Summary
Проверка достоверности ферментативных активностей, участвующих в биохимических путей, могут быть объяснены с помощью функционального анализа комплементации (FCA). Описанное в этой рукописи является анализ FCA демонстрирующий ферментативную активность ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, бактериальный строгие реакции и бактериального пептидогликана биосинтеза.
Abstract
Функциональный анализ комплементационная (FCA) представляет собой анализ в естественных условиях , который широко используется для выяснения функции / роль генов / ферментов. Этот метод является очень распространенным явлением в области биохимии, генетики и многих других дисциплин. Подробный обзор техники в дополнение к преподаванию биохимических путей, имеющих отношение к аминокислотам, пептидогликана и бактериальная жесткие ответ сообщается в этой рукописи. Два кДНК из модели растительного организма Резуховидка Таля, которые участвуют в обмене веществ лизина (L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) и тирозин - аминотрансферазы (tyrB) , участвующих в обмене тирозина и фенилаланина выдвинуты на первый план. Кроме того, бактериальные пептидогликана анаболический путь выделен через анализ -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигазная (Мюр) гена UDP- N из бактерии Verrucomicrobium Spinosum , участвующих в скрещивании-linking пептидогликана. Бактериальный жесткие реакции также сообщается посредством анализа РСЗ (г ELA / с горшка ч УДОСТОВЕРЕ) бифункциональный ген , ответственный за гипер-слизистый фенотипа бактерии Novosphingobium зр. Четыре примера FCA представлены. Видео будет сосредоточена на трех из них, а именно лизин, пептидогликана и жестким ответом.
Introduction
Функциональная комплементационный в контексте выяснении функцию (и) / роли (ролей) гена определяется как способность конкретного гомологичные или ортологичными гена для восстановления конкретного мутанта с наблюдаемой фенотипа к состоянию дикого типа, когда гомологичные или ортологичными ген вводят в цис- или транс - в мутантный фоне. Этот метод широко используется для выделения и идентификации функции (ы) / роли (ролей) многих генов. Одним из конкретных примеров является выделение и идентификация оротидин-5-фосфат - декарбоксилазы от Candida Albicans использованием URA3 мутант S. CEREVISIAE и pyrF мутант Е. палочки. 1 Авторы использовали эту технику для выяснения функции генов, которые участвуют в обмене аминокислот, пептидогликана и строгий ответ в своих научно - исследовательских программ и включили эту технику в свои учебные программы в Biotechnology и программы в Рочестерского технологического института (RIT) Молекулярная Bioscience (BMB).
Авторы учат Основы биохимии растений / Патология (FPBP) (Hudson) и Bioseparations: Принципы и практика (BPP) (Hudson / Савка), два курса верхнего отдела факультативный лаборатория, базирующаяся в программе BMB на RIT. Так как некоторые из тем, которые обсуждаются в курсах аффилированы с их научными интересами, авторы включили многие из методов и экспериментальных инструментов, которые используются в своих научно-исследовательских программ в этих двух курсов лабораторных основе. Одним из таких примеров является функциональной дополнительности в качестве лабораторного упражнения, чтобы укрепить лекционные материалы, имеющие отношение к метаболизм аминокислот из растений, пептидогликана и строгие реакции метаболизма от бактерий.
Три из путей аминокислот из растений, которые обсуждаются в ходе FPBB является то, что лизин (Lys), тирозин(Тир) и фенилаланин (Phe). Лиз путь выделяется в процессе из - за важности аминокислоты в качестве незаменимой аминокислоты для всех животных , особенно у людей , так как животные не имеют генетический механизм для синтеза лиз De Novo. Кроме того, недавно было установлено, что растения используют путь для синтеза лиз, который значительно отличается от бактерий. Это открытие было частично способствовало функциональной комплементации E. палочки диаминопимелатдегидрогеназу (DAP) мутанты с использованием гена , который кодирует фермент L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) от модели завода Резуховидка Таля. 2 от варианта пути синтеза лиз через промежуточный диаминопимелатдегидрогеназу показаны на рисунке 1. Кроме того , синтез лиз облегчает через аспартат полученные семейства аминокислот , которые строго регламентированы. 3 в дополнение к их важности в белковой Synthesis, тропинки для Tyr и Phe выдвинуты на первый план , учитывая их важность в выступающей в качестве исходных соединений для анаболизм фенилпропаноидных соединений , участвующих в синтезе растительных защитных соединений , таких как:. алкалоиды, лигнины, флавоноиды, изофлавоноидов, гидроксикоричной кислоты среди других 4 Тир и фенилаланина пути также подсвечиваться, чтобы показать разницу между растением и бактериальными анаболических путей. У бактерий фермент тирозин-аминотрансферазы (TyrB) участвует в анаболизм обеих аминокислот, в то время как в растениях, фермент в основном участвует в катаболизме Tyr и Phe и не участвует в анаболизм этих аминокислот. (Рисунок 2). 4
Различия между грамположительных и грамотрицательных бактерий относительно структуры пептидогликана (PG), выделены в FPBP конечно. Программатор грам-отрицательных бактерий, представляет интерес в отношении патологии растений основано на тот факт, что большинствовозбудителей болезней растений являются грамотрицательные. Недавний обзор в отношении 10 лучших бактериальных фито-патогенных микроорганизмов показали, что все грамотрицательные. Бактерии из родов:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya и Pectobacterium 5 Одним из химических различий при сравнении ствола PG грамотрицательных и грамположительных бактерий , разница между сшивающего амино- кислоты обоих типов. Первым шагом для этого различного сшиванию PG происходит в цитоплазматической ступени PG анаболизм и облегчается с помощью фермента UDP- N -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигаза (мурэ) (Рисунок 3А). Мурэ катализирует добавление конкретного диамина соединения в третьем положении пептида стебле. 6 В большинстве грамотрицательных бактерий, предпоследний лиз предшественник, мезо -diaminopimelate (
В Bioseparations: Принципы и практика (BPP), конечно, различия между открытыми и закрытыми системами для выращивания бактерий и, как уровни питательных веществ существенно изменится в обеих системах из-за изменений окружающей среды обсуждаются. Эти события связаны с регуляторными изменениями называется "сдвиг вниз" или "сдвиг вверх", вызванная голоданием или достаточный запас аминокислот или энергии. "Сдвиг вниз" реакция может произойти, когда бактериальная культура передается из богатой и сложной среде в химически определенной среде с одним источником углерода. Это изменение в окружающей среде приводит к быстрому CESSAция тРНК и рРНК синтеза. Это приводит к отказу от отсутствия рибосом, синтеза белка и ДНК, даже при том, что биосинтез аминокислот активируемых.
После "Сдвиг вниз" ответ, существующие рибосомы используются для производства новых ферментов для синтеза аминокислот, больше не доступны в среде или среде. После некоторого периода времени, синтез рРНК и новые рибосомы собраны и популяция бактериальных клеток начинает расти, хотя по сниженной цене. Ход событий называется "жестким ответом" или "жесткий контроль" и является примером глобальной клеточной регуляции и может рассматриваться в качестве механизма для регулирования биосинтетическую машины ячейки , чтобы компенсировать наличие необходимых субстратов и энергетических потребностей . 8 Строгий ответ , таким образом , позволяет бактериям быстро реагировать на потоки питательных веществ в окружающей среде и способствует и ENHAnces способность бактерий , чтобы конкурировать в условиях , которые могут быстро меняться в отношении питательных веществ и наличия или субстрата. 8-9
Строгий реакция имеет важную роль в экспрессии генов , когда наличие аминокислот, углерода, азота, фосфата и жирных кислот ограничены. 8,10-14 Это жесткие ответ координируется двумя нуклеотидами, гуанозин тетрафосфат (ppGpp) и гуанозина pentaphosphate (pppGpp) обычно называют вместе как alarmone (р) ppGpp. Например, когда аминокислоты с ограниченным, которые могут привести к узким местом в синтеза белка-на alarmone, гуанозин 3,5- (бис) пирофосфат (ppGpp), полученный из анаболизм гуанозин 3-дифосфат 5-трифосфата (pppGpp) накапливает в клетке. Изменение уровня (р) ppGpp участвует в экспрессии генов, которые регулируют реакцию преодолеть отсутствие субстратов в окружающей среде, которые непосредственно вовлечены в рост клеток и РАЗВИТИЕт. Два из генов, которые участвуют в этом процессе, называются Рела и SPOT. RelA является рибосомами, связанный (р) ppGpp синтетазы, который участвует в ответ на накопление тРНК, что является результатом ограничения аминокислоты. Функции SPOT как бифункциональный (р) ppGpp синтетазы и гидролазы. Синтетазы активность SPOT участвует в ответ на отсутствие углерода и жирных кислот голодания. 8 гомологов RelA / SPOT широко распространены в растениях и бактериях и называются Rsh для R ELA / S горшка ч omologs. 8,10 -12,16 Недавно рукопись показал , что существует специфический белок Rsh участвует в синтезе этих alarmones из бактерии Novosphingobium зр Rr 2-17. 17
Здесь мы представляем четыре биохимических путей, привязанными к функциональным комплементационных анализов. Комплементации анализы, описанные в этой рукописи содержится проспект к EXPLруды с использованием этого анализа в естественных условиях в качестве средства идентификации и или характеризующие ферменты, которые предсказаны , чтобы иметь неизвестный / предполагаемую функцию (ы) или в качестве учебно - методических пособий в дополнение к преподаванию биохимических путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Авторы готовы предоставить бактериальные штаммы и рекомбинантные плазмиды с целью содействия включению функционального анализа комплементационной для целей обучения для лиц, которые заинтересованы. Плазмиды , которые были использованы для облегчения проведения функциональных экспериментов комплементационной приведены в таблице 1.
1. Конструирование плазмид для функциональной дополнительности
- Клонирование диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) для функциональной дополнительности.
- Усилить ДАПЛ открытую рамку считывания (ORF) из V. Spinosum и от A. кДНК thaliana и C. reinhardtii с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из 4 дезоксинуклеотидтрифосфатов, и 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица PFXДНК-полимеразы.
Примечание: Полное описание , относящиеся к рекомбинантным клонированием трех ДАПЛ ортологи из растений A. thaliana (В -dapL), бактерия Verrucomicrobium Spinosum (Vs -dapL) и водоросль Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) была ранее опубликована. 2,18-20
Примечание: праймеры, используемые для клонирования ортологах ДАПЛ заключаются в следующем:
Vs ДАПЛ F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
Vs ДАПЛ R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
На ДАПЛ F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
В ДАПЛ R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr ДАПЛ F-5'- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Cr ДАПЛ R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - Клонирование фрагментов ПЦР в тон , как и плазмида pET30A для получения рекомбинантных плазмид, pET30A :: Vs ДАПЛ, pET30A :: В ДАПЛ и pET30A :: Cr ДАПЛ с использованием праймеров, ферменты рестрикции и ДНК - лигазы Т4.
- В кратком изложении, инкубировать 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. палочка DH5 & alpha ; клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 50 мкг / мл канамицина -1 путем инкубирования при 37 ° С в течение 24 ч. 18-20
- Для создания плазмиды для функциональной комплементации, переваривать pET30A :: Vs ДАПЛ и pET30A :: В ДАПЛ плазмид ферментами рестрикции XbaI и SalI и XbaI и HindIII для pET30A :: Cr ДАПЛ. Лигирования вставки в плазмиду pBAD33 с использованием ДНК - лигазы Т4 с получением плазмиды pBAD33 :: Vs ДАПЛ; pBAD33 :: В ДАПЛ и pBAD33 :: Cr ДАПЛ.
- Выдержите 50 нг вставки и 20 нгвектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. палочка DH5 & alpha ; клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 34 мкг / мл канамицина -1 путем инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 20
- Усилить ДАПЛ открытую рамку считывания (ORF) из V. Spinosum и от A. кДНК thaliana и C. reinhardtii с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из 4 дезоксинуклеотидтрифосфатов, и 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица PFXДНК-полимеразы.
- Клонирование тирозинаминотрансферазы (tyrB) от А. thaliana для функциональной дополнительности.
Примечание: Полные подробности , касающиеся клонирования кДНК из A. thaliana аннотированный локусом тегов At5g36160 был описан ранее. 4- Amplify кДНК с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, и 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Pfx ДНК - полимеразы.
Примечание: праймеры, используемые для ХЛческими из At5g36160 заключаются в следующем:
На tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - Клонирование фрагмента в плазмиду pET30A для получения рекомбинантных плазмид pET30A :: At5g36160 расщеплением ПЦР-фрагмента с EcoR1 и Sal1; лигировать в фрагмента в pET30A с использованием ДНК - лигазы Т4 , как описано ниже. 4
- Чтобы создать функциональную плазмиду комплементации, переваривают pET30A :: At5g36160 ферментами рестрикции XbaI и HindIII, и лигируют вставку в pBAD33 используя те же сайты ферментов рестрикции для получения рекомбинантной плазмиды pBAD33 :: At5g3160 с использованием ДНК-лигазы Т4.
- Инкубируют 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform лигирование в Е. палочка DH5 & клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 34 мкг / мл -1 Chloramphenicol путем инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 4
- Amplify кДНК с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, и 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Pfx ДНК - полимеразы.
- Клонирование UDP- N -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигазы (мурэ) из V. Spinosum для функциональной дополнительности.
Примечание: Клонирование MURE ORF из V. Spinosum было описано ранее. 18- Усилить открытую рамку считывания с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Pfx ДНК - полимеразы. Затем клонировать в плазмиду pET100D для получения плазмиды pET100D :: Vs Мюр.
Примечание: праймеры , используемые для клонирования Vs MURE заключаются в следующем:
Vs MURE F- 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
VsMURE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - Для получения плазмиды для функциональной дополнительности, переваривать pET100D :: Vs MURE
Ферментами рестрикции XbaI и Sal1 и лигирования вставки в pBAD33 получением рекомбинантной плазмиды pBAD33 :: Vs мурэ с использованием ДНК - лигазы Т4.- Инкубируют 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы, вместе с 1 единицу ДНК-лигазы Т4, в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. клетки и экран палочки для DH5 & колоний на LB пластинах с 34 мкг / мл -1 хлорамфеникол , дополненных инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 8
- Усилить открытую рамку считывания с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Pfx ДНК - полимеразы. Затем клонировать в плазмиду pET100D для получения плазмиды pET100D :: Vs Мюр.
- Клонирование Рела / с горшка (РСЗ) из Novosphingobium зр для функциональной дополнительности.
Примечание:. Клонирование РСЗ из Novosphingobium зр было описано ранее 17.- Усилить РСЗ ORF в дополнение к 599 нуклеотидами upstстопка сайта старта инициации и 46 нуклеотидов ниже по течению на месте окончания с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Taq - ДНК - полимеразы. Затем клонировать в плазмиду pCR2.1 для производства pCR2.1 :: NSP RSH.
- Выдержите 1 мкл ПЦР-амплификации фрагмента 1 мкл вектора pCR2.1 1 мкл солевого раствора и 1 мкл воды. Инкубируют при 25 ° С в течение 5 мин и 2 мкл лигирование в E. палочки клетки и пропускают через сито для колоний на LB пластинах с добавлением 50 мкг / мл канамицина -1 путем инкубирования 37 ° C в течение 24 часов.
Примечание: праймеры, используемые для клонирования РСЗ заключаются в следующем:
RSH F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
RSH R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - Для функциональной комплементации, переваривают плазмиду pCR2.1 :: Nsp РСЗ с EcoR1 и лигировать вставку в pRK290 широком диапазоне хозяина для получения рекомбинантной плазмиды pRK290 :: NSP РСЗ с использованием ДНК - лигазы Т4.
- Инкубируют 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. палочка DH5 & alpha ; клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 10 мкг / мл тетрациклина -1 путем инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 17
- Выдержите 1 мкл ПЦР-амплификации фрагмента 1 мкл вектора pCR2.1 1 мкл солевого раствора и 1 мкл воды. Инкубируют при 25 ° С в течение 5 мин и 2 мкл лигирование в E. палочки клетки и пропускают через сито для колоний на LB пластинах с добавлением 50 мкг / мл канамицина -1 путем инкубирования 37 ° C в течение 24 часов.
- Усилить РСЗ ORF в дополнение к 599 нуклеотидами upstстопка сайта старта инициации и 46 нуклеотидов ниже по течению на месте окончания с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Taq - ДНК - полимеразы. Затем клонировать в плазмиду pCR2.1 для производства pCR2.1 :: NSP RSH.
2. Получение Электрогидравлический компетентных бактериальных клеток с целью содействия трансформации
Примечание: Получение электромеханических компетентных клеток основан на протоколе 26 для 1,0 л культуры , которая может быть масштабирована до меньшего объема (то есть, 250 мл). Обратите внимание, что этот протокол может бе используется , чтобы сделать все штаммы компетентны, которые описаны в этой рукописи , чтобы облегчить FCA. 22
- Привить 50 мл жидкой среды с одной колонии в колбу и расти в течение ночи, убедившись в том , чтобы проверить генотип мутанта перед началом этого шага (таблица 2).
- На второй день инокуляции 1,0 л соответствующей среде (LB для E. мутантов палочки и PD для Novosphingobium SP) с 50 мл ночной культуры, и вырасти до OD 600 до 0.4-0.6 (логарифмической фазы) при 30 ° C.
- Урожай клетки центрифугированием при 5000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С, сливают супернатант, и ресуспендируют осадок в 500 мл стерильной охлажденной льдом чистого Н 2 О.
- Центрифуга клетки при 5000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С, сливают супернатант и ресуспендируют осадок в 250 мл стерильной охлажденной на льду 10% -ного глицерина.
- Центрифуга клеток при 5000 х г в течение 20 мин при 4 ° C, фильтруйте суперплавучий, и ресуспендируют осадок в 2,0 мл 10% глицерина.
- Аликвотировать клеток путем переноса 50 мкл в микро-центрифужные пробирки и немедленно замораживать, помещая пробирки в баню с сухим льдом-этанолом. Хранить компетентных клеток при -80 ° С для электропорации.
3. электропорации бактериальных клеток с комплементационной плазмид
- Для электропорации, добавьте 1,0 мкл (10-50 нг) рекомбинантной плазмиды в аликвоты (50 мкл) компетентных клеток и помещают на лед в течение 5 мин.
- Перенести смесь с помощью пипетки к кювету для электропорации и установите аппарат для электропорации со следующей установкой: 25 мкФ емкости, 2,5 кВ и 200 Ом сопротивление и доставить импульс.
- Добавить 1,0 мл носителя восстановления (LB) в кювету для электропорации и передачи с помощью пипетки на 15 мл коническую трубку. Восстановление с легким вращением в течение 60 мин в шейкере инкубаторе.
- Пластина 100 мкл культуры из RECOочень шаг на агара, чтобы выбрать для трансформантов с помощью пипетки и распространение с использованием стерильного шпателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том , чтобы проверить таблицу 1 и Таблицу 2 перед началом этого шага , чтобы проверить антибиотики и генотипы , чтобы сделать соответствующие агаром.
4. Трансформация AOH1 для содействия функциональной дополнительности Использование L, L-диаминопимелатдегидрогеназу Aminotransferase (ДАПЛ)
- Для анализа комплементационной, преобразование AOH1 с пустым вектором (pBAD33), и с вектором экспрессии ДАПЛ в отдельных событий трансформации с использованием протокола электропорации , описанную в разделе 3.0.
- Выберите трансформантов путем высева на агаровой среде LB с добавкой 50 мкг / мл -1 DAP и 34 мкг / мл хлорамфеникола -1 и 50 мкг / мл канамицина -1.
- Тест для функциональной дополнительности по репликой-гальванических колоний штриховой разводкой на LB мнеDIUM с 0,2% (вес / объем) арабинозы с использованием и без 50 мкг / мл -1 DAP и 34 мкг / мл канамицина -1.
- Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 24 ч и наблюдать результаты.
Примечание: результат должен показать, что мутант только способен расти на DAP свободных средств массовой информации только тогда, когда ген ДАПЛ выражается в мутантной фоне по сравнению с только вектором управления.
5. Трансформация TKL-11 для содействия функциональной дополнительности Использование UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-глутамил-2,6- мезо -diaminopimelate лигазы (Мюр)
- Transform мутанта с пустым вектором (pBAD33) и с экспрессирующим вектором мурэ (pBAD33 :: VsmurE) , используя протокол , изложенный в разделе 3.0.
- Пластине и выбрать трансформантов на LB агаре среде с добавлением 50 мкг / мл -1 тимин и 34 мкг / мл хлорамфеникола , -1 и инкубировать пластин при 30 ° С в течение 24 ч.
- Тест для комплементации штриховой разводкой или металлизации колоний из обоих контрольных и экспериментальных преобразований на две среды LB плюс 0,2% (вес / объем) арабинозы и 50 мкг / мл -1 тимин.
- Выдержите в одну пластину при 30 ° С, а другую при 42 ° С в течение 24 ч, чтобы визуально оценить фенотип роста.
Примечание: Результаты должны показать, что мутант способен расти при 42 ° С только тогда, когда ген мурэ выражается в мутантной фоне по сравнению с только вектором управления.
6. Преобразование DL39 для содействия функциональной дополнительности Использование тирозинаминотрансферазы (tyrB)
- Трансформирование DL39 либо pBAD33 или pBAD33 :: At5g36160 и выберите трансформантов на чашках с LB с добавкой 50 мкг / мл -1 тирозина, 50 мкг / мл -1 фенилаланин и 34 мкг / мл хлорамфеникола -1 с использованием протокола , изложенного в разделе 3.0.
- копия-plate колонии на минимальных (М9) сред с 50 мкг / мл -1 фенилаланина и 50 мкг / мл -1 тирозин, 50 мкг / мл -1 аспартат, 50 мкг / мл -1 лейцин, 50 мкг / мл -1 валин, 50 мкг / мл -1 изолейцин, 10 мкг / мл -1 урацил 0,5% (вес / об) глицерина, 0,2% (вес / объем) арабинозы. Кроме реплик пластинчатые колонии на пластинах, не имеющих фенилаланин и тирозин штриховой разводкой ту же колонию обеих пластин.
- Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 48 часов для наблюдения фенотип роста.
Примечание: результат должен показать, что мутант только способен расти на фенилаланин и тирозин свободных средств массовой информации, только тогда, когда выражается ген tyrB в мутантной фоне по сравнению с только вектором управления.
7. Трансформация Hx699 для содействия функциональной дополнительности в Hypomucoid фенотип Novosphingobium зр. Штамм Hx699
Примечание: результат должен показать, что гипо-слизистый фенотип дополняется когда RSH выражается в мутантного фона по сравнению с только вектором управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Бактериальные штаммы, которые используются в различных функциональных анализах комплементации, перечислены в таблице 2.
Функциональный анализ комплементационная: L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ)
E. палочка двойной мутант AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) таит в себе мутации в гене DAPE и полное удаление гена DAPD (Рисунок 1). Таким образом, мутант не может расти, если ДАФ не предусмотрено. Из - за этих мутаций, AOH1 считается ауксотрофная. AOH1 подходит для функционального анализа комплементации L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) ортологи как ДАПЛ катализирует синтез L, L-диаминопимелатдегидрогеназу непосредственно от THDP для облегчения PG и лиз синтеза (рис 1).
AOH1 мутантные выражения DapLs способны расти на L, L-DAP-свободные средства массовой информации демонстрируют , что рекомбинантные ферменты способны превращать THDP в L, L-DAP обходя DAPD и DAPE ферментные шаги в DAP / лиз пути (Рисунок 5).
Функциональный анализ комплементационный: UDP - N -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигаза (мурэ)
мезо -diaminopimelate (м -DAP) является сшивающий аминокислоты в Программатор грамотрицательных бактерий. Фермент UDP- N -acetylmuramoylalanyl- D -glutamyl-2,6- мезо -diaminopimelate лигазная (Мюр) облегчает добавление м -DAP в этом процессе (рис 3A - B). E. палочка мутант TKL-11 таит мукавитация в гене мурэ , что приводит к способности мутанта , чтобы расти на 42 ° C из-за того, что мутантный фермент не способен правильно складывать при этой температуре.
Результаты продемонстрируют, что наблюдается рост при допустимой температуре 30 ° С за счет как в контрольной, и в экспериментальной группе. Тем не менее, только клетки, экспрессирующие Мюр (эксперимент) будет иметь возможность расти в запрещающей температуре 42 ° С (рисунок 6).
Функциональный анализ комплементационная: тирозин аминотрансферазы (tyrB)
Резуховидка Таля кодирует тирозин - аминотрансферазы , который способен переходить одна тирозин и 4-hydroxyphenylpyruvate и фенилаланин и phenylpyruvate аннотированный по At5g36160 (рисунок 2). 4 Е. седлоI мутанта (DL39) таит в себе мутацию в гене tyrB , что делает ауксотрофная для фенилаланина и тирозина. 24-26 Следует отметить , что мутант ауксотрофная для аминокислоты тирозин, фенилаланин, аспартат, лейцин, изолейцин и валин, а также из-за других мутаций. Штамм пригоден для оценки функции tyrB ортологах поскольку фермент ортолога TyrB из E. палочка непосредственно участвует в синтезе тирозина и фенилаланина , чтобы облегчить синтез белка.
Результат должен показать , что в то время как мутант DL39 способен расти на М9 только тогда , когда тирозина и фенилаланина предоставляются. Тем не менее, штамм , выражающее A. thaliana (At5g36160) способен расти на М9 , не имеющих тирозина и фенилаланина , демонстрирующую , что фермент способен синтезировать тирозин из 4-hydroxyphenylpyruvate и фенилаланина из phenylpyruvate Г (Гigure 7). 4
Функциональный анализ комплементационная: Rsh (RelA и S горшка гомолог)
Белок Rsh из Novosphingobium зр. (Rr2-17) содержит как N-концевой phosphohydrolase и (р) ppGpp синтазы домены, и , таким образом , имеет предлагаемую бифункциональный роль как пятнистость Е. палочка. Это было подтверждено с помощью комплементации анализа на E. палочка двойной мутант, CF1693 , который таит в себе мутации в Рела и SPOT с использованием гена РСЗ из Novosphingobium зр. Фенотип Rr2-17 РСЗ мутанта, названный Hx699 (РСЗ :: EZ-Tn5, Кан R), приводит к гипо- слизистая и это связано с нефункциональным РСЗ. Гипо- слизистая фенотип Hx699 оценивали комплементационная способствует родному РСЗ гена NSP , который был клонированв широкой хозяевах вектор диапазон pRK290. В соответствии с гипо-слизистый фенотипа, то Hx699 укрывательство пустой вектор pRK290 показывают менее растворимый полисахарид , который получают путем транс-дополнима Hx699 (pRK290 :: RSH NSP) и Rr2-17 содержащий pRK290 или pRK290 :: РСЗ NSP (Рисунок 8) ,
На рисунке 1:. Варианты лизина анаболических путей от аспартата , которые проходят через промежуточную диаминопимелатдегидрогеназу (DAP) Дорожки аннотируются по формуле (A) ацильных путей, (б) диаминопимелатдегидрогеназу (ДДГ) путь и (С) Л , L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) путь. Определения Аббревиатура для обозначения ферментов являются следующие: аспартаткиназу (LysC), аспартатполуальдегида дегидрогеназы (ASD), tetrahydrodipicolinate - синтазы (Dapa), tetrahydrodipicolinate редуктазы (DapB), tetrahydrodipicolinate ацилазу (DAPD), N - ацил-2-амино-6-ketopimelate аминотрансферазы (DapC), N - ацил-L, L-2, 6-диаминопимелатдегидрогеназу deacylase (DAPE), диаминопимелатдегидрогеназу эпимераза (DapF), мезо -diaminopimelate дегидрогеназы (ДДГ), мезо -diaminopimelate декарбоксилазы (Лысая), L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ), UDP- N -acetylmuramoyl-L-аланил- d-глутамат:. мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигазная (Мюр) и лизил-тРНК синтетазы (LysU) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Анаболические пути для Тайро аминокислотсинус и фенилаланин. (A) бактериальный (E.coli) путь через промежуточную хоризмата и (В) растение путем за счет промежуточного arogenate. Сокращения для ферментов являются следующие: хоризматмутазы / префената дегидратазы (PheA), хоризматмутазы, префената дегидрогеназы (Tyra), и тирозин-аминотрансферазы (TyrB). Диаграмма была принята и модифицированная форма Прабху и Хадсон, 2010. 4 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Цитоплазмическая стадию синтеза пептидогликана (А) Схематическое представление цитоплазматической этапа синтеза пептидогликана.. сокращения ферментов , являются следующие: UDP- N -acetylglucosamine енолпирувил трансферазы (мура), UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP- N -acetylmuramate-L-аланин - лигазы (MurC), UDP- N - ацетил-D-muramoylalanine -glutamate - лигазы (Murd), UDP- N -acetylmuramoyl-L-аланил-D-глутамат 2,6- мезо -diaminopimelate лигаза (мурэ), UDP- N -acetylmuramoyl-трипептид-D-аланил-D-аланин - лигазы (Murf ), D-аланин-D-аланин-лигазы (DDL). (Б) Схематическое представление мономерной единицы пептидогликана , показывающих дисахарид N -acetylglucosamine (GlcNAc) и N -acetylmuramic (MurNAc) связаны через β-1,4 гликозидной связи. Аминокислота в положении 3 штока пептида вовлечен в сшивки обозначим через мезо -diaminopimelate (м -DAP) в большинстве грамотрицательных бактерий и Lys в большинстве грамположительных бактерий._blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Схематическое модельное представление строгого ответа у бактерий Воздействие питательной неблагоприятной окружающей среды вызывает Rsh (RelA или SPOT) для anabolize в alarmone (р) ppGpp (гуанозин pentaphosphate) путем добавления фосфатной группы к ГТФ (гуанозинтрифосфат). Воздействие питательная среды индуцирует экспрессию Rsh к гидролизу (р) ppGpp, который является ингибитором роста. Диаграмма была принята и редактировался Раскина и др., 2007. 27 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Функциональное комплементационная с использованием ДАПЛ функциональной дополнительности из AOH1 Е. палочка мутант с L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) гена из бактерий В. Spinosum (Vs ДАПЛ), завод А. thaliana (В ДАПЛ) и водоросль, C. reinhardtii (Cr ДАПЛ). Мутант укрывает плазмид, pBAD33, pBAD33 :: Vs ДАПЛ, pBAD33 :: В ДАПЛ и pBAD33 :: Cr ДАПЛ были репличной высевали на чашки с агаром LB , дополненной 0,2% (вес / об) арабинозы с добавлением или без 50 мкг / мл L, L - диаминопимелатдегидрогеназу и выращивали при 30 ° C в течение 24 часов. Диаграмма была принята и редактировался Начар и др., 2012. 18 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 6: Функциональная комплементационная с использованием MURE функциональной дополнительности из TKL-11 E. палочка мутант с -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигаза (мурэ) гена UDP- N от В. Spinosum. Мутант укрывает плазмид BAD33 или pBAD33 :: VsmurE выращивали в LB среде до OD 600 0,1 и серийно разводили до 10 -1, 10 -2 и 10 -3 с использованием 0,85% (вес / объем) солевом растворе , 5 мкл различных разведений репличной высевали на LB-среде, дополненной 0,2% (вес / объем) арабинозы и выращивались оценивали при 30 ° C и 42 ° C в течение 24 часов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Функциональная комплементации E. DL39 палочка с геном тирозин - аминотрансферазы аннотированный локусом тегом At5g36160 из A. thaliana. Мутант укрывает плазмид pBAD33 или pBAD33 :: At5g36160, отбирали на LB чашках с агаром , дополненной 50 мкг / мл -1 тирозина, 50 мкг / мл -1 фенилаланин, и 34 мкг / мл хлорамфеникола -1. Штамм выращивали в LB - бульоне до OD OD 600 1,0 и серийно разводили до 10 -1, 10 -2 и 10 -3 с использованием 0,85% (вес / объем) солевом растворе. 5 мкл различных разведений затем репличной высевали на чашки с агаром М9 , дополненной 50 мкг / мл -1 фенилааланина и 50 мкг / мл -1 тирозин, 0,5% (вес / объем) глицерина, 0,2% (вес / объем) арабинозы, 50 мкг / мл -1 аспартат, 50 мкг / мл -1 лейцина, 50 мкг / мл -1 валин, 50 мкг / мл -1 изолейцин, 10 мкг / мл -1 урацила, а также на пластинах , не имеющих фенилаланин и тирозин и инкубировали при 30 ° с в течение 48 часов. Диаграмма была принята и модифицированная форма Прабху и Хадсон, 2010. 4 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: Функциональная комплементации hypomucoid фенотипа Novosphingobium зр. мутантный штамм Hx699. Tон штамма дикого типа Novosphingobium зр. (Rr2-17) и мутантный штамм Hx699 трансформировали pRK290 или pRK290 :: РСЗ NSP. Штаммы штрихом в «Х» и дополнительно выращивали на агар PD при 30 ° С в течение по крайней мере , 4 дней , чтобы наблюдать фенотипы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| комплементационной плазмид | маркеров устойчивости к антибиотикам | цитирование |
| pBAD33 | Cm г | 21 |
| pBAD33 :: В ДАПЛ | Cm г | 2 |
| pBAD33 :: Cr ДАПЛ | Cm г | 20 |
| pBAD33 :: Vs ДАПЛ | Смр | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | Cm г | 4 |
| pBAD33 :: Vs MURE | Cm г | 18 |
| pRK290 | Tet г | 28 |
| pRK290 :: RSH Nsp | Tet г | 17 |
Таблица 1: Функциональная плазмида комплементационный В этом исследовании использовали Список плазмид , используемых для функционального анализа комплементационной.. Cm R и Tet R обозначают хлорамфеникол и тетрациклин сопротивление соответственно.
| имя Штамм | Организм | Генотип | Фенотип | Источник |
| AOH1 | кишечная палочка | Δ DAPD :: Kan2, dapE6 | Ауксотрофная для диаминопимелатдегидрогеназу | Лаборатория Hudson |
| TKL-11 * | кишечная палочка | Чет-1, leuB6 (Am), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, TSX-95, glnV44 (AS), λ -, pyrF101, его-108, thyA6, argG66, ilvA634, Тхи-1, deoC1 | Рост чувствительный фенотип был мутант растет при температуре 30 ° C, но не более 42 ° C | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | кишечная палочка | LAM-, aspC13, FNR-25, Тф-1 ilvE12, tyrB507 | Ауксотрофная для аминокислот; тирозин, фенилаланин, лейцин, изолейцин и валин | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium зр. (Дикого типа) - | Hyper-слизистый | Лаборатория Савка | |
| Hx699 | Novosphingobium зр. | RSH :: EZ-Tn5, Кан R | Hypo-слизистый | Лаборатория Савка |
Таблица 2:. Бактериальные штаммы , используемые в данном исследовании , список бактериальных штаммов , наряду с соответствующими генотипов и фенотипов , используемых в данном исследовании. Обратите внимание , что штаммы (TKL-11 и DL39) , обозначаемые звездочкой могут быть получены непосредственно из Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/~~HEAD=pobj).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многие из курсов, которые являются неотъемлемой частью биотехнологии и молекулярной Bioscience учебного плана в Рочестерского технологического института имеют лабораторный компонент в дополнение к лекционной части курса. Учебный план на учебный 2014-2015 год содержит в общей сложности 48 курсов, 29 из которых содержат лабораторный компонент, который составляют примерно 60%. Одним из таких курс Основы биохимии растений и патологии (FPBP), смешанной лекции / лабораторного курса и Bioseparations: Принципы и практика (BPP), курс на основе лаборатории.
Лабораторный компонент каждого курса направлена на укрепление лекционные материалы. Например, биохимические пути и метаболизм сильно нагруженных в FPBP и BPP. Некоторые темы включают амино- метаболизм кислоты, пептидогликана биосинтез, завод вторичного метаболизма, бактериальный реагирования на экологические ниши, среди других. Авторы включили функциональное complemставление в качестве лабораторных упражнений в обоих курсах, чтобы усилить понимание метаболических путей, которые обсуждаются в лекции и или предварительно лабораторных презентаций. Четыре примера использования функционального эксперимента комплементации для анализа функции генов, участвующих в биохимических путей лиз, PG, Tyr, Phe и строгий ответ бактерий обсуждаются.
Есть несколько причин, почему авторы включили это экспериментальный модуль в свои курсы. Во-первых, воздействие функциональной дополнительности анализ является отличным инструментом для усиления или ввести темы, которые связаны с генетикой, эволюцией, геномики, биоинформатики и биохимии. Во-вторых, эксперимент снисходительный и может быть выполнена в курсе лабораторных условиях. Все реагенты, которые используются безопасны и бактерии, которые используются, обозначены как уровень биологической безопасности 1 и не являются патогенными. Таким образом, авторы готовы сделать такие реагенты, как плазмид и баcterial штаммы, доступные для всех, кто заинтересован в в деле включения функциональной дополнительности как часть их опыта преподавания. Следует отметить, что два из бактериальных штаммов (TKL-11 и DL39) были получены непосредственно из Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/~~HEAD=pobj).
Важно отметить, что существует несколько важных шагов к функциональным протоколом комплементационной. Первый шаг, чтобы убедиться, что мутант (ы) могут культивироваться перед началом каких-либо экспериментов. Причина заключается в том, что , как показано в Таблице 2, существует несколько генотипов , связанных с каждым мутантом. Для того, чтобы вырастить мутанта для подготовки компетентных клеток перед экспериментом, попытаться вырастить мутанта с или без необходимых химических и температурных или требований в отношении мутанта PG Мюр. Это также обучающим моментом, потому что он докажет, что мутант является подлинным перед любыми экспериментами.
ЭтоТакже следует отметить, что, хотя это является отличным инструментом для тестирования функции (ы) генов, она не всегда работает из-за нескольких факторов, таких как использование кодонов, где ген (ы), представляющие интерес не может быть должным образом переведенных из-за отсутствия соответствующие тРНК в мутанте организме. Тем не менее, это может быть обойдена путем оптимизации кодона открытой рамки считывания или кДНК на стадии клонирования, который обычно делается путем синтеза интересующего гена путем изменения нуклеотида, чтобы соответствовать использованию кодонов мутанта (ов). Другая проблема заключается в том, что некоторые эукариотические белки требуют посттрансляционные модификации для функции. Сообщение трансляционной модификации не является особенностью бактерий и как таковой не может быть в состоянии использовать эту технику, чтобы проверить функцию (ы) с помощью генов бактериальных мутантов.
Значение методики , которые мы подчеркиваем в курсах, что FCA является отличным способом , чтобы проверить , функции генов в естественных условиях. Характеристика ферменты в основном основаны на исследованиях , в пробирке , где фермент очищают и традиционные ферментативные анализы выполняются. 29 также традиционные ферментативные анализы являются большими для измерения или выявления ферментативной активности, часто можно "Лубрикаторная" фермент с коммерчески доступных субстратов, которые не являются чистый или натуральный фермент. 30 система в естественных условиях , таких как FCA обеспечивает более достоверным доказательством о функции генов , учитывая тот факт , что она работает в физиологических условиях , как соединять в пробирке , которые , как правило , не в физиологических условиях. 2 с учетом отсутствие информации о функциях многих генов , а также тот факт , что большинство аннотаций основаны на прогнозировании, 31 освоение этой техники будет способствовать эксперименты по выяснению функции многих генов , которые остаются туманными или те , которые в настоящее время считается, что предполагаемые функции в различных общедоступные базы данных.
jove_content "> Один из вопросов, связанных с техникой, которая часто испытывали в подготовке компетентных клеток. Следует убедиться, что клетки получают правильно, чтобы гарантировать, что есть достаточное количество клеток, чтобы быть трансформированы в дополнение к убедившись, что клетки надлежащим образом промывают водой и глицерином, чтобы предотвратить сводообразования в процессе электропорации. Кроме того, следует иметь представление о фенотипа мутанта, убедившись, что клетки выращивают с соответствующим химическим или при надлежащей температуре, чтобы облегчить как начальный рост мутант, а также для функционального анализа комплементационной.После того, как эта техника освоена, исследователи могут использовать функциональный анализ комплементации для оценки функции генов до тех пор, пока существует соответствующая мутация в организме для облегчения этого анализа. Обратите внимание, что протокол в этой рукописи описывает использование бактерий. Тем не менее, другие организмы, такие какрастения и клетки млекопитающих, в частности, могут быть использованы для оценки функции генов. 32-33 Можно было бы просто , чтобы убедиться , что собственные векторы используются в дополнение к оптимизации преобразования и или трансфекции клеток , чтобы облегчить эксперимент ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
AOH и MAS признает колледж науки и Томас Х. Госнелл Школа естественных наук в Рочестерского технологического института для поддержки. Эта работа была частично поддержана со стороны США Национального научного фонда (NSF) награду AOH MCB-1120541.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
