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Biology

कार्यात्मक complementation विश्लेषण (एफसीए): एक प्रयोगशाला व्यायाम डिजाइन और जैव रासायनिक रास्ते के शिक्षण के पूरक के लिए लागू

Published: June 24, 2016 doi: 10.3791/53850
Automatic Translation
1, 1, 1
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

Summary

एंजाइमी जैव रासायनिक रास्ते में शामिल गतिविधियों की मान्यता कार्यात्मक पूरक विश्लेषण (एफसीए) का उपयोग कर elucidated जा सकता है। इस पांडुलिपि में वर्णित अमीनो एसिड, बैक्टीरियल कड़े प्रतिक्रिया और बैक्टीरियल पेप्टीडॉग्लीकैन जैवसंश्लेषण के चयापचय में शामिल एंजाइमों के enzymatic गतिविधि का प्रदर्शन एफसीए परख है।

Abstract

कार्यात्मक complementation परख (एफसीए) एक Vivo परख है कि व्यापक रूप से जीन / एंजाइमों के समारोह / भूमिका स्पष्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक जैव रसायन, आनुवंशिकी और कई अन्य विषयों में बहुत आम है। तकनीक की एक व्यापक सिंहावलोकन एसिड होता है, पेप्टीडॉग्लीकैन और बैक्टीरियल कड़े प्रतिक्रिया इस पांडुलिपि में सूचना दी है एमिनो से संबंधित जैव रासायनिक रास्ते के शिक्षण के पूरक के लिए। मॉडल संयंत्र जीव Arabidopsis thaliana कि लाइसिन (एल, एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (dapL) और tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज (tyrB) tyrosine और फेनिलएलनिन के चयापचय में शामिल की चयापचय में शामिल कर रहे हैं से दो cDNAs डाला जाता है। इसके अलावा, बैक्टीरियल पेप्टीडॉग्लीकैन उपचय मार्ग पार करने में शामिल जीवाणु Verrucomicrobium spinosum से UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-glutamate- मेसो -2,6-diaminopimelate ligase (Mure) जीन के विश्लेषण के माध्यम से प्रकाश डाला हैपेप्टीडॉग्लीकैन की -linking। बैक्टीरियल कड़े प्रतिक्रिया भी RSH (आर इला / एस बर्तन ज omolog) bifunctional जीन जीवाणु Novosphingobium सपा में एक अति mucoid phenotype के लिए जिम्मेदार के विश्लेषण के माध्यम से सूचना दी है। एफसीए के चार उदाहरण प्रस्तुत कर रहे हैं। वीडियो उनमें से तीन पर ध्यान दिया जाएगा, अर्थात् लाइसिन, पेप्टीडॉग्लीकैन और कड़े प्रतिक्रिया।

Introduction

समारोह (एस) elucidating / एक जीन की भूमिका (ओं) के संदर्भ में कार्यात्मक पूरक एक विशेष मुताबिक़ या orthologous जीन की क्षमता जब मुताबिक़ जंगली प्रकार राज्य के लिए एक नमूदार phenotype के साथ एक विशेष उत्परिवर्ती बहाल करने के लिए के रूप में परिभाषित किया गया है या orthologous जीन उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में सीआईएस या ट्रांस में पेश किया है। इस तकनीक का व्यापक रूप से अलग और समारोह (एस) / कई जीनों की भूमिका (ओं) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एक विशिष्ट उदाहरण अलगाव और कैंडिडा सफेद से orotidine-5-फॉस्फेट decarboxylase की पहचान एस के ura3 उत्परिवर्ती का उपयोग कर रहा है cerevisiae और ई की pyrF उत्परिवर्ती कोलाई। 1 लेखकों जीन है कि अमीनो एसिड, पेप्टीडॉग्लीकैन और उनके शोध कार्यक्रमों में कड़े प्रतिक्रिया के चयापचय में शामिल कर रहे हैं और 'बी' में उनके शिक्षण कार्यक्रमों में इस तकनीक को शामिल किया है के समारोह को स्पष्ट करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया हैiotechnology और आण्विक बायोसाइंस (बीएमबी) Rochester प्रौद्योगिकी संस्थान (RIT) पर कार्यक्रम।

सिद्धांत और व्यवहार (बीपीपी) (हडसन / Savka), आरआईटी में बीएमबी कार्यक्रम में दो उच्च श्रेणी वैकल्पिक प्रयोगशाला आधारित पाठ्यक्रम: लेखकों संयंत्र जैव रसायन / पैथोलॉजी (FPBP) (हडसन) और Bioseparations के मूल सिद्धांतों सिखाना। चूंकि विषय है कि पाठ्यक्रम में चर्चा कर रहे हैं में से कुछ अपने अनुसंधान के हितों के साथ संबद्ध हैं, लेखकों तकनीक और प्रयोगात्मक उपकरण है कि इन दोनों प्रयोगशाला आधारित पाठ्यक्रमों में उनके संबंधित अनुसंधान कार्यक्रमों में इस्तेमाल कर रहे हैं के कई शामिल किया है। ऐसा ही एक उदाहरण एक प्रयोगशाला व्यायाम पौधों, पेप्टीडॉग्लीकैन और बैक्टीरिया से कठोर प्रतिक्रिया के चयापचय से एसिड चयापचय एमिनो से संबंधित व्याख्यान सामग्री को सुदृढ़ करने के रूप में कार्य पूरक है।

कि FPBB पाठ्यक्रम में चर्चा कर रहे हैं पौधों से अमीनो एसिड रास्ते में से तीन हैं कि लाइसिन (प्रकाश) की, tyrosine(Tyr) और फेनिलएलनिन (पीएचई)। लिस मार्ग सभी जानवरों को विशेष रूप से मनुष्य के लिए एक आवश्यक अमीनो एसिड के रूप में अमीनो एसिड के महत्व की वजह से पाठ्यक्रम में प्रकाश डाला है क्योंकि जानवरों के संश्लेषण के लिए नए सिरे से प्रकाश आनुवंशिक मशीनरी की कमी है। इसके अलावा, यह हाल ही में पता चला था कि पौधों प्रकाश संश्लेषण की कि बैक्टीरिया के उस से काफी अलग है के लिए एक मार्ग को रोजगार। इस खोज को आंशिक रूप से ई के कार्यात्मक पूरक द्वारा मदद की थी कोलाई diaminopimelate (डीएपी) एक जीन है कि मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana से एंजाइम एल, एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (DapL) encodes का उपयोग कर म्यूटेंट। 2 मध्यवर्ती diaminopimelate के माध्यम से प्रकाश के संश्लेषण के लिए संस्करण रास्ते चित्र 1 में दिखाया गया है। इसके अलावा , प्रकाश संश्लेषण की एमिनो एसिड की aspartate निकाली गई जो परिवार अत्यधिक नियंत्रित किया जाता है के माध्यम से की सुविधा। 3 प्रोटीन SYNT में उनके महत्व के अलावाhesis, Tyr और पीएचई के लिए रास्ते phenylpropanoid यौगिकों के उपचय के लिए अग्रदूत यौगिकों के रूप में सेवा करने में उनके महत्व को देखते हुए डाला जाता है जैसे संयंत्र रक्षा यौगिकों के संश्लेषण शामिल:। alkaloids, lignins, flavonoids, isoflavonoids, दूसरों के बीच hydroxycinnamic एसिड 4 tyr और पीएचई रास्ते भी संयंत्र और बैक्टीरियल उपचय रास्ते के बीच अंतर दिखाने के लिए डाला जाता है। बैक्टीरिया में, एंजाइम tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज (TyrB), दोनों अमीनो एसिड के उपचय में शामिल है, जबकि पौधों में, एंजाइम मुख्य रूप से tyr और पीएचई के अपचय में शामिल है और इन एमिनो एसिड की उपचय में शामिल नहीं किया जाता है। (चित्रा 2)। 4

ग्राम पॉजिटिव और ग्राम पेप्टीडॉग्लीकैन (पीजी) की संरचना के बारे में नकारात्मक बैक्टीरिया के बीच मतभेद FPBP पाठ्यक्रम में डाला जाता है। ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के पीजी तथ्य के आधार पर प्लांट पैथोलॉजी के बारे में ब्याज की है कि सबसे अधिकसंयंत्र रोगजनकों ग्राम नकारात्मक हैं। शीर्ष 10 बैक्टीरियल पादप रोगजनकों के बारे में हाल ही में एक समीक्षा से पता चला है कि सभी ग्राम नकारात्मक हैं। बैक्टीरिया पीढ़ी से थे। स्यूडोमोनास, Ralstonia, एग्रोबैक्टीरियम, Xanthomonas, अर्विनिआ, Xylella, Dickeya और Pectobacterium रासायनिक मतभेद के 5 से एक है जब ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की पीजी स्टेम की तुलना पार से जोड़ने एमिनो के बीच का अंतर है दोनों प्रकार का एसिड। पीजी की है कि अलग अलग पार से जोड़ने के लिए प्रारंभिक कदम पीजी उपचय के cytoplasmic कदम में होता है और एंजाइम UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-glutamate- मेसो -2,6-diaminopimelate ligase से मदद की है (Mure) (चित्रा 3 ए)। Mure। पेप्टाइड स्टेम के तीसरे नंबर 6 पर एक विशेष यौगिक Diamine सबसे ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के अलावा उत्प्रेरित, अंत से पहले प्रकाश अग्रदूत, मेसो -diaminopimelate ( (चित्रा 3 बी) में वही भूमिका में कार्य करता है। 7 इस तथ्य के कारण है कि दोनों मीटर -DAP और लिस दो अमाइन अधिकारी समूहों और पेप्टाइड स्टेम पार से जोड़ने के लिए दो पेप्टाइड बांड बनाने में सक्षम हैं।

Bioseparations में: सिद्धांत और व्यवहार (बीपीपी) बेशक, पर्यावरण परिवर्तन के कारण बैक्टीरिया की खेती और कैसे पोषक तत्वों का स्तर दोनों प्रणालियों में काफी बदल जाएगा के लिए खुले और बंद प्रणालियों के बीच मतभेदों को चर्चा कर रहे हैं। इन घटनाओं विनियामक परिवर्तन नामक एक "नीचे बदलाव" या "ऊपर पाली" से जुड़े होते हैं भुखमरी या अमीनो एसिड या ऊर्जा की पर्याप्त आपूर्ति से शुरू हो गया। "नीचे शिफ्ट" प्रतिक्रिया हो सकता है जब एक जीवाणु संस्कृति एक भी कार्बन स्रोत के साथ एक रासायनिक परिभाषित मध्यम करने के लिए एक समृद्ध और जटिल मध्यम से स्थानांतरित कर रहा है। वातावरण में यह परिवर्तन तेजी से cessa की ओर जाता हैtRNA और rRNA संश्लेषण की tion। राइबोसोम, प्रोटीन और डीएनए संश्लेषण की कमी भले ही अमीनो एसिड के biosynthesis upregulated रहे हैं में इस समापन का परिणाम है।

"नीचे शिफ्ट" प्रतिक्रिया के बाद, मौजूदा राइबोसोम अमीनो एसिड नहीं रह मध्यम या वातावरण में उपलब्ध के संश्लेषण के लिए नए एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है। समय की अवधि के बाद, rRNA संश्लेषण और नए राइबोसोम इकट्ठा कर रहे हैं और बैक्टीरियल कोशिकाओं की आबादी एक कम दर पर हालांकि विकसित करने के लिए शुरू होता है। घटनाओं के पाठ्यक्रम "कड़े प्रतिक्रिया" या "कड़े नियंत्रण" करार दिया और वैश्विक सेलुलर विनियमन का एक उदाहरण है और आवश्यक substrates और ऊर्जा जरूरतों की उपलब्धता के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए सेल के biosynthetic मशीनरी को एडजस्ट करने के लिए एक तंत्र के रूप में सोचा जा सकता है । 8 कड़े प्रतिक्रिया इस प्रकार के माहौल में पोषक तत्वों की अपशिष्टों के लिए तेजी से प्रतिक्रिया करने में सक्षम बनाता है और बैक्टीरिया योगदान देता है और ENHवातावरण में प्रतिस्पर्धा करने के लिए है कि तेजी से पोषक तत्व और या सब्सट्रेट उपलब्धता के संबंध के साथ बदल सकते हैं बैक्टीरिया की क्षमता ances। 8-9

कड़े प्रतिक्रिया जीन अभिव्यक्ति में एक अभिन्न भूमिका जब अमीनो एसिड, कार्बन, नाइट्रोजन, फॉस्फेट, और फैटी एसिड की उपलब्धता सीमित कर रहे हैं। 8,10-14 इस कड़े प्रतिक्रिया दो न्यूक्लियोटाइड, guanosine tetraphosphate (ppGpp) और guanosine द्वारा समन्वित है pentaphosphate (pppGpp) आमतौर पर alarmone (पी) ppGpp रूप में एक साथ भेजा। उदाहरण के लिए, जब अमीनो एसिड सीमित जो कर रहे हैं प्रोटीन संश्लेषण-alarmone में एक अड़चन पैदा कर सकते हैं, guanosine 3,5- (बीआईएस) पायरोफ़ॉस्फ़ेट (ppGpp), guanosine 3-diphosphate 5-triphosphate की उपचय से निकाली गई (pppGpp) जम सेल में। (पी) ppGpp स्तर में परिवर्तन जीन है कि प्रतिक्रिया को विनियमित वातावरण में substrates कि सीधे सेल के विकास और शहरी में शामिल कर रहे हैं की कमी को दूर करने के लिए की अभिव्यक्ति में शामिल हैटी। जीन है कि इस प्रक्रिया में शामिल कर रहे हैं के दो असली और स्पॉट कहा जाता है। असली एक राइबोसोम जुड़े (पी) ppGpp synthetase कि uncharged tRNAs के संचय एमिनो एसिड सीमा का परिणाम है कि करने के लिए प्रतिक्रिया में शामिल किया जाता है। एक bifunctional (पी) ppGpp synthetase और hydrolase के रूप में स्पॉट कार्य करता है। स्पॉट की synthetase गतिविधि कार्बन और फैटी एसिड भुखमरी की कमी के जवाब में शामिल है। 8 असली / स्पॉट homologs पौधों और बैक्टीरिया में बड़े पैमाने पर कर रहे हैं और आर इला / एस बर्तन ज omologs के लिए Rsh के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। 8,10 -12,16 हाल ही में एक पांडुलिपि से पता चला है एक विशिष्ट Rsh प्रोटीन जीवाणु Novosphingobium सपा आर आर 2-17 से इन alarmones के संश्लेषण में शामिल नहीं है। 17

यहाँ हम कार्यात्मक पूरक assays के लिए सीमित चार जैव रासायनिक रास्ते प्रस्तुत करते हैं। पूरक इस पांडुलिपि में उल्लिखित assays expl करने के लिए एक अवसर प्रदान करता हैअयस्क की पहचान करने और या एंजाइमों कि अज्ञात / ख्यात समारोह (s) या शिक्षण उपकरण जैव रासायनिक रास्ते के शिक्षण के पूरक के रूप में राशि की भविष्यवाणी कर रहे निस्र्पक के एक साधन के रूप में इस विवो परख काम करते हैं।

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Protocol

नोट: लेखकों व्यक्तियों, जो रुचि रखते हैं के लिए शिक्षण उद्देश्यों के लिए कार्यात्मक पूरक विश्लेषण के समावेश की सुविधा के लिए जीवाणु उपभेदों और पुनः संयोजक plasmids प्रदान करने के लिए तैयार हैं। Plasmids कि कार्यात्मक पूरक प्रयोगों की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं।

कार्यात्मक complementation के लिए plasmids के निर्माण 1.

  1. कार्यात्मक complementation के लिए Diaminopimelate aminotransferase (dapL) की क्लोनिंग।
    1. वी से dapL खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) बढ़ाना spinosum और cDNAs ए से थालिअना और सी पीसीआर द्वारा reinhardtii। 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा प्रयोग करें। प्रत्येक प्राइमर के 12 pmoles शामिल करें, 1 मिमी MgSO 4, 0.5 मिमी 4 deoxynucleotide triphosphates में से प्रत्येक के लिए, और टेम्पलेट डीएनए के 0.5 एनजी और PFX की 1 यूनिटडीएनए पोलीमरेज़।
      नोट: संयंत्र ए से तीन dapL orthologs की पुनः संयोजक क्लोनिंग से संबंधित पूरा विवरण थालिअना, जीवाणु Verrucomicrobium spinosum (बनाम -dapL) और शैवाल Chlamydomonas reinhardtii (सीआर -dapL) पहले प्रकाशित किया गया है (-dapL पर)। 2,18-20
      ध्यान दें: dapL orthologs की क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों इस प्रकार हैं:
      DapL एफ बनाम 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG -3 '
      DapL आर बनाम 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC -3 '
      DapL एफ पर 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT -3 '
      पर dapL आर-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG -3 '
      सीआर dapL एफ 5'- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
      सीआर dapL आर -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA -3 '
    2. टी में पीसीआर टुकड़े क्लोनवह प्लाज्मिड pET30A पुनः संयोजक plasmids उत्पादन करने के लिए, pET30A :: बनाम dapL, pET30A :: dapL और pET30A :: सीआर dapL प्राइमरों, प्रतिबंध एंजाइमों और टी -4 डीएनए ligase का उपयोग करने पर।
      1. संक्षेप में, डालने के 50 एनजी और 1x ligase बफर में वेक्टर के 20 एनजी और रात में 17 डिग्री सेल्सियस पर टी -4 डीएनए ligase की 1 यूनिट सेते हैं। ई में बंधाव रूपांतरण कोलाई Dh5α कोशिकाओं और लेग प्लेटों पर कालोनियों के लिए स्क्रीन 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 केनामाइसिन के साथ पूरक। 18-20
    3. कार्यात्मक पूरक के लिए प्लाज्मिड बनाने के लिए, pET30A :: बनाम dapL और pET30A :: पचाने dapL plasmids के साथ प्रतिबंध pET30A :: सीआर dapL के लिए XbaI और साली और XbaI और HindIII एंजाइमों। टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर plasmids pBAD33 :: बनाम dapL उत्पादन करने के लिए प्लाज्मिड pBAD33 में सम्मिलित ligate; pBAD33 :: dapL और pBAD33 :: सीआर dapL पर।
      1. डालने के 50 एनजी और 20 एनजी सेते1x ligase बफर में वेक्टर और रात में 17 डिग्री सेल्सियस पर टी -4 डीएनए ligase की 1 यूनिट की। ई में बंधाव रूपांतरण कोलाई Dh5α कोशिकाओं और लेग प्लेटों पर कालोनियों के लिए स्क्रीन 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस incubating द्वारा 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 केनामाइसिन के साथ पूरक। 20
  2. ए से Tyrosine aminotransferase (tyrB) की क्लोनिंग कार्यात्मक complementation के लिए थालिअना।
    नोट: ए से सीडीएनए की क्लोनिंग के बारे में पूरी जानकारी थालिअना ठिकाना टैग At5g36160 पहले से वर्णित किया गया है द्वारा एनोटेट। 4
    1. पीसीआर द्वारा सीडीएनए बढ़ाना। 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा प्रयोग करें। प्रत्येक प्राइमर के 12 pmoles, शामिल है 1 मिमी MgSO 4, 0.5 चार deoxynucleotide triphosphates में से प्रत्येक के लिए, और टेम्पलेट डीएनए के 0.5 एनजी और PFX डीएनए पोलीमरेज़ की 1 यूनिट मिमी।
      नोट: सीएल के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरोंAt5g36160 की ONING इस प्रकार हैं:
      TyrB एफ पर 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT -3 '
      AttyrB आर 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT -3 '
    2. प्लाज्मिड pET30A EcoR1 और Sal1 साथ पीसीआर टुकड़ा पचाने के द्वारा पुनः संयोजक plasmids pET30A :: At5g36160 का उत्पादन करने में टुकड़ा क्लोन; pET30A में टुकड़ा नीचे के रूप में वर्णित टी -4 डीएनए ligase का उपयोग करने में ligate। 4
    3. कार्यात्मक पूरक प्लाज्मिड बनाने के लिए, pET30A :: At5g36160 पचाने प्रतिबंध के साथ एंजाइमों XbaI और HindIII, और एक ही प्रतिबंध एंजाइम साइटों का उपयोग कर पुनः संयोजक प्लाज्मिड pBAD33 :: At5g3160 टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर उत्पादन pBAD33 में डालने ligate।
      1. डालने के 50 एनजी और 1x ligase बफर में वेक्टर के 20 एनजी और रात में 17 डिग्री सेल्सियस पर टी -4 डीएनए ligase की 1 यूनिट सेते हैं। ई में बंधाव रूपांतरण कोलाई Dh5α कोशिकाओं और लेग प्लेटों पर कालोनियों के लिए स्क्रीन 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 Chlo के साथ पूरक24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस incubating द्वारा ramphenicol। 4
  3. की क्लोनिंग UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-glutamate- मेसो -2,6-diaminopimelate Ligase (Mure) वी से कार्यात्मक complementation के लिए spinosum।
    नोट: वी से Mure ओआरएफ की क्लोनिंग spinosum पहले से वर्णित किया गया है। 18
    1. पीसीआर द्वारा खुला पढ़ने फ्रेम बढ़ाना। 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा प्रयोग करें। प्रत्येक प्राइमर के 12 pmoles, शामिल है 1 मिमी MgSO 4, 0.5 मिमी चार deoxynucleotide triphosphates से प्रत्येक टेम्पलेट डीएनए के 0.5 एनजी और PFX डीएनए पोलीमरेज़ की 1 यूनिट। तब प्लाज्मिड pET100D में क्लोन प्लाज्मिड pET100D :: बनाम Mure उत्पादन करने के लिए।
      नोट: VS Mure की क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों इस प्रकार हैं:
      Vs Mure एफ 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
      vsMure आर 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC -3 '
    2. कार्यात्मक पूरक के लिए प्लाज्मिड उत्पादन करने के लिए pET100D पचाने :: बनाम Mure
      प्रतिबंध के साथ XbaI और Sal1 एंजाइम और pBAD33 में डालने ligate पुनः संयोजक प्लाज्मिड pBAD33 :: बनाम Mure टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर उत्पादन करने के लिए।
      1. डालने के 50 एनजी और 1x ligase बफर में वेक्टर के 20 एनजी, टी -4 डीएनए ligase की 1 यूनिट, रातोंरात 17 डिग्री सेल्सियस पर साथ-साथ सेते हैं। ई में बंधाव रूपांतरण कोलाई Dh5α कोशिकाओं और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस incubating द्वारा 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 chloramphenicol के साथ पूरक लेग प्लेटों पर कालोनियों के लिए स्क्रीन। 8
  4. कार्यात्मक complementation के लिए Novosphingobium सपा से असली / एस पॉट (RSH) की क्लोनिंग।
    नोट:। Novosphingobium सपा से RSH की क्लोनिंग पहले से वर्णित किया गया है 17।
    1. 599 न्यूक्लियोटाइड upst के अलावा RSH ओआरएफ बढ़ानादीक्षा शुरू साइट और 46 न्यूक्लियोटाइड पीसीआर द्वारा समापन स्थल पर नीचे की ओर से बीस जिस्ता। 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा प्रयोग करें। प्रत्येक प्राइमर के 12 pmoles, शामिल है 1 मिमी MgSO 4, 0.5 मिमी चार deoxynucleotide triphosphates से प्रत्येक टेम्पलेट डीएनए के 0.5 एनजी और Taq डीएनए पोलीमरेज़ की 1 यूनिट। तब pCR2.1 :: एनएसपी RSH उत्पादन करने के लिए प्लाज्मिड pCR2.1 में क्लोन।
      1. प्रवर्धित पीसीआर टुकड़ा के 1 μl, pCR2.1 वेक्टर के 1 μl, नमक समाधान के 1 μl और पानी की 1 μl सेते हैं। 5 मिनट और ई में बंधाव के 2 μl के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते कोलाई कोशिकाओं, और लेग प्लेटों पर कालोनियों के लिए स्क्रीन 37 incubating द्वारा 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 केनामाइसिन के साथ पूरक 24 घंटे के लिए सें।
        ध्यान दें: RSH की क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों इस प्रकार हैं:
        RSH एफ 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
        RSH आर 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. कार्यात्मक पूरक के लिए, प्लाज्मिड pCR2.1 :: एनएसपी EcoR1 साथ RSH पचाने और व्यापक मेजबान रेंज pRK290 में डालने ligate पुनः संयोजक प्लाज्मिड pRK290 :: एनएसपी उत्पादन करने के लिए टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर Rsh।
        1. डालने के 50 एनजी और 1x ligase बफर में वेक्टर के 20 एनजी और रात में 17 डिग्री सेल्सियस पर टी -4 डीएनए ligase की 1 यूनिट सेते हैं। ई में बंधाव रूपांतरण कोलाई Dh5α कोशिकाओं और लेग प्लेटों पर कालोनियों के लिए स्क्रीन 37 incubating द्वारा 10 माइक्रोग्राम / एमएल -1 टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक 24 घंटे के लिए सें। 17

परिवर्तन की सुविधा के लिए इलेक्ट्रो-सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं की 2. तैयारी

नोट: विद्युत सक्षम कोशिकाओं की तैयारी संस्कृति के 1.0 एल कि एक छोटी मात्रा (यानी, 250 मिलीलीटर) से नीचे पहुंचा जा सकता है के लिए प्रोटोकॉल 26 पर आधारित है। कृपया ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल कर सकते हैं खई सब उपभेदों इस पांडुलिपि एफसीए की सुविधा के लिए वर्णित हैं सक्षम है कि बनाने के लिए इस्तेमाल किया। 22

  1. एक कुप्पी में एक ही कॉलोनी के साथ तरल माध्यम के 50 मिलीलीटर टीका लगाना और रात खत्म हो जाना, इस कदम (तालिका 2) शुरू होने से पहले उत्परिवर्ती के जीनोटाइप जाँच करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
  2. दो दिन, टीका लगाना रातोंरात संस्कृति की 50 मिलीलीटर के साथ उचित माध्यम (ई कोलाई म्यूटेंट के लिए पौंड और Novosphingobium सपा के लिए पीडी) के 1.0 एल, और (लॉग चरण) 30 डिग्री पर 0.4-0.6 के लिए एक आयुध डिपो के 600 करने के लिए विकसित सी।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 5000 XG पर centrifuging द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला छानना, और बाँझ ठंडा शुद्ध एच 2 ओ की 500 मिलीलीटर में गोली resuspend
  4. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 5000 XG पर तैरनेवाला छानना और बाँझ ठंडा 10% ग्लिसरॉल के 250 मिलीलीटर में गोली resuspend।
  5. 4 पर 20 मिनट के लिए 5000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस, सुपर छाननाnatant, और 10% ग्लिसरॉल के 2.0 मिलीलीटर में गोली resuspend।
  6. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में 50 μl स्थानांतरित द्वारा कोशिकाओं विभाज्य और तुरंत एक सूखी बर्फ इथेनॉल स्नान में ट्यूबों रखकर फ्रीज। electroporation के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सक्षम कोशिकाओं स्टोर।

3. पूरक plasmids के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं के electroporation

  1. electroporation के लिए, सक्षम कोशिकाओं के एक विभाज्य (50 μl) के लिए 1.0 पुनः संयोजक प्लाज्मिड के μl (10-50 एनजी) जोड़ने और 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है।
  2. एक electroporation क्युवेट को pipetting के माध्यम से मिश्रण स्थानांतरण और निम्न स्थापित करने के लिए electroporation तंत्र सेट: 25 μF समाई, 2.5 केवी, 200 और ओम प्रतिरोध और एक पल्स देने के लिए।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए एक पिपेट का उपयोग electroporation क्युवेट करने के लिए वसूली मीडिया (पौंड) और हस्तांतरण के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें। एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए कोमल रोटेशन के साथ ठीक हो।
  4. सिफारिश से संस्कृति के 100 μl प्लेटअगर प्लेट पर बहुत कदम pipetting द्वारा transformants और एक बाँझ स्प्रेडर का उपयोग कर के प्रसार के लिए चयन करने के लिए।
    नोट: उचित अगर प्लेट बनाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं और जीनोटाइप जाँच करने के लिए यह कदम शुरू होने से पहले तालिका 1 और 2 टेबल की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें।

4. AOH1 के परिवर्तन का उपयोग कार्यात्मक complementation की सुविधा प्रदान करने के लिए एल, एल diaminopimelate aminotransferase (dapL)

  1. पूरक विश्लेषण के लिए, खाली वेक्टर (pBAD33) के साथ AOH1 को बदलने, और अलग परिवर्तन की घटनाओं खंड 3.0 में उल्लिखित electroporation प्रोटोकॉल का उपयोग करने में DapL अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ।
  2. लेग अगर मध्यम 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 डीएपी और 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 chloramphenicol और 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 केनामाइसिन के साथ पूरक पर चढ़ाना द्वारा transformants का चयन करें।
  3. पौंड मुझ पर streaking द्वारा प्रतिकृति चढ़ाना कालोनियों द्वारा कार्यात्मक पूरक के लिए टेस्ट0.2% (डब्ल्यू / वी) के साथ और 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 डीएपी और 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 केनामाइसिन बिना arabinose साथ dium।
  4. 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं और परिणाम निरीक्षण करते हैं।
    नोट: परिणाम दिखाना चाहिए कि उत्परिवर्ती केवल डीएपी स्वतंत्र मीडिया केवल जब dapL जीन उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में व्यक्त किया जाता है पर विकसित करने के लिए सक्षम है जब वेक्टर केवल नियंत्रण की तुलना में।

5. TKL-11 के परिवर्तन UDP- एन -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6- मेसो का उपयोग कार्यात्मक complementation की सुविधा प्रदान करने के लिए -diaminopimelate Ligase (Mure)

  1. खाली वेक्टर (pBAD33) के साथ और Mure व्यक्त वेक्टर (pBAD33 :: VsmurE) प्रोटोकॉल धारा 3.0 में उल्लिखित का उपयोग कर के साथ उत्परिवर्ती रूपांतरण।
  2. लेग अगर मध्यम पर प्लेट और चयन transformants 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 थाइमिन और 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 chloramphenicol के साथ पूरक और 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  3. दोनों नियंत्रण और दो ​​लेग माध्यम प्लस 0.2% (w / v) arabinose और 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 थाइमिन पर प्रयोगात्मक परिवर्तनों से streaking या कालोनियों चढ़ाना द्वारा पूरक के लिए टेस्ट।
  4. 30 डिग्री सेल्सियस पर एक थाली और करने के लिए 24 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर अन्य सेते नेत्रहीन विकास phenotype का आकलन करें।
    नोट: परिणाम दिखाने चाहिए कि उत्परिवर्ती 42 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने के लिए केवल जब Mure जीन वेक्टर केवल नियंत्रण की तुलना में उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में व्यक्त किया जाता है में सक्षम है।

Tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज का उपयोग कार्यात्मक complementation की सुविधा प्रदान करने के लिए 6. DL39 के परिवर्तन (tyrB)

  1. लेग अगर प्लेटों पर या तो pBAD33 या pBAD33 :: At5g36160 साथ DL39 बदलने, और चयन transformants 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 tyrosine, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 फेनिलएलनिन, और 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 chloramphenicol प्रोटोकॉल का उपयोग अनुभाग में उल्लिखित के साथ पूरक 3.0।
  2. प्रतिकृति50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 फेनिलएलनिन और 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 tyrosine, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 aspartate, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 leucine, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 valine के साथ कम से कम (M9) मीडिया पर -plate कालोनियों 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 isoleucine, 10 माइक्रोग्राम / एमएल -1 uracil 0.5% (w / v) ग्लिसरॉल, 0.2% (w / v) arabinose। दोनों प्लेटों के एक ही कॉलोनी streaking द्वारा फेनिलएलनिन और tyrosine कमी प्लेटों पर भी प्रतिकृति प्लेट कालोनियों।
  3. विकास phenotype निरीक्षण करने के लिए 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    नोट: परिणाम दिखाना चाहिए कि उत्परिवर्ती केवल उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में, फेनिलएलनिन और tyrosine स्वतंत्र मीडिया पर विकसित करने के लिए केवल जब tyrB जीन व्यक्त किया जाता है में सक्षम है जब वेक्टर केवल नियंत्रण की तुलना में।

7. Hx699 के परिवर्तन Novosphingobium की Hypomucoid Phenotype सपा के कार्यात्मक पूरक सुविधा के लिए। तनाव Hx699

  • जंगली प्रकार के तनाव Novosphingobium सपा रूपांतरण। (Rr2-17) और pRK290 साथ उत्परिवर्ती Hx699 और pRK290 :: RSH एनएसपी 2 अलग परिवर्तन की घटनाओं खंड 3.0 में उल्लिखित परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग करने में।
  • प्लेट आलू डेक्सट्रोज पर परिवर्तनों (पीडी) अगर 10 माइक्रोग्राम / एमएल -1 टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक है, और कम से कम 24 घंटे के लिए या जब तक transformants दिखाई सेते हैं।
  • स्ट्रीक दोनों ताजा पीडी अगर प्लेटों पर एक "एक्स" पैटर्न में परिवर्तनों और 30 पर सेते कम से कम 4 दिनों के लिए सें। नेत्रहीन दोनों प्लेटों के विकास phenotype का परीक्षण करके केवल वेक्टर, और प्रयोग के phenotypes का निरीक्षण करें।
    नोट: परिणाम दिखाना चाहिए कि हाइपो-mucoid phenotype जब RSH जब वेक्टर केवल नियंत्रण की तुलना में उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में व्यक्त किया जाता है पूरित है।

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    Representative Results

    जीवाणु उपभेदों कि विभिन्न कार्यात्मक पूरक विश्लेषण में कार्यरत हैं 2 टेबल में सूचीबद्ध हैं।

    कार्यात्मक पूरक विश्लेषण: एल, एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (dapL)

    ई कोलाई डबल उत्परिवर्ती AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) dapE जीन में उत्परिवर्तन और dapD जीन की एक पूरी विलोपन (चित्रा 1) बंदरगाहों। जैसे, उत्परिवर्ती जब तक डीएपी प्रदान की जाती है विकसित करने में असमर्थ है। इन म्यूटेशन के कारण, AOH1 auxotrophic समझा जाता है। AOH1 एल के कार्यात्मक पूरक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, DapL के रूप में एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (DapL) orthologs एल के संश्लेषण उत्प्रेरित, एल diaminopimelate THDP पीजी और प्रकाश संश्लेषण की सुविधा के लिए सीधे से (चित्रा 1)।

    AOH1 उत्परिवर्ती व्यक्त DapLs एल पर विकसित करने के लिए सक्षम हैं, एल डीएपी मुक्त मीडिया प्रदर्शन है कि पुनः संयोजक एंजाइमों एल THDP परिवर्तित करने में सक्षम हैं, एल डीएपी DapD और डीएपी / लिस मार्ग में DapE enzymatic कदम circumventing (चित्रा 5)।

    कार्यात्मक पूरक विश्लेषण: यूडीपी - एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-glutamate- मेसो -2,6-diaminopimelate ligase (Mure)

    मेसो -diaminopimelate (एम -DAP) ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के पीजी में पार से जोड़ने एमिनो एसिड है। एंजाइम UDP- एन डी -acetylmuramoylalanyl- -glutamyl-2,6- मेसो -diaminopimelate ligase (Mure) इस प्रक्रिया में मीटर -DAP के अलावा (- बी चित्रा 3) की सुविधा। ई कोलाई उत्परिवर्ती TKL-11 एक म्यू बंदरगाहोंMure जीन जो उत्परिवर्ती की क्षमता 42 से बढ़ने की में यह परिणाम में tation इस तथ्य के कारण सी ° कि उत्परिवर्तित एंजाइम इस तापमान पर ठीक से गुना करने के लिए सक्षम नहीं है।

    परिणाम दिखाना होगा दोनों नियंत्रण और प्रयोग से 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर अनुमोदक विकास नहीं है। हालांकि, केवल कोशिकाओं Mure (प्रयोग) व्यक्त 42 के गैर अनुमोदक के तापमान पर विकसित करने के लिए सक्षम हो जाएगा डिग्री सेल्सियस (चित्रा 6)।

    कार्यात्मक पूरक विश्लेषण: Tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज (tyrB)

    Arabidopsis thaliana एक tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज कि tyrosine और 4-hydroxyphenylpyruvate, और फेनिलएलनिन और phenylpyruvate At5g36160 (चित्रा 2) द्वारा एनोटेट interconvert करने में सक्षम है encodes। 4 ई कर्नलमैं उत्परिवर्ती (DL39) tyrB जीन जो फेनिलएलनिन और tyrosine के लिए auxotrophic करता है में एक उत्परिवर्तन बंदरगाहों। 24-26 यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उत्परिवर्ती अमीनो एसिड tyrosine, फेनिलएलनिन, aspartate, leucine, isoleucine और valine के लिए auxotrophic है, के रूप में अच्छी तरह से अन्य म्यूटेशन की वजह से। तनाव ई से TyrB एंजाइम ortholog के बाद से tyrB orthologs के समारोह का आकलन करने के लिए उपयुक्त है कोलाई सीधे tyrosine और फेनिलएलनिन के संश्लेषण प्रोटीन संश्लेषण की सुविधा के लिए शामिल किया गया है।

    परिणाम दिखाना चाहिए कि DL39 उत्परिवर्ती M9 पर विकसित करने के लिए केवल जब tyrosine और फेनिलएलनिन प्रदान की जाती हैं सक्षम है, जबकि। हालांकि, तनाव ए thaliana (At5g36160) व्यक्त (tyrosine और फेनिलएलनिन प्रदर्शन है कि एंजाइम 4-hydroxyphenylpyruvate, और phenylpyruvate टी से फेनिलएलनिन से tyrosine synthesize करने में सक्षम है कमी M9 मीडिया पर विकसित करने के लिए सक्षम है एफigure 7)। 4

    कार्यात्मक पूरक विश्लेषण: Rsh (असली और एस बर्तन Homolog)

    Novosphingobium सपा से Rsh प्रोटीन। (Rr2-17) दोनों एन टर्मिनल phosphohydrolase और (पी) ppGpp synthase डोमेन हैं, और इस तरह ई की जगह की तरह प्रस्तावित bifunctional भूमिका है कोलाई। यह एक ई के पूरक विश्लेषण का उपयोग कर पुष्टि की गई है कोलाई डबल उत्परिवर्ती, CF1693 जो असली और स्थान में उत्परिवर्तन बंदरगाहों Novosphingobium सपा से RSH जीन का उपयोग कर। Rr2-17 RSH उत्परिवर्ती के phenotype, Hx699 (RSH :: ईज़ी TN5, कान आर) का नाम है, एक hypo-mucoid में परिणाम और यह एक गैर कार्यात्मक RSH के कारण है। Hx699 की हाइपो-mucoid phenotype द्वारा मूल्यांकन किया गया था पूरक मूल निवासी RSH एनएसपी जीन द्वारा सुविधा है कि क्लोन किया गया थाव्यापक रेंज मेजबान वेक्टर pRK290 में। हाइपो-mucoid phenotype के अनुरूप, Hx699 खाली वेक्टर pRK290 शरण ट्रांस-पूरित Hx699 द्वारा उत्पादित है कि कम घुलनशील polysaccharide (pRK290 :: RSH एनएसपी) और Rr2-17 pRK290 या pRK290 :: RSH एनएसपी युक्त दिखाने (8 चित्रा) ।

    आकृति 1

    चित्रा 1:। Aspartate से लाइसिन उपचय रास्ते में से वेरिएंट कि मध्यवर्ती diaminopimelate (डीएपी) के माध्यम से आगे बढ़ना रास्ते (ए) एसाइल रास्ते, (बी) diaminopimelate डिहाइड्रोजनेज (DDH) मार्ग और (सी) एल द्वारा एनोटेट , एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (DapL) मार्ग। एंजाइमों के लिए संक्षिप्त नाम परिभाषाएँ इस प्रकार हैं: aspartate काइनेज (lysC), aspartatesemialdehyde डिहाइड्रोजनेज (एएसडी), tetrahydrodipicolinate synthase (Dapa), tetrahydrodipicolinate रिडक्टेस (DapB), tetrahydrodipicolinate acylase (DapD), एन -acyl-2-अमीनो-6-ketopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (DapC), एन -acyl-एल, एल -2, 6-diaminopimelate deacylase (DapE), diaminopimelate epimerase (DapF), मेसो -diaminopimelate डिहाइड्रोजनेज (DDH), मेसो -diaminopimelate decarboxylase (Lysa), एल, एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (DapL), UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl- डी-ग्लूटामेट:। मेसो -2,6-diaminopimelate ligase (Mure) और lysyl-tRNA synthetase (LysU) कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

    चित्र 2

    चित्रा 2: अमीनो एसिड नौसिखिए के लिए उपचय रास्तेसाइन और फेनिलएलनिन। (ए) जीवाणु (ई कोलाई) मध्यवर्ती chorismate और (बी) मध्यवर्ती arogenate के माध्यम से संयंत्र मार्ग के माध्यम से मार्ग। , Chorismate mutase, prephenate डिहाइड्रोजनेज (Tyra), और tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज (TyrB) chorismate mutase / prephenate dehydratase (Phea): एंजाइमों के लिए संक्षिप्त निम्नानुसार हैं। आरेख को अपनाया है और संशोधित रूप प्रभु और हडसन, 2010 4 था यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन

    चित्रा 3: पेप्टीडॉग्लीकैन संश्लेषण के cytoplasmic कदम (ए) पेप्टीडॉग्लीकैन संश्लेषण के cytoplasmic कदम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।। संक्षिप्त एंजाइमों की इस प्रकार हैं: UDP- एन -acetylglucosamine enolpyruvyl ट्रांसफेरेज़ (Mura), UDP- एन -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP- एन -acetylmuramate एल alanine ligase (Murc), UDP- एन -acetyl-muramoylalanine-डी -glutamate ligase (MurD), UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-ग्लूटामेट 2,6- मेसो -diaminopimelate ligase (Mure), UDP- एन -acetylmuramoyl-tripeptide-D-alanyl-D-alanine ligase (MurF ), डी-alanine-D-alanine ligase (DDL)। (बी) disaccharide एन -acetylglucosamine (GlcNAc) दिखा पेप्टीडॉग्लीकैन की एक मोनोमेरिक इकाई की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और एन -acetylmuramic (MurNAc) एक β-1,4 glycosidic बांड के माध्यम से जुड़ा हुआ है। स्टेम पेप्टाइड की स्थिति 3 में एमिनो एसिड पार से जोड़ने की सबसे ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया में सबसे अधिक ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और प्रकाश में मेसो -diaminopimelate (एम -DAP) द्वारा निरूपित में शामिल है।_blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4

    चित्रा 4:। बैक्टीरिया में कड़े प्रतिक्रिया के योजनाबद्ध मॉडल प्रतिनिधित्व एक्सपोजर एक पोषक तत्व गरीब पर्यावरण के लिए प्रेरित करता है Rsh (असली या स्थान) जीटीपी (ग्वानोसिन triphosphate) के लिए एक फॉस्फेट समूह जोड़कर alarmone (पी) ppGpp (guanosine pentaphosphate) anabolize करने के लिए। एक पोषक तत्व अमीर वातावरण के संपर्क में (पी) ppGpp जो एक विकास अवरोध करनेवाला है hydrolyze करने Rsh की अभिव्यक्ति लाती है। आरेख को अपनाया और रस्किन एट अल। से संशोधित किया गया था, 2007 के 27 यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

    चित्रा 5

    चित्रा 5:। कार्यात्मक पूरक DapL का उपयोग कर AOH1 ई के कार्यात्मक पूरक बैक्टीरिया वी से साथ एल, एल diaminopimelate एमिनोट्रांस्फरेज (dapL) जीन कोलाई उत्परिवर्ती spinosum (बनाम dapL), संयंत्र ए थालिअना (dapL पर) और शैवाल, सी reinhardtii (सीआर dapL)। उत्परिवर्ती plasmids, pBAD33, pBAD33 :: बनाम DapL, pBAD33 :: dapL पर और pBAD33 :: सीआर dapL शरण लेग अगर 0.2% के साथ पूरक प्लेटों पर प्रतिकृति-चढ़ाया गया (डब्ल्यू / वी) के साथ या 50 माइक्रोग्राम / एमएल के बिना arabinose एल, एल - diaminopimelate और 30 में बड़े हो रहे थे 24 घंटे के लिए सें। आरेख को अपनाया और से Nachar एट अल। संशोधित किया गया था, 2012 के 18 यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

    चित्रा 6:। कार्यात्मक पूरक Mure का उपयोग कर TKL-11 ई के कार्यात्मक पूरक UDP- एन -acetylmuramoyl एल alanyl-D-glutamate- मेसो -2,6-diaminopimelate ligase (Mure) वी से जीन के साथ कोलाई उत्परिवर्ती spinosum। उत्परिवर्ती plasmids BAD33 या pBAD33 :: VsmurE शरण लेग माध्यम में एक आयुध डिपो के 600 0.1, 10 -2, और 10 -3 0.85% का उपयोग कर बड़े हो रहे थे और क्रमानुसार 10 -1 को पतला कर रहे थे (डब्ल्यू / वी) खारा । 5 विभिन्न dilutions की μl लेग माध्यम 0.2% (w / v) arabinose के साथ पूरक पर प्रतिकृति चढ़ाया गया था और 30 डिग्री सेल्सियस और 42 पर मूल्यांकन बड़े हो रहे थे डिग्री सेल्सियस 24 घंटे के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 7

    चित्रा 7: DL39 ई के कार्यात्मक पूरक एक tyrosine एमिनोट्रांस्फरेज जीन ए से लोकस टैग At5g36160 द्वारा एनोटेट साथ कोलाई थालिअना। उत्परिवर्ती शरण plasmids pBAD33 या pBAD33 :: At5g36160 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 tyrosine, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 फेनिलएलनिन के साथ पूरक लेग अगर प्लेटों पर चयन किया गया था, और 34 माइक्रोग्राम / एमएल -1 chloramphenicol। तनाव एक आयुध डिपो आयुध डिपो के 600 1.0 के लिए लेग शोरबा में हो गया था और क्रमानुसार 10 -1 को पतला कर रहे थे, 10 -2, और 10 -3 0.85% का उपयोग (डब्ल्यू / वी) खारा। विभिन्न dilutions की 5 μl M9 अगर 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 फिनाइल के साथ पूरक प्लेटों पर तो प्रतिकृति-चढ़ाया गयाalanine और 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 tyrosine, 0.5% (w / v) ग्लिसरॉल, 0.2% (w / v) arabinose, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 aspartate, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 leucine, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 valine, 50 माइक्रोग्राम / एमएल -1 isoleucine, 10 माइक्रोग्राम / एमएल -1 uracil, और भी फेनिलएलनिन और tyrosine कमी है और 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे प्लेटों पर। आरेख को अपनाया है और संशोधित रूप प्रभु और हडसन, 2010 4 था यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    आंकड़ा 8

    8 चित्रा: Novosphingobium सपा के hypomucoid phenotype के कार्यात्मक पूरक। उत्परिवर्ती तनाव Hx699। टीवह जंगली प्रकार के तनाव Novosphingobium सपा। (Rr2-17) और उत्परिवर्ती तनाव Hx699 pRK290 या pRK290 :: RSH एनएसपी के साथ तब्दील हो गया। उपभेदों एक "एक्स" में परेशान कर रहे थे और आगे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पीडी अग्रवाल पर बड़े हो रहे थे कम से कम 4 दिनों phenotypes निरीक्षण करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    पूरक plasmids एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर उद्धरण
    pBAD33 सेमी r 21
    pBAD33 :: dapL पर सेमी r 2
    pBAD33 :: सीआर dapL सेमी r 20
    pBAD33 :: बनाम dapL से.मीआर 18
    pBAD33 :: At5g36160 सेमी r 4
    pBAD33 :: बनाम Mure सेमी r 18
    pRK290 Tet r 28
    pRK290 :: RSH एनएसपी Tet r 17

    तालिका 1:। कार्यात्मक complementation इस अध्ययन कार्यात्मक पूरक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल plasmids की सूची में इस्तेमाल किया प्लाज्मिड। सेमी आर और आर Tet क्रमश chloramphenicol और टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध निरूपित।

    तनाव नाम जीव जीनोटाइप phenotype स्रोत
    AOH1 ई कोलाई Δ dapD :: Kan2, dapE6 diaminopimelate के लिए Auxotrophic हडसन प्रयोगशाला
    TKL-11 * ई कोलाई thr-1, leuB6 (एएम), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, टोरंटो -95, glnV44 (एएस), λ - pyrF101, अपने-108, thyA6, argG66, ilvA634, थी -1, deoC1 विकास संवेदनशील phenotype उत्परिवर्ती 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता नहीं है, लेकिन एक 42 डिग्री सेल्सियस थे CGSC (# 5989)
    DL39 * ई कोलाई LAM-, aspC13, एफ एन आर -25, RPH-1 ilvE12, tyrB507 अमीनो एसिड के लिए Auxotrophic; tyrosine, फेनिलएलनिन, leucine, isoleucine और valine CGSC (# 6913)
    Rr2-17 Novosphingobium सपा। (जंगली प्रकार) - हाइपर-mucoid Savka प्रयोगशाला
    Hx699 Novosphingobium सपा। RSH :: ईज़ी TN5, कान आर हाइपो-mucoid Savka प्रयोगशाला

    तालिका 2:। बैक्टीरियल इस अध्ययन में इस्तेमाल उपभेदों संबंधित जीनोटाइप और phenotypes इस अध्ययन में इस्तेमाल के साथ-साथ जीवाणु उपभेदों की सूची। कृपया ध्यान दें कि उपभेदों (TKL -11 और DL39) तारांकन से चिह्नित कोलाई जेनेटिक स्टॉक केंद्र (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/) से सीधे प्राप्त किया जा सकता है।

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    Discussion

    पाठ्यक्रम कि Rochester प्रौद्योगिकी संस्थान में जैव प्रौद्योगिकी और आणविक बायोसाइंस पाठ्यक्रम का अभिन्न अंग हैं में से कई पाठ्यक्रम के व्याख्यान हिस्से के अलावा एक प्रयोगशाला घटक है। शैक्षणिक वर्ष 2014-2015 के लिए पाठ्यक्रम 48 पाठ्यक्रम, जिनमें से 29 एक प्रयोगशाला घटक है जो लगभग 60% का प्रतिनिधित्व शामिल की कुल शामिल हैं। सिद्धांत और व्यवहार (बीपीपी), एक प्रयोगशाला आधारित कोर्स: ऐसा ही एक पाठ्यक्रम संयंत्र जैव रसायन और पैथोलॉजी (FPBP), एक मिश्रित व्याख्यान / प्रयोगशाला पाठ्यक्रम और Bioseparations के मूल तत्व है।

    प्रत्येक पाठ्यक्रम की प्रयोगशाला घटक व्याख्यान सामग्री को सुदृढ़ करने के लिए बनाया गया है। उदाहरण के लिए, जैव रासायनिक रास्ते और चयापचय को भारी FPBP और बीपीपी में जोर दिया जाता है। विषयों के कुछ अमीनो एसिड चयापचय, पेप्टीडॉग्लीकैन जैवसंश्लेषण, संयंत्र माध्यमिक चयापचय, पर्यावरण आलों, दूसरों के बीच करने के लिए जीवाणु प्रतिक्रिया में शामिल हैं। लेखकों कार्यात्मक complem एकीकृत हैचयापचय मार्ग है कि व्याख्यान और या पूर्व प्रयोगशाला प्रस्तुतियों में चर्चा कर रहे हैं की समझ को मजबूत करने के लिए दोनों पाठ्यक्रमों में प्रयोगशाला अभ्यास के रूप में प्रलेखन। कार्यात्मक पूरक प्रयोग का उपयोग कर प्रकाश, पीजी, Tyr, पीएचई और बैक्टीरिया के कड़े प्रतिक्रिया के जैव रासायनिक रास्ते में शामिल जीनों के समारोह का विश्लेषण करने के चार उदाहरण चर्चा कर रहे हैं।

    कई कारण लेखकों को अपने पाठ्यक्रम में इस प्रयोगात्मक मॉड्यूल एकीकृत कर रहे हैं। सबसे पहले, कार्यात्मक पूरक के लिए जोखिम का विश्लेषण करती है सुदृढ़ करने या कि आनुवंशिकी, विकास, जीनोमिक्स, जैव सूचना विज्ञान और जैव रसायन से संबंधित हैं विषयों को पेश करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। दूसरे, प्रयोग सतही है और एक पाठ्यक्रम प्रयोगशाला वातावरण में पूरा किया जा सकता है। अभिकर्मकों कि इस्तेमाल कर रहे हैं सब के सब सुरक्षित हैं और बैक्टीरिया है कि उपयोग किया जाता है जैव सुरक्षा स्तर 1 के रूप में चिह्नित और रोगजनक नहीं हैं। जैसे, लेखकों ऐसे प्लास्मिड और बीए के रूप में अभिकर्मकों बनाने के लिए तैयार कर रहे हैंcterial जो किसी को भी उनके शिक्षण अनुभव के एक भाग के रूप में कार्यात्मक पूरक शामिल करने में रुचि रखता है के लिए उपलब्ध उपभेदों। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जीवाणु उपभेदों (TKL -11 और DL39) के दो कोलाई जेनेटिक स्टॉक केंद्र (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/) से सीधे प्राप्त किया गया।

    यह ध्यान दें कि वहाँ कार्यात्मक पूरक प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं कि महत्वपूर्ण है। पहले कदम के लिए सुनिश्चित करें कि उत्परिवर्ती (एस) किसी भी प्रयोगों के शुरू होने से पहले सुसंस्कृत किया जा करने में सक्षम हैं बनाने के लिए है। कारण यह है कि प्रति 2 टेबल के रूप में, वहाँ प्रत्येक उत्परिवर्ती के साथ जुड़े कई जीनोटाइप हो रहा है। आदेश प्रयोग से पहले सक्षम कोशिकाओं को तैयार करने के उत्परिवर्ती में बढ़ती है, साथ या आवश्यक रसायनों और या पीजी Mure उत्परिवर्ती के बारे में तापमान आवश्यकताओं के बिना उत्परिवर्ती बढ़ रही है की कोशिश करो। यह भी एक शिक्षण पल है क्योंकि यह साबित करना होगा कि उत्परिवर्ती किसी भी प्रयोगों से पहले प्रामाणिक है।

    यहयह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि इस जीन के समारोह (एस) का परीक्षण करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है, यह हमेशा इस तरह के कोडोन उपयोग के रूप में कई कारकों जहां ब्याज की जीन (ओं) को ठीक से नहीं होने के कारण अनुवाद नहीं किया जा सकता है की वजह से काम नहीं करता उत्परिवर्ती जीव में उचित tRNAs। बहरहाल, यह खुला पढ़ने फ्रेम या सीडीएनए क्लोनिंग चरण के दौरान जो सामान्य रूप से उत्परिवर्ती (एस) के कोडोन उपयोग से मिलान करने के न्यूक्लियोटाइड बदलकर ब्याज की जीन synthesizing द्वारा किया जाता है की कोडोन अनुकूलन के द्वारा धोखा दिया जा सकता है। एक और मुद्दा यह है कि कुछ यूकेरियोटिक प्रोटीन समारोह के लिए बाद translational संशोधनों की आवश्यकता होती है। पोस्ट translational संशोधन बैक्टीरिया की सुविधा नहीं है और इस तरह एक के रूप में बैक्टीरियल म्यूटेंट का उपयोग कर जीनों के समारोह (एस) का परीक्षण करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने में सक्षम नहीं हो सकता है।

    तकनीक का महत्व यह है कि हम पाठ्यक्रम में जोर है कि एफसीए एक शानदार तरीका है विवो में जीन के समारोह के लिए परीक्षण करने के लिए है। की विशेषता एंजाइमों ज्यादातर इन विट्रो अध्ययन जहां एंजाइम शुद्ध और पारंपरिक एंजाइमी assays प्रदर्शन कर रहे है पर आधारित हैं। 29 भी पारंपरिक एंजाइमी assays के उपाय या enzymatic गतिविधि का पता लगाने के लिए महान हैं, एक कर सकते हैं अक्सर "बल फ़ीड" व्यावसायिक रूप से उपलब्ध substrates कि नहीं कर रहे हैं एंजाइम शुद्ध या प्राकृतिक एंजाइम के लिए। 30 एक vivo प्रणाली जैसे एफसीए तथ्य यह है कि यह करने के लिए इन विट्रो appose के रूप में शारीरिक शर्तों के तहत काम कर रही है जो सामान्य रूप से शारीरिक शर्तों के तहत नहीं है को देखते हुए एक अधिक प्रामाणिक जीन के समारोह के बारे में सबूत उपलब्ध कराता है। 2 को देखते हुए कई जीनों का कार्य करता है और इस तथ्य के बारे में जानकारी की कमी सबसे एनोटेशन भविष्यवाणी, 31 के आधार पर कर रहे हैं कि इस तकनीक में कई जीन है कि अस्पष्ट रहते हैं या उन है कि वर्तमान में समझा रहे विभिन्न में ख्यात कार्यों के लिए के कार्यों को स्पष्ट करने के प्रयोगों की सुविधा होगी माहिर सार्वजनिक डेटाबेस।

    jove_content "> तकनीक है कि अक्सर अनुभव है सक्षम कोशिकाओं की तैयारी में है के बारे में मुद्दों में से एक है। एक यकीन है कि कोशिकाओं को सही ढंग से तैयार कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त कक्षों यकीन है कि कोशिकाओं को बनाने के अलावा तब्दील किया जा रहा है कि वहाँ बनाना चाहिए पानी और ग्लिसरॉल electroporation प्रक्रिया के दौरान arching को रोकने के साथ ठीक से धो रहे हैं। एक भी यकीन है कि कोशिकाओं दोनों के प्रारंभिक विकास की सुविधा के लिए उपयुक्त रसायन के साथ या उचित तापमान पर बड़े हो रहे हैं बनाकर उत्परिवर्ती के phenotype का जानकार होना चाहिए उत्परिवर्ती और भी कार्यात्मक पूरक विश्लेषण के लिए।

    एक बार इस तकनीक में महारत हासिल है, शोधकर्ताओं के रूप में लंबे समय तक एक जीव इस विश्लेषण की सुविधा उपलब्ध में एक उपयुक्त उत्परिवर्तन के रूप में वहाँ जीनों के समारोह का आकलन करने के लिए कार्यात्मक complementation परख का उपयोग कर सकते हैं। कृपया ध्यान दें कि इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल बैक्टीरिया के उपयोग का वर्णन। जैसे हालांकि, अन्य जीवोंपौधों और स्तनधारी कोशिकाओं, दूसरों के बीच में, जीन के समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 32-33 एक बस प्रयोग की सुविधा को बदलने और या कोशिकाओं के अभिकर्मक के अनुकूलन करने के लिए है कि उचित वैक्टर इसके अलावा में इस्तेमाल कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए होता है ।

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    Disclosures

    लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

    Acknowledgments

    AOH और मास विज्ञान के कॉलेज और थॉमस एच Gosnell समर्थन के लिए Rochester प्रौद्योगिकी संस्थान में लाइफ साइंसेज के स्कूल मानता है। इस काम में संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) AOH एमसीबी-1,120,541 को यह पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    E. coli mutants Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
    Electroporator Biorad-USA 1652100
    Electroporation Cuvettes Biorad-USA 1652082
    Temperature controlled incubator Generic
    Microcentrifuge Generic
    Luria Agar Thermofisher Scientific 22700025
    Luria Broth Thermofisher Scientific 12795084
    M9 Medium Sigma-Aldrich 63011
    Potato Dextrose Medium Fisher Scientfic  DF0013-15-8
    Kanamycin Sigma-Aldrich K1377
    Diaminopimelate Sigma-Aldrich 92591
    Thymine Sigma-Aldrich T0376
    Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
    Tyrosine Sigma-Aldrich T3754
    Phenlylalanine Sigma-Aldrich P2126
    Aspartate Sigma-Aldrich A9256
    Valine Sigma-Aldrich V0500
    Leucine Sigma-Aldrich L8000
    Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
    Uracil Sigma-Aldrich U0750
    Gylcerol Sigma-Aldrich G5516
    Arabinose Sigma-Aldrich A3256
    Tetracyline Sigma-Aldrich 87128
    Taq DNA polymerase Thermofisher Scientific 10342-020
    Platinum pfx DNA polymerase Thermofisher Scientific 11708-013
    T4 DNA ligase Thermofisher Scientific 15224-041
    E. coli Dh5-alpha Thermofisher Scientific 18258012
    E. coli Top10 Thermofisher Scientific C4040-03
    pET100D/topo vector Thermofisher Scientific K100-01
    pCR2.1 Vector Thermofisher Scientific K2030-01

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    References

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    आण्विक जीवविज्ञान अंक 112 कार्यात्मक पूरक विश्लेषण लाइसिन tyrosine फेनिलएलनिन अमीनो एसिड चयापचय कठोर प्रतिक्रिया पेप्टीडॉग्लीकैन कोरम संवेदन
    कार्यात्मक complementation विश्लेषण (एफसीए): एक प्रयोगशाला व्यायाम डिजाइन और जैव रासायनिक रास्ते के शिक्षण के पूरक के लिए लागू
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    Hudson, A. O., Harkness, T. C. M.,… More

    Hudson, A. O., Harkness, T. C. M., Savka, M. A. Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways. J. Vis. Exp. (112), e53850, doi:10.3791/53850 (2016).

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