markiert sind ihre Bedeutung gegeben in die als Vorläuferverbindungen für den Anabolismus von Phenylpropanstoffwechsels Verbindungen , die die Synthese von Pflanzenabwehrstoffe beteiligt , wie:. Alkaloide, Lignine, Flavonoide, Isoflavonoide, Hydroxyzimtsäure unter anderem 4 Die tyr und phe Wege werden auch den Unterschied zu zeigen zwischen der Pflanzen- und Bakterien anabole Wege markiert. In Bakterien wird das Enzym Tyrosin-Aminotransferase (tyrB) in den Anabolismus beider Aminosäuren beteiligt sind, wohingegen in Pflanzen, das Enzym in den Katabolismus von tyr und phe primär beteiligt ist und nicht in den Anabolismus dieser Aminosäuren beteiligt. (Abbildung 2). 4
Die Unterschiede zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien in Bezug auf die Struktur von Peptidoglycan (PG) im FPBP natürlich hervorgehoben. Die PG von Gram-negativen Bakterien ist von Interesse, hinsichtlich Pflanzenpathologie basiert auf der Tatsache, dass die meistenPflanzenpathogene sind Gram-negative. Eine aktuelle Übersicht über die Top-10-bakterielle Phyto-Erreger ergeben, dass alle Gram negativ sind. Die Bakterien wurden aus den Gattungen:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya und Pectobacterium 5 eines der chemischen Unterschiede , wenn die PG Stamm Gram - negative und Gram - positive Bakterien Vergleich ist der Unterschied zwischen dem Vernetzungs amino Säuren beider Typen. Der erste Schritt für die unterschiedlichen Quervernetzung von PG in der zytoplasmatischen Schritt des PG Anabolismus auftritt , und wird durch das Enzym UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (Mure) erleichtert , (3A). Mure katalysiert die Addition einer bestimmten Diaminverbindung an der dritten Position des Peptids Stamm. 6 in den meisten Gram - negativen Bakterien, die vorletzte lys Vorläufer meso -diaminopimelate (
In der Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Natürlich sind die Unterschiede zwischen offenen und geschlossenen Systemen für die Kultivierung von Bakterien und wie Nährstoffgehalt deutlich aufgrund von Umgebungsänderungen in beiden Systemen ändern werden diskutiert. Diese Ereignisse verknüpft sind regulatorische Änderungen ein "Herunterschalten" oder "hochschalten" ausgelöst durch Verhungern oder eine ausreichende Versorgung mit Aminosäuren oder Energie. Die "herunterschalten" Reaktion kann auftreten, wenn eine Bakterienkultur aus einer reichen und komplexen Medium zu einem chemisch definierten Medium mit einem einzigen Kohlenstoffquelle übertragen wird. Diese Änderung in der Umwelt führt zur schnellen Cessation von tRNA und rRNA-Synthese. Diese Einstellung führt zu dem Mangel an Ribosomen, Protein- und DNA-Synthese, obwohl die Biosynthese von Aminosäuren aufreguliert.
Im Anschluss an die "herunterschalten" Reaktion, werden die vorhandenen Ribosomen verwendet, um neue Enzyme zu produzieren, die die Aminosäuren nicht mehr verfügbar im Medium oder Umwelt zu synthetisieren. Nach einer gewissen Zeit werden rRNA Synthese und neue Ribosomen zusammengebaut und die Population von Bakterienzellen beginnt mit einer reduzierten Rate zu wachsen, obwohl. Der Verlauf der Ereignisse wird die "strengen Antwort" oder "strenge Kontrolle" bezeichnet und ist ein Beispiel für globale Zellregulation und kann zur Einstellung der Zelle Biosynthesemaschinerie als Mechanismus gedacht werden , um die Verfügbarkeit der erforderlichen Substrate und Energiebedarf zu kompensieren . 8 ist die stringent Reaktion ermöglicht somit Bakterien schnell Flüsse von Nährstoffen in der Umgebung zu reagieren und trägt und enhANCES die Fähigkeit von Bakterien in Umgebungen zu konkurrieren, die sich schnell in Bezug auf Nährstoff ändern und oder Substratverfügbarkeit. 8-9
Die stringenten Antwort hat eine integrale Rolle bei der Genexpression , wenn die Verfügbarkeit von Aminosäuren, Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphat und Fettsäuren begrenzt sind. 8,10-14 Diese stringenten Antwort durch zwei Nucleotide koordiniert ist, Guanosin tetraphosphat (ppGpp) und Guanosin Pentaphosphat (pppGpp) bezeichnet allgemein zusammen als alarmone (p) ppGpp. Wenn beispielsweise sind Aminosäuren begrenzt, die zu einem Engpass bei der Proteinsynthese-the alarmone führen kann, Guanosin 3,5- (bis) pyrophosphat (ppGpp) von Anabolismus von Guanosin 5-Triphosphat-3-diphosphat abgeleitet (pppGpp) ansammelt in der Zelle. Die Änderung in der (p) ppGpp-Ebene ist in der Expression von Genen beteiligt, die die Reaktion regulieren, das Fehlen von Substraten in die Umwelt zu überwinden, die in das Zellwachstum und developmen direkt beteiligt sindt. Zwei der Gene, die an diesem Prozess beteiligt sind, relA und spoT genannt. RelA ist eine Ribosomen-assoziierte (p) ppGpp-Synthetase, die in der Antwort auf die Anhäufung von unbeladenen tRNAs beteiligt ist, die das Ergebnis der Aminosäure-Begrenzung ist. SPoT Funktionen als bifunktionelles (p) ppGpp-Synthetase und Hydrolase. Die Synthetase - Aktivität von Flecks in der Antwort auf den Mangel an Kohlenstoff und Fettsäure Hunger beteiligt. 8 Die RelA / SPoT Homologe sind weit verbreitet in Pflanzen und Bakterien und sind als Rsh für R ela / S poT h omologs bezeichnet. 8.10 -12,16 eine kürzlich Manuskript zeigte , dass es eine spezifische Rsh Protein in der Synthese dieser Alarmone aus dem Bakterium Novosphingobium sp Rr 2-17 17 beteiligt ist.
Hier präsentieren wir vier biochemischen Wege zu den funktionellen Komplementierung Assays gebunden. Die Komplementierung Assays in diesem Manuskript skizziert bietet eine Allee zu explore Verwendung dieses in vivo - Test als Mittel zur Identifizierung und Charakterisierung oder Enzyme , die vorhergesagt werden unknown / putative Funktion haben (s) oder als Lehrmittel die Lehre der biochemischen Wege zu ergänzen.
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Protocol
HINWEIS: Die Autoren sind bereit, Bakterienstämme und rekombinante Plasmide bereitzustellen, um den Einbau von funktionellen Komplementierung Analyse zu Lehrzwecken für Personen zu erleichtern, die interessiert sind. Die Plasmide , die verwendet wurden funktionelle Komplementation Experimente zu erleichtern , sind in Tabelle 1 aufgeführt.
1. Konstruktion von Plasmiden für Funktionelle Komplementierung
- Klonierung von Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL) für Funktionelle Komplementierung.
- Amplify die DAPL offene Leserahmen (ORF) von der V. spinosum und cDNAs von A. thaliana und C. reinhardtii durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der 4 Desoxynukleotidtriphosphate und 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit PfxDNA-Polymerase.
HINWEIS: Die vollständige Beschreibung im Zusammenhang mit dem rekombinanten Klonen von drei DAPL Orthologe aus der Anlage A. thaliana (At -dapL), das Bakterium Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) und die Alge Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) , die zuvor veröffentlicht wurde. 2,18-20
HINWEIS: Die Primer für die Klonierung der DAPL Orthologe sind wie folgt:
Vs DAPL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
Vs DAPL R 5 'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3'
Bei DAPL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
Bei DAPL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr DAPL F-5 'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3'
Cr DAPL R -5' CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - Klonen der PCR-Fragmente in ter Plasmid pET30a , die die rekombinanten Plasmide zu erzeugen, pET30a :: Vs DAPL, pET30a :: Bei DAPL und pET30a :: Cr DAPL der Primer, Restriktionsenzyme und T4 - DNA - Ligase.
- 50 ng des Einsatzes und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4-DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C kurz, inkubiert. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 50 ug / ml Kanamycin ergänzt durch -1 für 24 h bei 37 ° C inkubiert. 18-20
- Um das Plasmid für die funktionelle Komplementation schaffen, verdauen pET30a :: Vs DAPL und pET30a :: Bei DAPL Plasmide mit den Restriktionsenzymen XbaI und SalI und XbaI und HindIII für den pET30a :: Cr DAPL. Ligieren der Einsätze in das Plasmid pBAD33 unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase , die die Plasmide pBAD33 :: Vs DAPL zu erzeugen; pBAD33 :: Bei DAPL und pBAD33 :: Cr DAPL.
- Inkubiere 50 ng des Einsatzes und 20 ngdes Vektors in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 34 ug / ml -1 Kanamycin um 37 ° C h für 24 inkubiert. 20
- Amplify die DAPL offene Leserahmen (ORF) von der V. spinosum und cDNAs von A. thaliana und C. reinhardtii durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der 4 Desoxynukleotidtriphosphate und 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit PfxDNA-Polymerase.
- Klonierung von Tyrosin - Aminotransferase (tyrB) von A. thaliana für Funktionelle Komplementierung.
HINWEIS: Die vollständigen Einzelheiten der Klonierung der cDNA von A. thaliana durch die Locus - Tags kommentierten At5g36160 zuvor beschrieben worden ist . 4- Amplify die cDNA durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, und 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Pfx DNA - Polymerase.
HINWEIS: Die Primer für die cl verwendetenantrieb des At5g36160 sind wie folgt:
An tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - Klonen Sie das Fragment in das Plasmid pET30a, die die rekombinanten Plasmide pET30a :: At5g36160 durch Verdauen des PCR-Fragment mit EcoR1 und Sal1 zu erzeugen; Ligieren in das Fragment in pET30a unter Verwendung von T4 DNA - Ligase , wie unten beschrieben. 4
- Um die funktionelle Komplementierung Plasmid erstellen, verdauen die pET30a :: At5g36160 mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII und Ligieren des Inserts in pBAD33 die gleichen Restriktionsenzymschnittstellen unter Verwendung des rekombinanten Plasmids pBAD33 :: At5g3160 unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zu erzeugen.
- Inkubiere 50 ng Insert und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Wandeln Sie die Ligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 34 ug / ml -1 chlo ergänztramphenicol von 37 ° C für 24 h inkubiert. 4
- Amplify die cDNA durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, und 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Pfx DNA - Polymerase.
- Klonierung von UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (murE) von V. spinosum für Funktionelle Komplementierung.
HINWEIS: Die Klonierung des ORF murE von V. spinosum wurde zuvor beschrieben. 18- Amplify das offene Leseraster durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Pfx DNA - Polymerase. Dann klonen in das Plasmid pET100D das Plasmid pET100D :: Vs murE herzustellen.
HINWEIS: Die Primer für die Klonierung des Vs murE verwendet sind wie folgt:
Vs Mure F 5 'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3'
VsMure R- 5 'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3' - Um das Plasmid für die funktionelle Komplementierung produzieren, verdauen die pET100D :: Vs murE
Mit den Restriktionsenzymen XbaI und Sal1 und Ligieren des Inserts in pBAD33 das rekombinante Plasmid pBAD33 :: Vs murE unter Verwendung von T4 DNA - Ligase zu erzeugen.- Inkubiere 50 ng Insert und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer, zusammen mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 34 ug / ml Chloramphenicol supplementiert -1 um 37 ° C für 24 h inkubiert. 8
- Amplify das offene Leseraster durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Pfx DNA - Polymerase. Dann klonen in das Plasmid pET100D das Plasmid pET100D :: Vs murE herzustellen.
- Klonierung von relA / s Topfes (rsh) von Novosphingobium sp für Funktionelle Komplementierung.
. HINWEIS: Die Klonierung des rsh aus Novosphingobium sp wurde zuvor beschrieben 17.- Amplify die rsh ORF zusätzlich zu 599 Nukleotiden upstRieses der Initiationsstartstelle und 46 Nukleotide stromabwärts an der Terminierungsstelle durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Taq DNA - Polymerase. Dann klonen in das Plasmid pCR2.1 pCR2.1 :: Nsp rsh zu erzeugen.
- Inkubiere 1 ul amplifizierte PCR-Fragment, 1 ul pCR2.1 Vektor, 1 ul Salzlösung und 1 & mgr; l Wasser. Inkubieren bei 25 ° C für 5 min und 2 & mgr; l der Ligation in E. coli - Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 50 ug ergänzt / ml -1 Kanamycin um 37 Inkubation ° C für 24 Std.
HINWEIS: Die Primer für die Klonierung des rsh verwendet werden, sind wie folgt:
rsh F 5 'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3'
rsh R- 5 'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - Für funktionelle Komplementierung, verdauen das Plasmid pCR2.1 :: Nsp mit EcoR1 rsh und abzubinden den Einsatz in die breiten Wirtsbereich pRK290 , um das rekombinante Plasmid pRK290 :: Nsp RSH unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase erzeugen.
- Inkubiere 50 ng Insert und 20 ng Vektor in 1x Ligasepuffer und 1 Einheit T4 DNA-Ligase über Nacht bei 17 ° C. Transligation in E. coli DH5a Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 10 ug / ml -1 Tetracyclin ergänzt durch 37 Inkubation ° C für 24 Std. 17
- Inkubiere 1 ul amplifizierte PCR-Fragment, 1 ul pCR2.1 Vektor, 1 ul Salzlösung und 1 & mgr; l Wasser. Inkubieren bei 25 ° C für 5 min und 2 & mgr; l der Ligation in E. coli - Zellen und Bildschirm für die Kolonien auf LB - Platten mit 50 ug ergänzt / ml -1 Kanamycin um 37 Inkubation ° C für 24 Std.
- Amplify die rsh ORF zusätzlich zu 599 Nukleotiden upstRieses der Initiationsstartstelle und 46 Nukleotide stromabwärts an der Terminierungsstelle durch PCR. Verwenden 1 Zyklus bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 2 min. Enthalten 12 pMol von jedem Primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM jedes der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 0,5 ng der Template - DNA und 1 Einheit Taq DNA - Polymerase. Dann klonen in das Plasmid pCR2.1 pCR2.1 :: Nsp rsh zu erzeugen.
2. Herstellung von Elektro-kompetenten Bakterienzellen zur Erleichterung der Umgestaltung
HINWEIS: Die Herstellung von elektrokompetenten Zellen basiert auf dem Protokoll 26 für 1,0 l der Kultur , die auf ein kleineres Volumen verkleinert werden kann (dh 250 ml). Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll kann be verwendet , um alle Stämme zu machen kompetent , die in diesem Manuskript beschrieben FCA zu erleichtern. 22
- Impfen 50 ml flüssiges Medium mit einer Einzelkolonie in einen Kolben und wachsen über Nacht, so dass Sie sicher , dass das Erbgut der Mutante zu überprüfen , bevor Sie diesen Schritt (Tabelle 2) beginnt.
- Am zweiten Tag, 1,0 l des geeigneten Mediums (LB für E. coli - Mutanten und PD für Novosphingobium sp) mit dem 50 ml der Übernachtkultur beimpft und bei 30 ° bis zu einer OD 600 bis 0,4-0,6 (log - Phase) wachsen C.
- Ernte Zellen bei 4 ° C bei 5.000 xg für 15 min zentrifugiert, dekantiert den Überstand und das Pellet in 500 ml sterilem eiskaltem reinem H 2 O.
- Zentrifuge die Zellen bei 5.000 × g für 20 min bei 4 ° C, dekantiert den Überstand und das Pellet in 250 ml sterilem eiskaltem 10% Glycerin.
- Zentrifugieren der Zellen bei 5000 × g für 20 min bei 4 ° C, dekantiert die Supernatant und Resuspension des Pellets in 2,0 ml 10% Glycerin.
- Aliquot der Zellen durch 50 ul in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und sofort gefrieren durch die Rohre in einem Trockeneis-Ethanol-Bad platzieren. Bewahren Sie die kompetenten Zellen bei -80 ° C für die Elektroporation.
3. Die Elektroporation von Bakterienzellen mit Komplementierung Plasmiden
- Zur Elektroporation, fügen 1,0 ul (10-50 ng) des rekombinanten Plasmids zu einem Aliquot (50 ul) von kompetenten Zellen und für 5 min auf Eis stellen.
- Übertragen Sie die Mischung über Pipettieren auf eine Elektroporationsküvette und stellen Sie die Elektroporationseinrichtung auf die folgende Einstellung: 25 & mgr; F Kapazität, 2,5 kV und 200 Ohm Widerstand und einen Impuls liefern.
- 1,0 ml Wiederherstellungsmedien (LB) an die Elektroporationsküvette und Übertragung einer Pipette in ein 15 ml konischen Röhrchen mit. Erholen Sie sich bei leichter Rotation für 60 min in einem Schüttelinkubator.
- Platte 100 ul der Kultur aus dem Recosehr Schritt auf den Agarplatten für Trans durch Pipettieren auszuwählen und Verbreitung eines sterilen Spreizer.
HINWEIS: Stellen Sie sicher , Tabelle 1 und Tabelle 2 zu überprüfen , bevor Sie diesen Schritt beginnen die Antibiotika und Genotypen zu überprüfen , die richtigen Agarplatten zu machen.
4. Transformation von AOH1 Funktionelle Komplementierung zu erleichtern Mit L, L-Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL)
- Für die Komplementierung Analyse, Transformation AOH1 mit dem leeren Vektor (pBAD33) und mit den DAPL Expressionsvektoren in getrennten Transformationsereignisse die Elektroporation Protokoll in Abschnitt 3.0 skizziert werden.
- Wählen Transformanten durch Ausplattieren auf LB - Agar - Medium , ergänzt mit 50 & mgr; g / ml -1 DAP und 34 & mgr; g / ml -1 Chloramphenicol und 50 ug / ml Kanamycin -1.
- Test für funktionelle Komplementierung durch Replika-Plattierung Kolonien auf LB mir Ausstreichendium mit 0,2% (w / v) Arabinose mit und ohne 50 & mgr; g / ml -1 DAP und 34 & mgr; g / ml Kanamycin -1.
- Die Platten bei 30 ° C für 24 Stunden und beobachten Ergebnisse.
HINWEIS: Das Ergebnis sollte zeigen, dass die Mutante nur in der Lage ist, nur auf DAP freie Medien zu wachsen, wenn das DAPL Gen in der Mutante Hintergrund exprimiert wird, wenn nur die Kontrolle an den Vektor verglichen.
5. Transformation von TKL-11 funktionelle Komplementation Verwendung UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-Glutamyl-2,6- meso -diaminopimelate Ligase (murE) zu erleichtern
- Wandeln Sie die Mutante mit dem leeren Vektor (pBAD33) und mit dem Mure exprimierenden Vektor (pBAD33 :: VsmurE) unter Verwendung des Protokolls in Abschnitt 3.0 beschrieben.
- Plate und wählen Sie Transformanten auf LB - Agar - Medium mit 50 ug / ml -1 Thymin und 34 ug / ml -1 Chloramphenicol und Inkubation der Platten bei 30 ° C für 24 Stunden ergänzt.
- Für die Komplementierung Test durch Ausstreichen oder Plattieren Kolonien sowohl von der Kontrolle und die experimentellen Transformationen auf zwei LB - Medium plus 0,2% (w / v) Arabinose und 50 & mgr; g / ml -1 Thymin.
- Inkubieren einer Platte bei 30 ° C und die andere bei 42 ° C für 24 h, um visuell das Wachstum Phänotyp beurteilen.
HINWEIS: Die Ergebnisse sollten zeigen, dass die Mutante der Lage ist, nur bei 42 ° C zu wachsen, wenn die murE Gen in der Mutante Hintergrund exprimiert wird, verglichen mit dem Vektor nur die Kontrolle.
6. Transformation von DL39 Funktionelle Komplementierung zu erleichtern Mit Tyrosinaminotransferase (tyrB)
- Verwandeln DL39 mit entweder pBAD33 oder pBAD33 :: At5g36160, und wählen Sie Trans auf LB - Agar - Platten mit 50 ug / ml -1 Tyrosin ergänzt, 50 ug / ml -1 Phenylalanin und 34 ug / ml -1 Chloramphenicol unter Verwendung des Protokolls im Abschnitt 3.0.
- Replik-Platte Kolonien auf Minimal (M9) Medien mit 50 ug / ml -1 Phenylalanin und 50 ug / ml -1 Tyrosin, 50 ug / ml -1 Aspartat, 50 ug / ml -1 Leucin, 50 ug / ml -1 Valin, 50 & mgr; g / ml -1 Isoleucin, 10 ug / ml Uracil -1 0,5% (w / v) Glycerol, 0,2% (w / v) Arabinose. Auch Replik-Platte Kolonien auf Platten fehlen Phenylalanin und Tyrosin durch die gleiche Kolonie beider Platten Ausstreichen.
- Inkubiere Platten bei 30 ° C für 48 Stunden Wachstum Phänotyp zu beobachten.
Hinweis: Das Ergebnis sollte zeigen, dass die Mutante nur in der Lage ist, an Phenylalanin und Tyrosin freien Medien zu wachsen, wenn nur das tyrB-Gen in der Mutante Hintergrund, wenn zu dem Vektor verglichen ausgedrückt wird nur die Kontrolle.
7. Transformation von Hx699 Funktionelle Komplementierung des Hypomucoid Phänotyps von Novosphingobium sp zu erleichtern. Der Stamm Hx699
HINWEIS: Das Ergebnis sollte zeigen, dass die Hypo-schleimige Phänotyp ergänzt wird, wenn rsh in dem mutierten Hintergrund exprimiert wird, wenn im Vergleich zu dem Vektor nur die Kontrolle.
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Representative Results
Die Bakterienstämme, die in den verschiedenen funktionellen Komplementierung Analysen verwendet werden , sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Funktionelle Komplementierung Analyse: L, L-Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL)
Die E. coli - Doppelmutante AOH1 (Δ dapD :: kan2, dapE6) birgt eine Mutation in dem Gen dapE und eine vollständige Löschung des dapD - Gens (Abbildung 1). Als solches ist die Mutante nicht in der Lage zu wachsen, sofern nicht DAP vorgesehen ist. Aufgrund dieser Mutationen wird AOH1 auxotrophen angesehen. AOH1 für funktionelle Komplementation Analyse von L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL) Orthologe als DAPL katalysiert die Synthese von L geeignet ist, L-Diaminopimelat direkt von THDP PG und lys - Synthese (Abbildung zu erleichtern 1).
AOH1 Mutante exprimierenden DapLs der Lage sind , auf L zu wachsen, L-DAP-freien Medien zeigen , dass die rekombinanten Enzyme sind in der Lage THDP auf L umzuwandeln, L-DAP das dapD und dapE enzymatische Schritte in den DAP / lys Stoffwechselweg Umgehung (Abbildung 5).
Funktionelle Komplementation Analyse: UDP - N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (murE)
meso -diaminopimelate (m -dap) ist die Vernetzungs Aminosäure in der PG von Gram-negativen Bakterien. Das Enzym UDP- N -acetylmuramoylalanyl- D Glutamyl-2,6- Meso -diaminopimelate Ligase (Mure) erleichtert die Zugabe von m -dap in diesem Prozess (3A - B). Die E. coli - Mutante TKL-11 beherbergt eine mutation im murE Gen , das in der Fähigkeit der Mutante bei 42 wachsen ergibt ° C aufgrund der Tatsache, dass das mutierte Enzym nicht in der Lage ist, diese Temperatur zu falten richtig an.
Die Ergebnisse werden zeigen, dass es durch das Wachstum bei der permissiven Temperatur von 30 ° C sowohl für die Steuerung und das Experiment. Jedoch nur die Zellen Mure (Versuch) exprimieren, werden auf der nicht-permissiven Temperatur von 42 wachsen können, ° C (Abbildung 6).
Funktionelle Komplementierung Analyse: Tyrosin-Aminotransferase (tyrB)
Arabidopsis thaliana eine Tyrosin - Aminotransferase kodiert , das in der Lage ist , Tyrosin zu ineinander umwandeln und 4-Hydroxyphenylpyruvat und Phenylalanin und Phenylpyruvat vom At5g36160 kommentierten (Abbildung 2). 4 Die E. coli - Mutante (DL39) eine Mutation in dem tyrB - Gen trägt , das für Phenylalanin und Tyrosin auxotroph macht. 24-26 Es sollte beachtet werden , dass die Mutante für die Aminosäuren Tyrosin, Phenylalanin, Aspartat, Leucin, Isoleucin und Valin, sowie auxotroph ist durch andere Mutationen. Der Stamm ist geeignet , um die Funktion von tyrB Orthologe seit dem tyrB Enzym ortholog von E. zu beurteilen coli ist in der Synthese von Tyrosin und Phenylalanin direkt beteiligten Proteinsynthese zu erleichtern.
Das Ergebnis sollte zeigen , dass während der DL39 Mutante der Lage ist , auf M9 wachsen nur , wenn Tyrosin und Phenylalanin werden zur Verfügung gestellt. Jedoch ist der Stamm Exprimieren des A. thaliana (At5g36160) Lage , auf M9 - Medium demonstriert fehlt Tyrosin und Phenylalanin zu wachsen , dass das Enzym in der Lage Tyrosin von 4-Hydroxyphenylpyruvat zu synthetisieren ist, und Phenylalanin aus Phenylpyruvat t (Fild 7). 4
Funktionelle Komplementierung Analyse: Rsh (RelA und S poT Homolog)
RSH - Protein aus Novosphingobium sp. (Rr2-17) enthält sowohl die N-terminalen Phosphorhydrolase und die (p) ppGpp - Synthase - Domänen und hat somit die vorgeschlagene bifunktionellen Rolle wie STELLE E. coli. Dies wurde unter Verwendung von Komplementation Analyse eines E. bestätigte coli - Doppelmutante, CF1693 die Mutation in relA und Stelle unter Verwendung des rsh - Gens aus Novosphingobium sp beherbergt. Der Phänotyp der Rr2-17 rsh Mutante, genannt Hx699 (rsh :: EZ-Tn5, Kan R), führt zu einer hypo mucoid und dies ist aufgrund eines nicht-funktionellen rsh. Die Hypo-schleimige Phänotyp Hx699 wurde bewertet , indem Komplementierung durch die native rsh Nsp Gen erleichtert das geklont wurdein den breiten Wirtsbereich Vektor pRK290. Zeigen weniger lösliche Polysaccharid aus , dass durch die trans ergänzt Hx699 (pRK290 :: rsh NSP) und Rr2-17 enthält pRK290 oder pRK290 :: rsh Nsp (Abbildung 8) hergestellt Im Einklang mit der Hypo-schleimige Phänotyp, der Hx699 leeren Vektor pRK290 Beherbergung .
Abb . 1: Die Varianten der Lysin anabole Wege aus Aspartat , die durch den Zwischen Diaminopimelinat (DAP) gehen Die Wege werden durch (A) kommentierte die Acyl- Wege, (B) die Diaminopimelatdehydrogenase (Ddh) -Weg und (C) die L , L-Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL) Weg. Die Abkürzung Definitionen für die Enzyme sind die folgenden: Aspartat-Kinase (LysC), Aspartatsemialdehyd - Dehydrogenase (asd), Tetrahydrodipicolinat Synthase (DAPA), Tetrahydrodipicolinat Reduktase (dapB) Tetrahydrodipicolinat Acylase (DAPD), N - acyl-2-amino-6-ketopimelate Aminotransferase (DAPC), N - acyl-L, L-2, 6-Diaminopimelat - Deacylase (DAPE), Diaminopimelat - Epimerase (dapF), meso -diaminopimelate Dehydrogenase (Ddh), meso -diaminopimelate Decarboxylase (LysA), L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL), UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl d-Glutamat. meso -2,6-Diaminopimelinat - Ligase (Mure) und Lysyl-tRNA - Synthetase (LysU) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: anabole Wege für die Aminosäuren tyroSinus- und Phenylalanin. (A) Die bakteriellen (E. coli) Weg durch den Zwischen Chorismat und (B) die Pflanze Weg durch den Zwischen Arogenat gebildet. Die Abkürzungen für die Enzyme sind wie folgt: Chorismatmutase / Prephenatdehydratase (PheA), Chorismatmutase, Prephenatdehydrogenase- (TyrA) und Tyrosin-Aminotransferase (tyrB). Das Diagramm wurde angenommen und modifizierte Form Prabhu und Hudson, 2010. 4 Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die zytoplasmatische Schritt der Peptidoglycansynthese (A) Schematische Darstellung des zytoplasmatischen Schritt der Peptidoglycansynthese.. Die Abkürzungen der Enzyme sind wie folgt: UDP- N Acetylglucosamin Enolpyruvyl Transferase (MurA), UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP- N -acetylmuramate-L-alanin - Ligase (Murc), UDP- N - acetyl-D-muramoylalanine -Glutamat - Ligase (Murd), UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat 2,6- meso -diaminopimelate Ligase (Mure), UDP- N -acetylmuramoyl-Tripeptid-D-alanyl-D-alanin - Ligase (murf ), D-Alanin-D-alanin-Ligase (DDL). (B) Schematische Darstellung einer monomeren Einheit von Peptidoglycan zeigt das Disaccharid N Acetylglucosamin (GlcNAc) und N -acetylmuramic (MurNAc) über eine β-1,4 - glycosidische Bindung verknüpft. Die Aminosäure an Position 3 des Stiels Peptid beteiligt ist in Vernetzungs bezeichnen mit meso -diaminopimelate (m -dap) in den meisten Gram-negativen Bakterien und lys in den meisten Gram-positive Bakterien._blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Schematisches Modell Darstellung der strengen Antwort in Bakterien Exposition gegenüber einer nährstoffarmen Umgebung induziert Rsh (RelA oder Spot) die alarmone zu anabolize (p) ppGpp (Ppgpp) durch Zugabe einer Phosphatgruppe an GTP (Guanosintriphosphats). Belichtung mit einer nährstoffreichen Umgebung induziert die Expression von Rsh zu hydrolysieren (p) ppGpp die ein Wachstumshemmer ist. Das Diagramm wurde von Raskin et al angenommen und geändert werden . 2007 27 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Funktionelle Komplementierung mit DAPL Funktionelle Komplementierung der AOH1 E. coli - Mutante mit L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL) -Gen aus den Bakterien V. spinosum (Vs DAPL), die A. Pflanze thaliana (At DAPL) und der Alge C. reinhardtii (Cr DAPL). Die Mutante , die die Plasmide beherbergen, pBAD33, pBAD33 :: Vs DAPL, pBAD33 :: Bei DAPL und pBAD33 :: Cr DAPL wurden Replika-plattiert auf LB - Agarplatten mit 0,2% ergänzt (w / v) Arabinose mit oder ohne 50 & mgr; g / ml L, L - Diaminopimelinat und wurden bei 30 gewachsen ° C für 24 Std. Das Diagramm wurde angenommen und geändert von Nachar et al., 2012. 18 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6:. Funktionelle Komplementierung mit Mure Funktionelle Komplementierung der TKL-11 E. coli - Mutante mit dem UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (murE) -Gen aus V. spinosum. Die Mutante , die die Plasmide BAD33 oder pBAD33 :: VsmurE beherbergen , wurden in LB - Medium bis zu einer OD 600 von 0,1 und wurden seriell verdünnt bis 10 -1, 10 -2 gezüchtet und 10 -3 0,85% unter Verwendung von (w / v) Kochsalzlösung . 5 & mgr; l verschiedener Verdünnungen wurden Replika-plattiert auf LB-Medium, ergänzt mit 0,2% (w / v) Arabinose und wurden bei 30 ° C und 42 beurteilt gewachsen ° C für 24 Stunden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Funktionelle Komplementierung der DL39 E. coli mit einem Gen , Tyrosin - Aminotransferase durch den Locus tag At5g36160 aus A. kommentierten thaliana. Die mutierte Plasmide pBAD33 oder pBAD33 :: At5g36160 wurden auf LB - Agar - Platten , ergänzt mit 50 ug / ml -1 Tyrosin, 50 ug / ml -1 Phenylalanin und 34 ug / ml -1 Chloramphenicol beherbergen. Der Stamm wurde in LB - Brühe bis zu einer OD OD 600 von 1,0 wachsen gelassen und wurden bis 10 -1, 10 -2 seriell verdünnt, und 10 -3 0,85% unter Verwendung von (w / v) Kochsalzlösung. 5 & mgr; l der verschiedenen Verdünnungen wurden dann replica-plattiert auf M9 - Agar - Platten , ergänzt mit 50 & mgr; g / ml -1 phenylAlanin und 50 & mgr; g / ml -1 Tyrosin, 0,5% (w / v) Glycerol, 0,2% (w / v) Arabinose, 50 & mgr; g / ml -1 Aspartat, 50 & mgr; g / ml -1 Leucin, 50 ug / ml -1 Valin, 50 & mgr; g / ml -1 Isoleucin, 10 & mgr; g / ml -1 Uracil und auch auf Platten fehlt Phenylalanin und Tyrosin und wurden bei 30 ° C für 48 Stunden inkubiert. Das Diagramm wurde angenommen und modifizierte Form Prabhu und Hudson, 2010. 4 Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Funktionelle Komplementierung des hypomucoid Phänotyp der Novosphingobium sp. Mutantenstamm Hx699. Ter Wildtyp - Stamm Novosphingobium sp. (Rr2-17) und der mutierte Stamm Hx699 wurden mit pRK290 oder pRK290 transformiert :: rsh Nsp. Die Stämme wurden in einem "X" ausgestrichen und wurden weiter bei 30 ° C auf PD - Agar gezüchtet mindestens 4 Tage , um die Phänotypen zu beobachten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Komplementierung Plasmide | Antibiotikaresistenzmarker | Zitat |
| pBAD33 | cm r | 21 |
| pBAD33 :: Am DAPL | cm r | 2 |
| pBAD33 :: Cr DAPL | cm r | 20 |
| pBAD33 :: Vs DAPL | Cmr | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | cm r | 4 |
| pBAD33 :: Vs murE | cm r | 18 |
| pRK290 | Tet r | 28 |
| pRK290 :: rsh Nsp | Tet r | 17 |
Tabelle 1: Funktionelle Komplementation Plasmid in dieser Studie verwendete Liste von Plasmiden für die funktionelle Komplementierung Analyse verwendet.. Cm R und Tet R bezeichnen Chloramphenicol und Tetracyclin - Resistenz sind.
| Der Stamm Name | Organismus | Genotyp | Phänotyps | Quelle |
| AOH1 | E coli | Δ dapD :: kan2, dapE6 | Auxotroph für Diaminopimelinat | Hudson Laboratory |
| TKL-11 * | E coli | thr-1, leuB6 (Am), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, TSX-95, glnV44 (AS), λ -, pyrF101, his-108, thyA6, argG66, ilvA634, thi-1, deoC1 | Wachstums sensitiven Phänotyp waren die Mutante bei 30 ° C wächst, aber nicht über einen 42 ° C | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | E coli | Lambertz, aspC13, FNR-25, RF-1 ilvE12, tyrB507 | Auxotroph für Aminosäuren; Tyrosin, Phenylalanin, Leucin, Isoleucin und Valin | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium sp. (Wildtyp) - | Hyper-mucoid | Savka Laboratory | |
| Hx699 | Novosphingobium sp. | rsh :: EZ-Tn5, Kan R | Hypo-schleimige | Savka Laboratory |
Tabelle 2:. Bacterial in dieser Studie verwendeten Stämme Liste der Bakterienstämme zusammen mit entsprechenden Genotypen und in dieser Studie verwendet Phänotypen. Bitte beachten Sie, dass Stämme (TKL-11 und DL39) mit dem Sternchen bezeichnet können direkt aus dem Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/) erhalten werden.
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Discussion
Viele der Kurse, die auf die Biotechnologie und Molekulare Biowissenschaften Lehrplan am Rochester Institute of Technology integral sind, haben eine Laborkomponente zusätzlich zur Vorlesung Teil des Kurses. Der Lehrplan für das akademische Jahr 2014-2015 enthält insgesamt 48 Kurse, von denen 29 eine Laborkomponente enthalten, die etwa 60% darstellen. Ein solcher Kurs ist Grundlagen der Pflanzenbiochemie und Pathologie (FPBP), einem gemischten Vorlesung / Praktikum und Bioseparations: Principles and Practices (BPP), einem Labor auf Basis Kurs.
Das Labor Komponente eines jeden Kurses ist auf die Vorlesungsmaterialien zu verstärken. Zum Beispiel sind biochemische Wege und Metabolismus in FPBP und BPP stark beansprucht. Einige der Themen sind Aminosäure-Stoffwechsel, Peptidoglycan-Biosynthese, pflanzlichen Sekundärstoffwechsels, bakterielle Reaktion auf Umwelt Nischen, unter anderem. Die Autoren haben integrierten Funktions COMPLEMsentation als Laborübungen in beiden Kursen das Verständnis der Stoffwechselwege zu verstärken, die in der Vorlesung und oder Pre-Labor-Präsentationen diskutiert werden. Vier Beispiele für funktionelle Komplementation experiment mit der Funktion von Genen in biochemischen Wege von lys, PG, tyr, phe und stringent Reaktion von Bakterien beteiligt zu analysieren, werden diskutiert.
Es gibt mehrere Gründe, warum die Autoren dieses experimentelle Modul in ihre Kurse integriert haben. Erstens, die Exposition gegen funktionelle Komplementierung Analysen ist ein ausgezeichnetes Werkzeug zu verstärken oder Themen vorstellen, die Genetik, Evolution, Genomik, Bioinformatik und Biochemie in Zusammenhang stehen. Zweitens ist das Experiment facile und kann in einem Kurs Laborumgebung durchgeführt werden. Alle Reagenzien, die verwendet werden, sicher sind und die Bakterien, die als Sicherheitsstufe 1 und sind nicht pathogen sind, verwendet werden, bezeichnet. Als solche sind die Autoren bereit Reagenzien zu machen, wie Plasmide und bacterial Stämme für jeden zugänglich, bei der Einbeziehung funktionelle Komplementierung als Teil ihrer Lehrerfahrung interessiert ist. Es sollte beachtet werden, dass zwei der Bakterienstämme (TKL-11 und DL39) direkt vom Coli Genetic Stock Center (CGSC) erhalten wurden (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Es ist wichtig zu beachten, dass es mehrere kritische Schritte zum funktionelle Komplementation Protokolls sind. Der erste Schritt ist, um sicherzustellen, dass die Mutante (n) sind in der Lage vor Beginn jeglicher Experimente kultiviert werden. Der Grund dafür ist , daß gemäß Tabelle 2, gibt es mehrere Genotypen mit jeder Mutante verbunden. Um die Mutante herzustellen kompetente Zellen vor dem Experiment, versuchen Sie das Wachstum der Mutante mit oder ohne die erforderlichen Chemikalien und oder Temperaturanforderungen in Bezug auf die PG murE Mutante wachsen. Dies ist auch eine Lehre Moment, weil es wird beweisen, dass die Mutante, bevor irgendwelche Versuche authentisch ist.
Essollte auch angemerkt, dass, obwohl dies ein ausgezeichnetes Werkzeug ist, die Funktion (en) von Genen zu testen, ist es nicht immer auf mehrere Faktoren arbeiten wie codon usage wo Gen (e) von Interesse kann nicht korrekt aufgrund der fehlenden übersetzt von die entsprechenden tRNAs in dem mutierten Organismus. dies kann jedoch durch Codon-Optimierung des offenen Leserahmens oder cDNA während der Klonierungsschritt umgangen werden, die normalerweise durch Synthetisieren des Gens von Interesse durch Ändern der Nucleotide übereinstimmen, die codon usage der Mutante (n) durchgeführt wird. Ein weiteres Problem ist, dass einige eukaryotische Proteine benötigen post-translationale Modifikationen für die Funktion. Posttranslationale Modifikation ist kein Merkmal von Bakterien und als solche könnte man nicht in der Lage sein, diese Technik zu verwenden, um die Funktion zu testen (n) von Genen unter Verwendung von bakteriellen Mutanten.
Die Bedeutung der Technik , die wir in den Kursen betonen ist , dass FCA eine hervorragende Möglichkeit ist Funktion von Genen in vivo zu testen. Charakterisierung Enzyme werden auf in - vitro - Studien meist auf Basis denen das Enzym gereinigt und traditionelle enzymatische Assays ist durchgeführt. 29 auch traditionelle enzymatische Assays groß sind , um die enzymatische Aktivität zu messen oder zu erfassen, kann man oft als "Kraft - Feed" das Enzym mit handelsüblichen Substrate , die nicht reine oder natürlich für das Enzym. 30 in vivo - System wie FCA angesichts der Tatsache eine authentische Beweis in Bezug auf die Funktion von Genen sieht vor, dass es unter physiologischen Bedingungen als appose in vitro , die gegeben ist in der Regel nicht unter physiologischen Bedingungen. 2 in Betrieb ist Mangel an Informationen , die Funktionen vieler Gene und die Tatsache , über die meisten Annotationen werden basierend auf der Vorhersage, 31 Beherrschung dieser Technik wird Experimente ermöglichen die Funktionen vieler Gene zu erhellen , die nebulous bleiben oder diejenigen , die derzeit erachtet werden in den verschiedenen putative Funktionen haben öffentlichen Datenbanken.
jove_content "> Eines der Probleme in Bezug auf die Technik, die oft erlebt wird, ist bei der Herstellung der kompetenten Zellen. Man sollte darauf achten, dass sich die Zellen richtig vorbereitet sind, um sicherzustellen, dass es genügend Zellen zu machen, dass die Zellen zusätzlich transformiert werden richtig mit Wasser und Glycerin zu verhindern Aufwölbung während der Elektroporation werden gewaschen. Man kann auch, indem sichergestellt wird des Phänotyps des mutierten cognizant sein sollte, dass die Zellen mit dem geeigneten chemischen oder bei der richtigen Temperatur sowohl zu erleichtern die anfängliche angebaut werden das Wachstum von die Mutante als auch für die funktionelle Komplementation Analyse.Sobald diese Technik beherrscht wird, können die Forscher funktionelle Komplementation Assays verwenden, um die Funktion von Genen, so lange zu bewerten, da es eine geeignete Mutation ist diese Analyse in einem Organismus zur Verfügung zu erleichtern. Bitte beachten Sie, dass das Protokoll in diesem Manuskript die Verwendung von Bakterien beschreibt. Jedoch können auch andere Organismen, wiePflanzen und Säugerzellen, unter anderem kann die Funktion von Genen zu beurteilen , verwendet werden. 32-33 Man müsste nur dafür sorgen , dass die richtigen Vektoren , welche die Transformation zusätzlich zu optimieren und oder Transfektion der Zellen verwendet werden , um das Experiment zu erleichtern .
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
AOH und MAS erkennt das College of Science und der Thomas H. Gosnell School of Life Sciences am Rochester Institute of Technology für die Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von der United States National Science Foundation (NSF) Auszeichnung AOH MCB-1120541 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
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