Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Kombinerade optogenetic och Freeze-fraktur Replica immunomärkning att granska Input specifika Arrangemang av glutamatreceptorer i mus Amygdala

doi: 10.3791/53853 Published: April 15, 2016

Abstract

Frys fraktur-elektronmikroskopi har varit en viktig teknik i ultra forskning i över 40 år. Men bristen på effektiva sätt att studera den molekylära sammansättningen av membran producerat en betydande nedgång i dess användning. Nyligen har det varit en stor väckelse i frysfrakturelektronmikroskopiska tack vare utvecklingen av effektiva sätt att avslöja integralmembranproteiner genom immunogold märkning. En av dessa metoder är känd som tvättmedel-upplöst Freeze-fraktur Replica immunomärkning (FRIL).

Kombinationen av FRIL tekniken med optogenetik tillåter en korrelerad analys av de strukturella och funktionella egenskaper hos centrala synapser. Med denna metod är det möjligt att identifiera och karakterisera både pre- och postsynaptiska neuroner genom sina respektive uttryck av en taggad channelrhodopsin och specifika molekylära markörer. Den distinkta utseende postsynaptiska membranet specialisering av glutamaterga synapser vidare tillåter, vid märkning av jonotropa glutamatreceptorer, för att kvantifiera och analysera intrasynaptic fördelningen av dessa receptorer. Här ger vi en steg-för-steg beskrivning av de förfaranden som krävs för att förbereda parade repliker och hur man immunolabel dem. Vi kommer också att diskutera de varningar och begränsningar FRIL tekniken, i synnerhet de som är förknippade med potentiella provtagnings fördomar. Den höga reproducerbarhet och mångsidigheten hos FRIL tekniken, när de kombineras med optogenetik, erbjuder en mycket kraftfull metod för karakterisering av olika aspekter av synaptisk transmission vid identifierade neuronala mikrokretsar i hjärnan.

Här ger vi ett exempel på hur detta tillvägagångssätt användes för att få en inblick i struktur-funktionssamband av excitatoriska synapser på nervceller i de inskjutna cellmassor med musen amygdala. Framför allt har vi undersökt uttrycket av jonotropiska glutamatreceptorer på identifierade ingångar elleriginated från talamisk posterior intralaminära och mediala geniculate kärnor. Dessa synapser visade sig förmedla sensorisk information som är relevant för rädsla lärande och att genomgå förändringar plast på rädsla konditione.

Introduction

Definitionen av den funktionella arkitektur biomembran på nanometerskala har ifrågasatts under de senaste åren genom utvecklingen av ett antal immunmärkningen tekniker som är lämpliga för transmissionselektronmikroskopi. Men dessa tekniker, till exempel, före och efter bädda immunogold, har ett antal viktiga begränsningar, bland annat dålig detektering av antigener och / eller begränsad kvantitativ bedömning av membranbundna proteiner. Dessa begränsningar blir särskilt kritisk i utredningen av den fina strukturen av nervsystemet, som kännetecknas av en hög grad av cell mångfald och synaps heterogenitet. Denna heterogenitet resultat från både strukturell och funktionell mångfald dikteras av pre-och postsynaptiska element och av differentialuttryck, anrikning, eller interaktion av signalproteiner, såsom receptorer, transportörer och effektormolekyler.

En ny metod för direkt immunolabeLing av integral eller tvärbundna membranproteiner i tvätt solubiliserad frysfraktur kopior (FRIL) introducerades ursprungligen av Fujimoto två decennier sedan en. Denna ursprungliga metoden hade dock flera begränsningar, det vill säga, svår fragmentering av repliker, som hindrade meningsfull korrelationer av märkta molekyler med individuellt mappade celler i komplexa vävnader såsom hjärnan. Cirka 10 år sedan, Shigemoto och Fukazawa successivt förbättrat tekniken två. Detta parallellt med insatser från en annan grupp av forskare vid Boulder laboratorier State University Colorado, som avsevärt förbättrade också tekniken, i synnerhet för studier av gap-junctions 3.

Förbättringen i frysfrakture protokoll och maskiner, samt införandet av snabbfrysning (under högt tryck), gör nu utredare för att producera obrutna kopior av exemplar av relativt stor storlek och high bilder av hög kvalitet för de flesta cellulära komponenter utan de begränsningar och artefakter som produceras av starka kemiska upptagningar.

Den FRIL teknik erbjuder den stora fördelen med en i hög grad kvantitativ i identifiering av ett eller flera proteiner (samtidigt) i histologiskt mappas och cytologiskt identifierade celler inom komplexa vävnader såsom hjärnan situ, med den ytterligare fördelen med en planvy av pre- och postsynaptiska element i en enskild kopia. Därför FRIL teknik, trots sina många tekniska hinder, håller löftet för ett antal mycket stora vetenskapliga genombrott, särskilt för korrelationen mellan strukturella och funktionella egenskaper hos enskilda synapser. Under de senaste årtiondena har en hel del information har erhållits på strukturen, molekylär göra upp, och fysiologisk funktion av synapser, men synapser är morfologiskt och molekylärt mycket varierande beroende på före och postsynaptiska pahyra nervceller 4. Endast för en handfull synaps typer var struktur-funktionsstudier åstadkommit hittills 5-7. Detta berodde främst på tekniska restriktioner som förhindrade en exakt identifiering av vilken typ av pre-och postsynaptiska element.

Ultra analys har gett värdefull kunskap i variationen av postsynaptiska membran inriktningar över skilda synaptiska kontakter både när det gäller synaptiska storlek och innehåll i neurotransmittorreceptorer 6, som har en stor inverkan på styrkan och plasticitet av synaptisk transmission. Dessutom en stor mängd forskning visar att antalet jonotropa glutamatreceptorer som uttrycks på olika typer av synaps regleras i en afferent- och mål beroende sätt 7-10.

Här är en metod som beskrivs som möjliggör analys av struktur och receptor sammansättningen av postsynaptiska membran inriktningar med definierad presynaptiska element och funktion. Detta tillvägagångssätt drar fördel av presynaptisk uttryck av nyligen utvecklade ljuskänsliga alg proteiner, såsom Channelrhodopsin2 (ChR2), och av FRIL teknik för att analysera mönstret av postsynaptiska uttryck av α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra syra (AMPA-R) och N-metyl-D-aspartat (NMDA-R) glutamatreceptorer. Detta visas vid synapser bildas av axoner som härrör från de bakre thalamus-mediala geniculate kärnor (PIN / MGN) på nervceller i de inskjutna cellmassor i amygdala (ITC). ITC nervceller är små taggiga GABAerga celler organiserade i kluster kring basolaterala amygdaloid komplexet (BLA) 11, 12. ITC neuroner är kända för att ta emot excitatoriska input från BLA huvud neuroner och att rikta den centrala kärnan (CEA), vilket fungerar som en hämmande grind för informationsflödet mellan BLA och Cea 12-15.

Nyligen visade vi att ITC neuron belägna i medio-rygg kluster mellan BLA och CEA får också direkta och konvergerande excitatoriska input från sensoriska talamiska och temporala kortikala regioner, som är modifierade på rädsla lärande under Pavlovian hörsel rädsla konditione 16. Rädsla konditioneringen är en av de bäst förstås former av associativ inlärning i form av hjärnmekanismer. I rädsla luftkonditionering, en initialt neutral betingad stimulus (CS, till exempel, en ton) paras med en aversiv obetingat stimulus (US, t.ex. en mild fotchock) resulterar i en CS-amerikanska föreningen och rade rädsla svar 17, 18. Excitatoriska ingångar från både talamiska och hjärnbarkens områden, som bär information som representerar CS och USA, respektive, var kända för att konvergera på pyramidala nervceller i den laterala kärnan i amygdala (LA) och genomgå plasticitet 19. Vårt tidigare arbete visade att sinnesintryck information finns även parallellt förmedlas till ITC neuroner

Som ett första steg mot en mekanistisk molekylär analys av enskilda sinnesintryck synapser på ITC nervceller, använde vi en adenoassocierat virus (AAV) för att uttrycka ChR2 taggade med den gula fluorescerande protein (YFP). AAV injicerades i PIN / MGN och axonet terminalerna identifierades genom deras uttryck av ChR2-YFP. Vi använde båda sidor som genereras av FRIL teknik för att bedöma tätheten av postsynaptiska AMPA-R och NMDA-R vid synapser bildas med ITC nervceller av PIN / MGN Axon terminaler.

Protocol

Förfaranden med djurförsök har godkänts av Regierungspräsidium Tübingen, delstaten Baden-Württemberg, Tyskland, och av den österrikiska djurförsöksetikprövningsnämnd, och var i enlighet med EU-direktivet om användning av djur i forskning.

1. Stereotaktisk Injektioner av AAV-Channelrhodopsin2-YFP

OBS: stereotaktiska injektioner utfördes i enlighet med ett tidigare publicerat protokoll 20.

  1. Förbereda sterila verktyg genom upphettning vid 180 ° C i 1,5 h.
  2. Dra skarpa (~ 50 um diameter) glaspipetter för injektionsvätskor med hjälp av en horisontell mikro avdragare in med följande parametrar: Heat = Ramp värde - 20, Pull = 0, Velocity = 100, tid = 200, tryck = 200.
    OBS: Ramp värde måste bestämmas för varje parti av inköpta glaspipetter enligt de anvisningar som mikropipett avdragare tillverkaren.
  3. Förblandning 1 l av viruslösningen och 0,2 | il av 0,1% snabb grön lösning (för bättre synlighet av lösningen i glaspipett) i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4). Fyll glaspipett med hjälp av en 10 l pipett och gel-Fil tips. För viral konstruktion, använd rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotyp 2/9).
  4. Söva musen med ett litet djur anestesi enhet (3% isofluran i syre för induktion). Användning. För denna studie använda 3 vildtyp möss åldern ~ 6 veckor.
  5. Raka huvudet mellan öron och ögon och desinficera med en povidonjod baserad lösning.
  6. Applicera en ögonsalva för att förhindra uttorkning av ögonen under anestesi. Subkutant injicera musen med smärtstillande (meloxikam-baserad, 0,1 ml av en 5 mg / ml lösning).
  7. Placera musen i stereotaktisk ram och upprätthålla anestesi via en gas anestesi enhet (2% isofluran i syre för underhåll). Kontrollera anestesi djup av brist på en lem tillbakadragandereflex innan du fortsätter.
  8. Bibehålla sterila förhållanden som bäst som möjligt under hela kirurgiska ingreppet. Använd en engångs ansiktsmask, en operationsrock och handskar.
  9. Gör en hud snitt på ca 1 cm på toppen av huvudet med sax 20. Dra försiktigt huden åt sidan med trubbiga pincett, fixa med klämmor för att exponera skallen ytan och ren skalle med H2O 2.
  10. Markera platser injektion på skallen med hjälp av en fin spets märkpenna. Borra ett litet hål (ca 1 mm i diameter) i skallen vid den markerade platsen. För ensidig PIN / MGN injektion i denna stud, använda följande koordinater: från bregma (mm): bakre 3,0, sido ± 1,8, ventrala 3,8.
  11. Mount fylld glaspipett på stereotaktiska ramen ansluten till en tryckinjektionsanordning och föra pipetten till bregma position.
  12. Bryt av spetsen på glaspipett med fina raka spets pincett. Se till pipettspetsen är öppen genom applyinga några tryckpulser och observation extrudering av droppar viruslösning.
  13. Gå till de önskade injektions koordinater och injicera halva pipetten innehåll (~ 0,5 l) med följande inställningar på insprutningsanordningen: tryck 20 psi, i genomsnitt pulslängd 30 ms, genomsnittligt antal pulser 50.
  14. Lämna pipett på plats för ~ 1 minut före långsamt (1 mm / min) dra tillbaka den.
  15. Ren skalle med PBS (pH 7,4) och ta bort klämmorna. Dra försiktigt ihop huden och sutur snittet (3 - 4 knop). Tillämpa desinfektionsmedel (povidonjod baserad) runt såret.
  16. Stoppa anestesi och inte lämnar musen obevakad tills fullt vaken. Håll möss enda inrymt. Postoperativt, fortsätta att övervaka hälsotillståndet; om nödvändigt administrera analgetikum.
  17. Håll djur för 4 veckor innan hjärnan fixering för att säkerställa lämpliga nivåer av viral uttryck.

2. Provberedning

  1. Hjärnan fixering </ Strong>
    1. Framställning av fixativet
      1. För en liter fixativ, väger 10 g paraformaldehyd och lägga till 300 ml avjoniserat H2O Värm till 55-60 ° C för ~ 10 min med kontinuerlig omrörning.
      2. Stäng av värmen och tillsätt 7 - 8 droppar 4 N NaOH. Lösningen bör bli tydliga i ~ 10 min.
      3. Låt den svalna till RT, tillsätt 150 ml av en mättad lösning av Pikrinsyra och föra den till 500 ml med avjoniserat H2O
      4. Tillsätt 500 ml av 0,2 M fosfatbuffert (PB). Filter med filterpapper. Justera pH till 7,4 med NaOH.
      5. Kyl fixativ till 6 ° C, förvara den i mörka glasflaskor för att inte mer än en dag vid 6 ° C.
    2. transkardial perfusion
      1. Söva möss med en intraperitoneal injektion av tiopental (120 mg / kg kroppsvikt). Se till att djuret är djupt sövd genom att kontrollera pedaltillbakadragande reflex, som bör vara frånvarande. Placera djuret på rygg på en perfusion bord med fyra extremiteterna bundna ner.
      2. Öppna bukväggen longitudinellt med trubbig ände sax och göra ytterligare två snitt i sidled längs den kaudala gränsen av bröstkorgen, för att exponera membranet. Skär bort membranet och skär bröstväggen vid osteocartilageneous gränsen på båda sidor. Lyft den bakre änden av den centrala platta av bröstväggen innehållande bröstbenet att exponera hjärtat.
      3. Ta hjärtsäcken, göra en liten exakt snitt i toppen av den vänstra ventrikeln för att erkänna kanylen av perfusion apparaten. Använd en trubbig kanyl med en invändig diameter på 0,6 mm. Passera kanylen försiktigt genom kammaren tills spetsen visas i den uppåtgående aorta och säkra kanylen med en klämma. Att låta blod och perfusat att lämna blodet, gör ett snitt i höger förmak.
      4. Perfundera möss transkardiellt med användning av en peristaltisk pump med en flödeshastighetav 5 ml / min vid första med PBS (25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4) under ca 1 min, följt av iskyld fixativ under 7 min.
      5. Efter fixering, kapa musen huvudet med en sax och sedan skära in i huden genom mittlinjen från nacken till näsan. Ta muskeln till fullo exponera skallen.
      6. Med hjälp av vass sax, gör ett längsgående snitt genom skallbenet och interparietal ben börjar från foramen magnum. Med fin pincett bort dessa ben att exponera hela lillhjärnan. Gör sedan en annan längsgående snitt genom parietalceller och pannben tills näsben och ta bort dem med pincett för att exponera hela hjärnan.
      7. Med hjälp av en spatel avlägsna hjärnan utan att skada den, och placera den i iskall 0,1 M PB.
  2. Sektionering och trimning av proverna
    1. Skär ett koronalt block av ca 5-6 mm med rakblad som innehåller det intressanta området. Limma det på innehavaren avden vibroslicer med en cyanoakrylatlim. Orientera vävnadsblock så att neocortex är vänd mot den vibrerande blad. Skiva koronala sektioner, som innehåller amygdala, vid 140 um med vibroslicer (Figur 1A) i iskall 0,1 M PB, och samla dem i en 6-brunnsskål i samma buffert.
    2. Under en stereomikroskop, trimma ut regionen av intresse (här, medio-rygg paracapsular kluster av ITC, se figur 1B) från skivan. Göra detta i en petriskål belagd med silikonelastomer och fylldes med 0,1 M PB, med användning av en oftalmisk skalpell. Se till att de trimmade blocken passar in i hålet på distansorganet (ca 1,5 mm) (Figur 1B).
    3. Flytta trimmade blocken i kryoskydd lösning (30% glycerol i 0,1 M PB) O / N vid 6 ° C.

3. Högtrycks Frysning

OBS! FRIL består av 6 viktiga steg (Figur 2): 1) Snabb frysning med högt tryck (vid 2300 - 2600 bar) av provet. 2) sprickbildning av provet. Frakturplanet följer i allmänhet den centrala hydrofoba kärnan av frysta membran, dela upp dem i två halv-membran broschyrer: en halv som ligger i anslutning till den protoplasma (P-face) och en halv som ligger i anslutning till det extracellulära eller exoplasmic utrymme (E- ansikte). 3) replikering av provet genom vakuumavsättning av platina och kol. 4) Detergent-digestion av vävnaden. 5) immunogold märkning. 6) Analys av kopian med användning av ett transmissionselektronmikroskop.

  1. Beredning av kopparbärare
    OBS: Skall hanteras genom de olika stadierna av FRIL förfarandet prover måste monteras på metall (guld eller koppar) bärare. Dessa bärare varierar i storlek och utformning beroende på läge av sprickbildning och typ av maskiner som används. Här har vi använt kopparbärare (Figur 1B, E) och en ledad "dubbel repliktabell"; (se figur 3B), som när de öppnas ger en dragbrott genom de frysta provet (Figur 2). Detta gör det möjligt att behålla och replikera båda sidor av de brutna provet.
    1. Polska kopparbärare med en matt remover använder ett ark av sämskskinn hud.
    2. Place bärare i en glaskruka och rena två gånger med ett icke-jonisk detergent (pH ~ 1,5) i ett ultraljudvattenbad, därefter utförligt tvätta i kranvatten, följt av avjoniserat vatten och skölj sedan två gånger med etanol.
    3. Sonikera kopparbärarna i aceton under 15 min.
    4. Placera bärarna på filterpapper för att torka.
    5. Fäst en ring av dubbelhäftande tejp till en kopparbärare (Figur 1C), som kommer att fungera som håller bra för trimmade blocket (håller bärare).
  2. Frysning av provet
    OBS: Hantera flytande kväve med omsorg och bär lämpliga glasögon.
    1. Slå på högtrycks frizing enhet (figur 1F) åtminstone 1,5 tim innan med provet frysning.
    2. Börja uppvärmningen genom att trycka på "LUFTVÄRMARE" -knappen, och baka ut i 50 min. Inställd lufttemperatur till 80 ° C.
    3. Anslut kvävetanken till högtrycksfrysenheten och tryck på "Nitrogen" -knappen för att fylla insidan Dewar med flytande kväve. De "kvävenivån" lampa tänds. Börja kylning genom att trycka på "Cooling" -knappen.
    4. Tryck på "enheten i" knappen när "kvävenivån" slocknar. Kontrollera att det hydrauliska systemet förflyttar kolven fram och tillbaka 3 gånger.
    5. Tryck på knappen "AUTO" och "Nitrogen" -knappen. Så snart "READY" tänds, är högtrycksfrysenheten klar för högtryck frysning.
    6. Placera ett trimmat blocket i hålet av den dubbelsidiga tejpen (Figur 1B) med användning av en platinatrådslinga som har smälts in i aglass pipett.
    7. Avlägsna överskott av den kryoskyddande lösningen med användning av filterpapper eller en borste.
      OBS: Detta förfarande är också viktigt att ta bort luftbubblor som kan bildas runt vävnaden och som kan orsaka förvrängning av vävnaden form och / eller ultra.
    8. Under ett stereomikroskop, täcker håll bärare med en annan bärare, så att vävnaden blocket är inklämd mellan de två bärarna.
    9. Sätt i carrier-sandwich i preparathållaren på högtrycksfrysenhet (figur 1D). Sätt provhållaren i högtrycksfrysenhet (tippa ned) och säkra den genom att skruva i provhållare.
    10. Initiera fryscykeln genom att trycka på knappen "Jet-Auto". Att arbeta så snabbt som möjligt, avlägsna provhållaren och dränka spetsen med flytande kväve i en isolerad låda. Doppa spetsarna på två par av pincett i flytande kväve för att kyla dem.
    11. Försiktigt bort the carrier-smörgås från provhållaren och placera den i en pre-kyld cryovial. Se till att bärarna endast hanteras med flytande kväve-kyld pincett. Cryovials bör vara perforerat för att tillåta kvävet att strömma ut från flaskan (figur 1G).
    12. Upprepa steg 3.2.6 till 3.2.11 tills alla önskade prover har frysts. Flera bärar-smörgåsar som innehåller samma typ av prov kan lagras i samma ampull.
    13. Förvara cryovials innehåller bärarna i en kryotank tills replikering (figur 1H).

Figur 1
Figur 1. Vävnadsberedning och Högtrycks Frysning. (A) Vibroslicer brukade avsnitt vävnaden.   (B) En resulterande koronalt mus avsnitt hjärnan innehåller amygdala visas sida vid sida med acOpper bärare försedd med en ring av dubbelhäftande tejp. Den streckade rutan visar det område av intresse som innehåller den mediala paracapsular kluster av ITC. Diametern av hålet i den dubbelsidiga tejpen är ca 1,5 mm. (C) Verktyg för framställning av kopparbärare. Uppifrån vänster medurs: dubbelhäftande tejp, pincett, laget, kopparbärare, och sax. (D) Införande av carrier-sandwich i provhållare för högtryck frysning. Bäraren-sandwich placeras i hålet på preparathållaren. (E) Kopparbärare utan och med en ring av dubbelhäftande tejp och "carrier-sandwich".   (F) Högtrycksfrysenhet med trycktank som matar flytande kväve till det. (G) En cryovial att lagra de frysta vävnaderna. Observera hålen i det övre mellanposition av flaskan tillåter kvävgas att strömma ut ur flaskan (pilspets). (H) kryotanken för lagring av fryst vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Frys fraktur och replikering

  1. Framställningen av de elektronstrålekanoner
    1. Innan du sätter elektronstrålekanoner, ta bort skyddet med "plåten". Placera "inställning gauge" för att centrera tråden i hylschucken genom den undre katodluckan.
      OBS: Den större diameterände av inställningen mätaren används för kolet pistolen medan slut mindre diametern är för platina pistol.
    2. Skjut in den nya glödtråden över mätaren tills "tryck lamellerna" kan klämma ändarna av glöd, se till att glödpolen inte ligga i en vinkel.
    3. Ta bort inställningsmätaren och sätt kolstaven. Fixa det genom att dra åt coLLET chuck av förångaren stavhållaren, vilket garanterar att höjden av änden av stången är vid mitten av den andra spolen från botten. För platina gun, bör höjden av änden av platinastången vara vid mitten av den andra glödtråden polen från toppen.
    4. Byt ut deflektorskiva och sätta vapen i frysfrakturenheten. Rengör vapen med en sand-blaster efter användning.

figur 2
Figur 2. Illustration av de viktigaste stegen i FRIL teknik.
Översikt över de olika steg som krävs för beredning och analys av replika. (1) Högtrycks frysning av vävnad. (2) sprickbildning. Under sprickbildning av fryst vävnad, är lipiddubbelskiktet i plasmamembran uppdelad i två halvor vid den hydrofoba gränsytan. Proteiner i plasmamembranet allokeras på antingen exoplasmic (E-ytan) eller protoplasmic membran (P-face). (3) replikering. Förångningen av kol (C) svälls lipider och proteiner på ytan av den brutna vävnaden. Materialet är belagd med två nm platina / kol för skuggning vid en 60 ° vinkel, och sedan med en annan 15 nm kolskiktet som förstärker strukturen av replik (C-skikt, Pt-skuggning). (4) Solubilisering. Vävnaden inte fångas av den replika membranet solubiliseras sedan med SDS-lösning. (5) märkning. Proteiner av intresse kan visualiseras på replika med hjälp av ett komplex tillverkat av specifika primära antikroppar (Primary Ab) och sekundära antikroppar (Sekundär Ab) konjugerade med en guldpartikel (Au). Användning av olika storlekar av guldpartiklar medger detektering av mer än en protein på samma replika. (6) Efter immunmärkningen är kopior samlas på kopparnät nät och analyseras med ett transmissionselektronmikroskop vid 80 -. 100 kV Vänligen CLICk här för att se en större version av denna siffra.

  1. Ställ in frysfrakturenhet
    1. Slå på frysfrakturenheten (figur 3A) genom att vrida MAINS till 1. För en detaljerad beskrivning av de frystbrott och replikering förfaranden, se bruksanvisningen som tillhandahålls av tillverkaren.
    2. Före kylning av frys-fraktur-enhet, baka ut hela kylsystemet av enheten med varm luft. Tryck på "Upptining" -knappen i MTC 010-enheten (temperatur styrenhet) (figur 3A) och låt baka process springa under 45 minuter.
    3. Aktivera vakuumstation. Frysfrakturenheten fungerar vanligen i ett vakuum rad ~ 10 -6 - 10 -7 mbar.
    4. Fyll kväve tank och anslut den till frysfrakturenheten. Kontrollera att ventilhållaren är torrt och även rengöra inträde av tanken före insättning av ventilhållaren (luftfuktighet kan störa vacuum och indikering av N 2 påfyllning av tanken).
    5. Börja kylning genom att ställa in temperaturen till -115 ° C. Kylning tar ca 45 min.
    6. Sätt elektronstrålekanoner och justera ström och spänning för att nå följande parametrar för avdunstning:
      Carbon gun: rotation på, position 90 °, ackumulationstakt kol 0,1-0,2 nm / sek
      Kol-platina gun: rotering, läge 60 °, ackumulationstakt 0,06-0,1 nm / sek
      OBS: Om en pistol används för första gången efter byte av kol eller platinatråd, avgasa för 3 min före användning.
  2. Sprickbildning och replikering
    1. Sätt frysta carrier-smörgåsar i dubbel replika bord gör att alla manipulationer görs i flytande kväve.
    2. Överföra dubbla repliktabell till en Dewar-kärl och fixa det till provstadiet mottagaren vid en vinkel på 45 °. Flytande kväve nivån bör alltid vara ovanför dubbelrepliktabell. Plocka upp dubbla repliktabell med bord manipulatorn och sätt in den i frysfrakturenheten på den kalla scenen. Vänta ungefär 20 min så att temperaturen av den dubbla repliktabell för att anpassa sig till -115 ° C.
    3. Kontrollera att vakuumet är lägre än 10 -6 mbar och temperaturen är -115 ° C.
    4. Spräcka vävnaden genom manuell moturs rotation av hjulet som är ansluten till höljet placeras ovanför dubbelrepliktabell. När kåpan stängs, tvingar den dubbla replika tabellen för att öppna, sönder vävnaden.
    5. Tryck på "Hög spänning" i EVM 030-enheten (elektronstråle avdunstning styrenhet) av frysfrakturenheten (figur 3A).
    6. Replikera de exponerade ytorna på den brutna vävnaden (figur 3C) genom avdunstning av kol (roterande) med hjälp av en elektronstrålekanon belägen vid en 90 ° vinkel till en tjocklek av 5 nm, följt av en ensriktad shadovinge med platina-kol vid en 60 ° vinkel till en tjocklek av 2 nm. Slutligen, fäst ett 15 nm tjockt skikt av kol från en 90 ° vinkel (roterande).
    7. Använd följande parametrar för avdunstning:
      1 kol: rotation på, position 90 °; hastighet 0,1-0,2 nm / sek; 5 nm
      2: a kol-platina: positionen 60 °; hastighet 0,06-0,1 nm / sek; 2 nm
      3 kol: rotation på, position 90 °; hastighet från 0,3 till 0,5 nm / sek; 15 nm
    8. Ta bort de replikerade exemplar från frysfrakturenheten och överföra dem till en keramisk 12-brunnar (Figur 4A) fylld med TBS (Tris-buffrad saltlösning, pH 7,4).
    9. Med användning av en platinaögla valstråd, ta bort den replikerade vävnaden från provet bäraren (figur 4A).
    10. Upprepa steg 4.3.1 till 4.3.10 tills alla prover har replikeras.

Figur 3 r /> Figur 3. Frys sprickbildning och replikering.
(A) frysfrakturenhet. Maskinen innehåller flera styrenheter och en bildskärm. Exemplar förs in i kammaren genom en öppning på den vänstra sidan av kammaren. En trycksatt behållare med flytande kväve är ansluten till frysfrakturenheten svalna scenen. Bilderna nedan visar förstorade vyer av två av enheterna (UPC 010 och MDC 010) och monitorn visar parametrar under avdunstning av andra kolskikt.   (B) öppnade (vänster) och stängda (höger) utsikt över den dubbla repliktabell. De "bärar-sandwiches" är införda i slitsarna i tabellen (anges med pilar). De små armarna förhindrar "carrier-smörgåsar" från att falla ut under manipulation. (C) En fraktur och replik prov. Repliker visas som tunna svarta filmer ovanpå den brutna vävnaden.53 / 53853fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. SDS-digestion med kopian
    1. Överföring replik till en 4 ml glasflaska fylld med 1 ml av SDS-uppslutningsbuffert (2,5% Natriumlaurylsulfat, 20% sackaros i 15 mM Tris, pH 8,3). Digest för 18 timmar vid 80 ° C med skakning (45 stroke / min).
    2. Överföring repliker i ett annat rör fyllt med SDS-uppslutningsbuffert och förvara vid RT.

5. immunomärkning

OBS: Alla inkubationer utförs vid RT med mild skakning, med undantag för inkubationer med antikroppar.

  1. Tvätta replik för 10 min i färsk SDS-uppslutningsbuffert.
  2. Tvätta repliken en gång med 2,5% BSA (bovint serumalbumin) i TBS under 5 min, och därefter 3 x 10 min med 0,1% BSA i TBS.
  3. Blockera icke-specifika bindningsställen i TBS med 5% BSA under 1 h.
  4. Tillämpa primära antiorgan utspätt i 2% BSA-TBS. Utföra inkubationer i en 30 | il droppe (Figur 4B) i en fuktig kammare vid 15 ° C under 72 h (figur 4C).
    1. För denna studie process både repliker från den brutna vävnaden. Inkubera en replika med ett marsvin polyklonal antikropp framtagen mot aminosyrorna 717 - 754 av mus GluR1 gemensam för alla AMPA-R-subenheter (spädning: 1: 200) eller en monoklonal musantikropp som tagits fram mot ett rekombinant fusionsprotein som omfattar aminosyrorna 660 - 811 av NR1-subenheten av NMDA-R (spädning: 1: 500), och en polyklonal kaninantikropp som framkallats mot det grönt fluorescerande proteinet (spädning: 1: 300).
    2. Inkubera den andra replika med en kanin polyklonal antikropp alstrad mot en syntetisk peptid motsvarande aminosyrorna 384 - 398 av rått-μ-opioidreceptor (spädning: 1: 500).
  5. Tvätta i TBS med 0,05% BSA (3 x 5 min.).
  6. Tillämpas sekundära antikroppar. För denna studie uSE guld (5 nm för jonotropa glutamatreceptorer, 10 för μ-opioidreceptorer och / eller 15 nm för ChR2-YFP) konjugerade antikroppar utspädda i TBS med 2% BSA. Späd sekundära antikroppar 01:30 och inkubera i en 30 l droppe vid 15 ° CO / N.
  7. Tvätta 3 x 5 min i 0,05% BSA-TBS vid RT.
  8. Tvätta 2 x 5 min i ultrarent vatten.
  9. Mount repliken på Formvar belagda 100-line barr rutnät (Figur 4D).

6. Replika Analys

  1. Bild repliker med ett transmissionselektronmikroskop (TEM) vid 80 eller 100 kV. Förvärva digitala bilder via en CCD (Charged Coupled Device) kamera.
  2. Offline, hitta motsvarande regioner på bilder från båda repliker som använder landmärken (Figur 4E). Analysera digitala bilder med hjälp av Image J. Bestäm postsynaptisk område och antalet immunogold märkta partiklar riktade mot receptorn analyseras.


Figur 4. immunomärkning av Replica.
(A) Verktyg för att manipulera och tvättning av repliker. En keramisk 12-brunnar (överst till höger) och 2 typer av glaspipetter (uppe till vänster). Glaspipett med rund spets (nederst till vänster) används för att överföra replik, och pipetten med platinastav (längst ner i mitten) används för att veckla ut repliker. En replik i tvättbuffert (nere till höger). (B) immunmärkningen av repliker utföres i droppar (30 | il) placeras på en liten bit av parafilm i en brunn i en vävnadsodlings 6-brunnar. Notera att en replik är täckt av ett släpp av buffert innehållande antikroppar. För att förhindra avdunstning, är en fuktad bit papper inpassad runt den inre kanten av brunnen. (C) Incubator för immunmärkning steget. Inkubationer genomfördes vid 15 ° C. (D) En replik monterad på ett Formvar-belagda 100-linje barr rutnät. (E) låg förstoring mikrofotografier från ett par av repliker. De streckade kvadraterna visar tre typiska landmärken för att identifiera en plats i motsvarande repliker. Skala bar: 10 pm. Alla data visas som medelvärde ± sem Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

Den FRIL teknik, i kombination med uttryck av optogenetic ställdon av mikrobiellt ursprung 21, det vill säga kanaler integrerade i plasmamembranet och effektivt transporteras anterogradely längs axoner, gör det möjligt att undersöka kvantitativt postsynaptiska uttryck av AMPA-skivor och NMDA-R vid en definierad undergrupp av synapser. Detta visas här för axoner härrör från distinkta thalamus kärnor (t.ex. PIN / MGN) på ITC nervceller i amygdala. På så sätt kan en molekylär analys av enskilda sinnesintryck synapser på ITC nervceller, en grupp av celler som har varit okänsliga för en detaljerad anatomisk och molekylär karaktärisering hittills.

Fyra veckor efter stereotaktisk injektion av rAAV-ChR2-YFP i PIN / MGN, ChR2-YFP-positiva axoner tätt innerverad LA, det amygdalostriatal övergångsområdet (Astria) och den mediala paracapsular I TC kluster i amygdala, ett mönster helt i linje med tidigare spårning studerar 16, 22. Vi upptäckte också intensiv guld immunmärkningen för ChR2-YFP på P-face av axoner och terminaler i frysfraktur replik från rAAV-ChR2-YFP- injicerade möss (figur 5A), men inte i repliker från icke-injicerade möss. Det postsynaptiska membranet specialisering av glutamaterga synapser i en replik kan observeras som ett kluster av intramembrane partiklar (IMP) på E-ytan av plasmamembranet 2, 23, och åtföljs ofta av P-ansikte sin presynaptiska plasmamembranet 7 (figur 5B-C). Dessa funktioner får identifiera den postsynaptiska specialisering av glutamaterga synapser bildas av PIN / MGN axon terminaler (Figur 5 och 6). Vi märkt AMPA-skivor med en antikropp som känner igen alla fyra subenheter (GluA1-4), medan NMDA-R detekterades med användning av en antikropp mot det väsentliga NR1 subenheten.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> På grund av bristen på verktyg för att upptäcka om samma replik om dessa synapser gjordes med Dendritutskotten eller axlar av ITC nervceller, märkt vi motsvarande replik ansikte för μ opioidreceptorer, som ITC neuroner uttrycker postsynaptiskt höga nivåer av dessa receptorer 24. obligatoriskt Detta identifiering av samma postsynaptiska profiler i de två kopior (Figur 5C-F och Figur 6A-D) med hjälp av en strategi som använder landmärken (Figur 4E) .

figur 5
Figur 5. Upptäckt av ChR2-YFP och jonotropa glutamatreceptorer på Replica av immunoguld partiklar. (A) En kors brutna axonet terminalen (ljusblå) och små delar av dess P ansikte märkt med 15 nm guldpartiklar upptäcka ChR2-YFP. I terminalen, membran of många synaptiska blåsor kan observeras (sv). Notera specificiteten hos immunmärkningen till stor del begränsad till plasmamembranet. Märkning av ChR2 identifierar terminalen som har sitt ursprung från PIN / MGN. Terminalen bildar en asymmetrisk synaps med en ryggrad. Det postsynaptiska membranet specialisering (PSD) på E-ansikte visar en karakteristisk kluster av intramembrane partiklar och är märkt med 5 nm guldpartiklar som avslöjar AMPA-skivor. (B) P-ansiktet av en ChR2-uttryckande axonet (märkt med 15 nm guldpartiklar) visas gränsar två dendriter, en av dem som har två PSD märkta med 5 nm guldpartiklar som avslöjar NMDA-skivor. (CD) motsatta ytor av pre-och postsynaptiska membran av en PIN / MGN-ITC synaps. (C) P ansikte av terminalen uttrycker ChR2 (märkt med 15 nm guldpartiklar) och sträcker sig över E-ansikte två dendritiska axlar, en av dem innehåller två PSD märkta för AMPA-skivor (5 nm guldpartiklar). ( (EF) förstorade vyer av de områden som anges av de streckade linjerna. Skala barer. 500 nm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Immunoparticles för AMPA-skivor i PIN / MGN-ITC synapser befanns hela IMP klustret, vilket tyder på en homogen fördelning inom postsynaptiska specialisering (Figur 5E). En signifikant högre (oparat t-test p <0,018) densitet av AMPA-R-märkning observerades i PIN / MGN synapser på ITC ryggar (715 ± 38 guldpartiklar / xm 2, n = 32) jämfört med synapser på ITC dendriter (590 ± 44 guldpartiklar / xm 2, n = 32). Sammantaget tätheten av AMPA-skivor i PIN / MGN-ITC synapser visade en relativt lågvarians (variationskoefficient, CV = 0,37) förenliga med en homogen fördelning.

Immunoparticles för NMDA-skivor i PIN / MGN-ITC synapser ofta observerats ojämnt fördelade inom postsynaptiska IMP kluster (Figur 5B). Densiteten hos NMDA-R märkning var liknande (oparat t-test p = 0,39) mellan PIN / MGN synapser på ITC ryggar (1070 ± 153 guld partiklar / xm 2, n = 8) och ITC Dendrites (812 ± 183 guldpartiklar / ^ m 2, n = 9). Till skillnad från vad som observerades för AMPA-skivor, var tätheten av NMDA-R i PIN / MGN-ITC synapser mycket varierande (CV = 0,54).

figur 6
Figur 6. AMPA-R och NMDA-R immunmärkningen på identifierade PIN / MGN-ITC synapser.
(AB) motsatta ytor av pre-och postsynaptiska membran av en PIN / MGN-ITCsynaps gjort på en dendritiska ryggraden i vilken P ansikte av terminalen uttrycker ChR2 (märkt med 15 nm guldpartiklar) och PSD till en dendritiska ryggraden är märkt för AMPA-skivor (5 nm guldpartiklar). (CD) förstorade vyer av de områden som anges av den streckade linjen. Dessa områden har vridits ca 45 ° moturs för att möjliggöra en bättre bild av PSD. (E) Scatterplots av antalet AMPA-R partiklar kontra synaptiska område i ITC ryggar och dendriter. I båda strukturerna har en positiv korrelation observerats. (F) Scatterplots av antalet NMDA-R partiklar mot synaptiska område i ITC ryggar och dendriter. En signifikant positiv korrelation upptäcktes endast i Dendritutskotten. Skala barer. 500 nm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Därför attP-ytan av presynaptiska plasmamembranet ofta överlagras delvis postsynaptiska IMP klustret, kan vi uppskatta den synaptiska området endast 30% av synapserna (spines: betyda området 0,032 um 2, intervall: 0,007-0,063 um 2, n = 8, dendriter: 0,047 um 2, intervall: 0,024 till 0,166 um 2, n = 11). Dessa var i samma intervall som tidigare analyserats telencephalic glutamaterg synapser 25.

I båda ryggar och dendriter, har antalet guld immunoparticles för AMPA-skivor i enskilda synapser positivt korrelerad med den synaptiska området (Spearman, ryggar: r = 0,88, dendriter: r = 0,60, p <0,0001) (Figur 6E). Däremot var antalet guld immunoparticles för NMDA-skivor visat sig korrelera med den synaptiska området i ryggar (Spearman, ryggar: r = 0,90, p <0,002) men inte i dendriter (r = 0,21, p = 0,29) (Figur 6F ).

Discussion

Frys fraktur-elektronmikroskopi har varit en viktig teknik i ultra forskning i över 40 år. Men bristen på effektiva sätt att studera den molekylära sammansättningen av membran producerat en betydande nedgång i dess användning. Nyligen har det varit en stor väckelse i frysfrakturelektronmikroskop på grund av utvecklingen av effektiva sätt att avslöja integralmembranproteiner genom immunogold märkning 1, 2, nämligen FRIL tekniken.

Den FRIL tekniken besitter flera fördelar jämfört med andra immunogold ultra metoder. Först, proteiner är lätt tillgängliga för antikroppar som ökar känsligheten. För det andra, exponering av stor del av plasmamembran inriktningar, såsom det postsynaptiska membranet, på den tvådimensionella ytan på replika tillåter inspektion av den rumsliga fördelningen och fysiska omedelbar närhet av molekyler av intresse utan mödosam och tidskrävande ombyggnad av serial ultratunna sektioner. För det tredje ökar antalet proteiner som kan märkas för varje enskild struktur, som tillhandahålls lämpliga antikroppar är tillgängliga tillgängligheten av båda halvorna av plasmamembranet. Vid spräckning, är den hydrofoba ytan av den delade membran belagt med kol-platina som befäster proteindomäner som finns kvar på den brutna ytan. Detta förhindrar åtkomst av antikroppar mot antigener i dessa områden. Till exempel på P-ytan av en replik endast epitoper som vetter mot protoplasmautrymmet kan detekteras genom antikroppar, medan å E-face endast epitoper som vetter mot exoplasmic utrymmet kan bindas av antikroppar (se Figur 2).

Å andra sidan, den FRIL tekniken lider också av vissa begränsningar 2. Som frakturer inträffar slumpmässigt, kan det vara svårt att inrikta sig på specifika celler eller strukturer. Detta kan också leda till en samplings bias, till exempel, i synapsen samling, med tanke på de olika sannolikheten för fracturing längs membranet av strukturer med olika krökning (t.ex., ryggar kontra axlar). Dessutom är fördelningen av membranproteiner till ett av de två ytorna oförutsägbar. Därför, fördelningen av ett protein till P-ansikte eller E-ansikte, i synnerhet för kvantitativa studier, bör vara noggrant undersökt med användning av antikroppar som är reaktiva till intracellulära och extracellulära domäner. Slutligen, identifiering i repliken av vissa strukturer, såsom presynaptiska axon terminaler kan vara svårt när endast baseras på morfologiska egenskaper. Emellertid till användningen av specifika antikroppar för markörproteiner eller transduktion av etiketteintegrala membranproteiner eller kanaler med hjälp av virala vektorer erbjuder ytterligare verktyg underlätta identifieringen av de brutna membran. Till exempel tog denna studie fördel av transduktion av ChR2-YFP i talamiska nervceller att identifiera sina axonala efferents i amygdala eller märkningen för μ-opioidreceptorer att avslöja postsynaptiska migmbranes av ITC nervceller.

För att utföra FRIL teknik framgångsrikt, bör särskild försiktighet iakttas om vävnadsfixering. Stark vävnadsfixering (> 2% paraformaldehyd) kan resultera i en hög hastighet av korsfrakturer och en minskning i märkning känslighet. Å andra sidan, svaga upptagningar göra hanteringen vävnad och preparat (t.ex., kapning av sektioner) svår. Det är också viktigt att kontrollera att tjockleken på de trimmade blocken motsvarar tjockleken hos den dubbelsidiga tejpen. Om tjockleken hos provet är lägre än den för bandet, kan ytorna hos vävnaden inte fäster vid ytan av de två metall bärare, är följaktligen de frysta provet inte brutna. Om vävnaden är tjockare, kommer det att komprimeras med oundvikliga strukturella snedvridningar när sandwich av de två kopparbärare görs. Temperaturen vid vilken provet frakturer (i detta protokoll, -115 ° C) spelar också en viktig rollpå strukturen i repliken. Högre temperaturer kan ge en högre frekvens av artefakter såsom kondensation av vattenånga på ytan av vävnaden före eller under avdunstning. Lägre temperaturer (<-125 ° C) kan öka risken för avspjälkning av materialet under sprickbildning. Detta material kan falla på ytan av provet eller hålla kontakten med den. Dessa flingor av material är också belagd och kontrasterade producerar mörka fläckar på bilden. Sprickbildning vid lägre temperaturer kan också påverka frekvensen av korsfrakturer särskilt för små fina strukturer såsom Dendritutskotten. Ett ytterligare kritiskt steg vid framställningen av kopior är detergenten-digestion. Om matsmältningen är ofullständig, visas osmält vävnad som mörka fläckar på kopian, confounding analysen av strukturen på TEM. Dessutom osmält vävnad kan ospecifikt fånga eller binda antikroppar, vilket ökar bakgrunden märkning. Å andra sidan, användning av detergents för vävnads matsmältningen kan denaturera molekylerna är associerade till repliken förändra deras sekundära och tertiära strukturer. Därför, för vissa antigener kan det vara nödvändigt att successivt späda ut koncentrationen av SDS med ytterligare tvättsteg.

För immunomärkning, tillgången på olika storlekar av guldpartiklar konjugerat till sekundära antikroppar gör det möjligt att upptäcka samtidigt, men endast kvalitativt flera proteiner, även i specifika mikrodomäner av plasmamembranet, såsom postsynaptiska specialisering. Men på grund av steriskt hinder, kvantitativa studier är i allmänhet begränsade till påvisande av bara en molekyl. Storleken på guldpartikel kan också påverka effektiviteten märkning.

För tolkningen av märkningen i FRIL, bör man hålla i minnet att immunogold partikeln kan placeras var som helst inom en halvsfär med en radie av 20-25 nm från antigen på grund av den flexibla komplex formed av den primära och sekundära antikroppen 26. För ytterligare information om teori och praktik FRIL och relaterade tekniker, vi hänvisar läsaren även andra metodologiska artiklar 27, 28.

Den FRIL teknik har nyligen använts för högupplösta kvantitativa analyser av glutamatreceptor lokalisering i olika synaps populationer 29, 30. Dessutom känslighet FRIL teknik för AMPA-R upptäckt uppskattades så hög som en immunogold partikel per en funktionell AMPA -R kanal 29. Således är detta tillvägagångssätt överlag mycket användbar för att kvantifiera och analysera mönstret av postsynaptiska uttryck av AMPA-skivor och NMDA-R på central synapser. Här visade vi dess tillämplighet på PIN / MGN-ITC synapser, en webbplats troligen viktigt för att vidarebefordra USA information under rädsla konditione. Användning av en antikropp som tagits fram mot de kraftigt konserverade extracellulära aminosyrarester av de AMPA receptorsubenheter GluA1-GluA4, fann vi en jämn fördelning av guldpartiklar inom IMP kluster motsvarar postsynaptiska membran inriktningar. Densiteten hos AMPA-skivor i ITC ryggar var betydligt högre jämfört med axel synapser som omfattas av PIN / MGN talamiska afferenter. På båda ryggraden och axel synapser, var en positiv korrelation mellan märkning av AMPA-R och postsynaptiska område detekteras Gemensamt för andra glutamaterga synapser 25. Den låga variationen i täthet av AMPA-skivor i PIN / MGN-ITC synapser visar en homogen fördelning liknar andra synapser bildas av talamus efferents 7, men skiljer sig från kortikala synapser 25. Omvänt var tätheten av NMDA-R mer varierande och skilde sig inte mellan ryggraden och axel synapser tyder på en annan reglering än AMPA-skivor. I framtiden kommer den höga reproducerbarhet av FRIL tekniken inte bara göra det möjligt att bedöma de basala molekylära sammansättningen av centrala synapser, men kan underlätta detektion av cHanges i jonotropa glutamatreceptorantalet och subsynaptic fördelning efter rädsla lärande kompletterar ex vivo inspelningar av pre-och postsynaptiska egenskaperna hos dessa ingångar.

Sammanfattningsvis kan detta tillvägagångssätt användas av andra forskare att få en inblick i struktur-funktionssamband av input-specifika excitatoriska synapser i många andra nervbanor där befria den ursprung ingångar samt arten och sammansättningen av postsynaptiska element är avgörande men problematisk .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Stereotactic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectants
Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointments
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Name Company Catalog Number Comments
Tissue preparation
Paraformaldehyde EM grade Agar Scientific Ltd., United Kingdom AGR1018
Saturated picric acid solution Sigma-Aldrich, USA P6744-1GA
Na2HPO4-2H20 Merck Millipore, Germany 1065860500
NaH2PO4-2H2 Merck Millipore, Germany 1063451000
NaCl Merck Millipore, Germany 1064041000
4N NaOH Carl Roth, Germany T198.1
Thiopental Sandoz, Austria 5,133
Glycerol Sigma-Aldrich, USA G5516-500ML
GenPure ultrapure water system Thermo Fisher Scientific, USA 50131235
Peristaltic pump ISMATEC, Germany ISM 930C
Filter Paper MACHEREY-NAGEL, Germany MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S Leica Microsystems, Austria
Ophthalmic scalpel Alcon Laboratories, USA can be replaced by other ophthalmic scalpels
Perfusion cannula Vieweg, Germany F560088-1 can be replaced by similar items from other companies
Name Company Catalog Number Comments
High-pressure  Freezing
Copper carriers Engineering Office M. Wohlwend, CH 528
Sidol Polish Henkel, Germany can be replaced by same item from other companies
Chamois skin Household supply store
Hole punch, 1,5mm Stubai, Austria can be replaced by same item from other companies
Denatured ethanol Donauchem, Austria can be replaced by same item from other companies
Acetone Roth, Germany 9372.5 CAUTION!
High Pressure Freezing Machine HPM 010 BalTec, CH; now Leica Microsystems HPM010 not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100
Stereo-microscope Olympus, Japan SZX10
Liquid nitrogen CAUTION!
Cryo-vials Roth, Germany E309.1 can be replaced by same item from other companies
CryoCane Nalge Nunc International,USA 5015-0001 can be replaced by same item from other companies
CryoSleeve Nalge Nunc International,USA 5016-0001 can be replaced by same item from other companies
Liquid nitrogen storage vessel Cryopal, France GT38 can be replaced by same item from other companies
Non-ionic detergent (Lavocid) Werner & Mertz Professional, Germany
Name Company Catalog Number Comments
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1 JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany SANDURET 2-K can be replaced by same item from other companies
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21µ JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany 955932
Freeze Fracture System BAF 060 BalTec, CH; now Leica Microsystems BAF060
Ceramic 12 well plate Gröpel, Austria 14511 can be replaced by same item from other companies
Trizma base SIGMA, USA T1503 can be replaced by same item from other companies
Trizma hydrochloride SIGMA, USA T3253 can be replaced by same item from other companies
Sodium chloride Merck, Germany 1,064,041,000 can be replaced by same item from other companies
SDS, Sodium lauryl sulfate Roth, Germany 5136.1 CAUTION! ;  can be replaced by same item from other companies
Sucrose Merck, Germany 1,076,871,000 can be replaced by same item from other companies
TRIS Roth, Germany 5429.3 can be replaced by same item from other companies
Universal Hybridization Oven Binder, Germany 7001-0050 can be replaced by same item from other companies
Name Company Catalog Number Comments
Immunolabelling
BSA SIGMA, USA A9647 can be replaced by same item from other companies
Anti-GFP Antibody Molecular Probes, USA A11122
Anti-pan-AMPAR Antibody Frontier Institute, Japan pan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 Merck Millipore, Germany MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody ImmunoStar, USA 24216
EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody BBInternational, UK EM.GAG5
EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody BBInternational, UK EM.GAR15
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody AURION, Netherlands DAR 10nm
Copper grids, 100 Parallel Bar  Agar scientific, UK G2012C
Incubator Major Science, USA MO-RC can be replaced by same item from other companies
Pioloform Powder  Agar scientific, UK R1275
Chloroform Roth, Germany 3313.1 CAUTION! ;  can be replaced by same item from other companies
Name Company Catalog Number Comments
EM analysis
Philips CM120 TEM Philips/FEI
Morada CCD camera Soft Imaging Systems, Germany
iTEM Ver. 5.2, imaging software Soft Imaging Systems, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fujimoto, K. SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application. Histochem Cell Biol. 107, (2), 87-96 (1997).
  2. Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr Opin Neurobiol. 17, (3), 387-393 (2007).
  3. Rash, J. E., Yasumura, T. Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis. Cell Tissue Res. 296, (2), 307-321 (1999).
  4. Emes, R. D., Grant, S. G. Evolution of synapse complexity and diversity. Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).
  5. Matsuzaki, M., et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nat Neurosci. 4, (11), 1086-1092 (2001).
  6. Rollenhagen, A., Lübke, J. H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function. Cell Tissue Res. 326, (2), 221-237 (2006).
  7. Tarusawa, E., et al. Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses. J Neurosci. 29, (41), 12896-12908 (2009).
  8. Nusser, Z., et al. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, (3), 545-559 (1998).
  9. Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus. Neuroscience. 119, (2), 347-363 (2003).
  10. Nicholson, D. A., Geinisman, Y. Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Comp Neurol. 512, (3), 399-418 (2009).
  11. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  12. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  13. Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala. Nat Neurosci. 13, (4), 489-494 (2010).
  14. Duvarci, S., Pare, D. Amygdala microcircuits controlling learned fear. Neuron. 82, (5), 966-980 (2014).
  15. Jüngling, K., et al. Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala. Neuron. 59, (2), 298-310 (2008).
  16. Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  17. Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).
  18. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  19. Sigurdsson, T., et al. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  20. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  22. Bienvenu, T. C. M., et al. Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information. J. Neurosci. 35, (5), 2044-2057 (2015).
  23. Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes. Brain Res. 41, (1), 1-16 (1972).
  24. Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction. Nature. 454, (7204), 642-645 (2008).
  25. Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression. Curr Opin Neurobiol. 22, (3), 446-452 (2012).
  26. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16, (7), 798-804 (2013).
  27. Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Cavalier, A., et al. CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).
  28. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nat Protoc. 2, (3), 547-576 (2007).
  29. Tanaka, J., et al. Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum. J Neurosci. 25, (4), 799-807 (2005).
  30. Mansouri, M., et al. Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex. Eur J Neurosci. 41, (2), 157-167 (2015).
Kombinerade optogenetic och Freeze-fraktur Replica immunomärkning att granska Input specifika Arrangemang av glutamatreceptorer i mus Amygdala
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schönherr, S., Seewald, A., Kasugai, Y., Bosch, D., Ehrlich, I., Ferraguti, F. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (110), e53853, doi:10.3791/53853 (2016).More

Schönherr, S., Seewald, A., Kasugai, Y., Bosch, D., Ehrlich, I., Ferraguti, F. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (110), e53853, doi:10.3791/53853 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter