Abstract
Fryse-fraktur elektronmikroskopi har været et stort teknik i ultrastrukturel forskning i over 40 år. Men manglen på effektive midler til at studere den molekylære sammensætning af membraner produceret et markant fald i brugen. For nylig har der været en stor vækkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopiske takket være udviklingen af effektive måder at afsløre integrale membranproteiner ved immunoguld mærkning. En af disse metoder er kendt som vaskemiddel-opløst Freeze-fraktur Replica immunolabeling (FRIL).
Kombinationen af FRIL teknik med optogenetics giver en korreleret analyse af de strukturelle og funktionelle egenskaber af centrale synapser. Ved hjælp af denne metode er det muligt at identificere og karakterisere både præ- og postsynaptiske neuroner ved deres respektive udtryk for en kodet channelrhodopsin og specifikke molekylære markører. Det karakteristiske udseende postsynaptiske membran specialisering af glutamaterge synapser muliggør endvidere, ved mærkning af ionotrope glutamatreceptorer, at kvantificere og analysere intrasynaptic fordeling af disse receptorer. Her giver vi en trin-for-trin beskrivelse af de procedurer, der er nødvendige for at forberede parret replikaer, og hvordan man immunolabel dem. Vi vil også diskutere de forbehold og begrænsninger FRIL teknik, især dem der er forbundet med potentielle prøveudtagning bias. Den høje reproducerbarhed og alsidighed FRIL teknik, når det kombineres med optogenetics, tilbyder en meget kraftfuld tilgang til karakterisering af forskellige aspekter af synaptisk transmission på identificerede neuronale mikrokredsløb i hjernen.
Her giver vi et eksempel, hvordan denne fremgangsmåde blev anvendt til at opnå indsigt i struktur-funktionsforhold af excitatoriske synapser på neuroner i det indlejrede cellemasser af muse amygdala. Især har vi undersøgt ekspressionen af ionotrope glutamatreceptorer på identificerede indgange elleriginated fra thalamiske posterior intralaminære og mediale geniculate kerner. Disse synapser viste sig at viderebringe sensorisk information relevant for frygt læring og at undergå plast ændringer på frygt condition.
Introduction
Definitionen af den funktionelle arkitektur biomembraner på nanometer skala er blevet udfordret i de seneste år med udviklingen af en række immunolabeling teknikker egnet til transmission elektronmikroskopi. Men disse teknikker, fx før og efter embedding immunogold, har en række vigtige begrænsninger, der indbefatter dårlig detektion af antigener og / eller begrænset kvantitativ vurdering af membranbundne proteiner. Disse begrænsninger bliver særlig kritisk i forbindelse med undersøgelsen af den fine struktur af nervesystemet, som er kendetegnet ved en høj grad af celle mangfoldighed og synapse heterogenitet. Denne uensartethed skyldes både strukturel og funktionel diversitet dikteret af præ- og postsynaptiske elementer og ved den differentielle ekspression, berigelse eller interaktion af signalproteiner, såsom receptorer, transportører og effektormolekyler.
En ny tilgang til direkte immunolabeLing af integrerede eller tværbunden membranproteiner i vaskemiddel-opløst fryse-fraktur replikaer (FRIL) blev oprindeligt introduceret af Fujimoto to årtier siden en. Denne oprindelige metode havde imidlertid flere begrænsninger, dvs. alvorlig fragmentering af replikaer, som har begrænset meningsfulde korrelationer af mærkede molekyler med individuelt kortlagte celler i komplekse væv, såsom hjernen. Ca. 10 år siden, Shigemoto og Fukazawa gradvist forbedret teknik 2. Dette blev modsvaret af indsatsen fra en anden gruppe af forskere ved de Boulder laboratorier Colorado State University, der også væsentligt forbedret den teknik, især for studiet af gap junctions 3.
Forbedringen i fryse-frakturering protokoller og maskiner, samt indførelsen af hurtig nedfrysning (under højt tryk), nu giver efterforskerne til at producere ubrudt kopier af eksemplarer af relativt store størrelse og high kvalitet billeder af de fleste cellulære komponenter uden de begrænsninger og artefakter produceret af stærke kemiske optagelser.
Den FRIL teknik giver den store fordel af en yderst kvantitativ in situ identifikation af et eller flere proteiner (samtidig) i histologisk kortlagt og cytologisk identificerede celler i komplekse væv, såsom hjernen, med den yderligere fordel, en plan afbildning af præ- og postsynaptiske elementer i en enkelt kopi. Derfor FRIL teknik, på trods af sine mange tekniske forhindringer, giver løfte om en række meget betydelige videnskabelige gennembrud, især for korrelationen af strukturelle og funktionelle egenskaber af de enkelte synapser. I løbet af de sidste årtier, har en hel del oplysninger er indhentet på strukturen, molekylære fyldes op, og fysiologiske funktion af synapser; endnu synapser er morfologisk og molekylært meget forskelligartede afhængigt før og postsynaptiske paleje neuroner 4. Kun for en håndfuld af synapse typer var struktur og funktion undersøgelser gennemført hidtil 5-7. Det var for det meste på grund af tekniske begrænser, der forhindrede en præcis identifikation af arten af de præ- og postsynaptiske elementer.
Ultrastrukturelle analyse har givet kritiske indsigt i variabiliteten af postsynaptiske membran specialiseringer tværs distinkte synaptiske kontakter både hvad angår synaptisk størrelse og indhold i neurotransmitterreceptorer 6, som har en stor indflydelse på styrke og plasticitet synaptisk transmission. Ydermere er en stor mængde forskning antyder, at antallet af ionotrope glutamatreceptorer udtrykt ved forskellige typer af synapse reguleres i en afferent- og target-afhængig måde 7-10.
Her er en metode skitseret, der tillader analyse af strukturen og receptor sammensætning af postsynaptiske membran specialiseringer med Acceptér definered præsynaptiske elementer og funktion. Denne fremgangsmåde drager fordel af præsynaptisk ekspression af nyligt udviklede lysfølsomme alge- proteiner, såsom channelrhodopsin2 (CHR2), og af FRIL teknik til at analysere mønsteret af postsynaptiske ekspression af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-R) og N-methyl-D-aspartat (NMDA-R'er) glutamatreceptorer. Dette demonstreres ved synapser dannet af axoner oprindelse fra den bageste thalamiske-mediale geniculate kerner (PIN / MGN) på neuroner i det indlejrede cellemasser af amygdala (ITC). ITC neuroner er små tornede GABAerge celler organiseret i klynger omkring basolaterale amygdaloidkomplekset (BLA) 11, 12. ITC neuroner er kendt for at modtage stimulerende input fra BLA vigtigste neuroner og målrette den centrale kerne (CEA), og dermed fungerer som en hæmmende gate for informationsstrømmen mellem BLA og CEA 12-15.
For nylig demonstrerede vi, at detC neuroner beliggende i den medio-dorsale klynge mellem BLA og CEA får også direkte og konvergente excitatoriske input fra sensoriske thalamiske og tidsmæssige kortikale regioner, som er modificeret på frygt læring under pavlovsk auditive frygt condition 16. Frygt condition er en af de bedst forståede former for associativ læring i form af hjernen mekanismer. I frygt condition, en oprindelig neutral betinget stimulus (CS, fx en tone) er parret med et afskrækningsmiddel ubetinget stimulus (US, fx en mild mund chok), hvilket resulterer i en CS-amerikansk forening og betinget frygt reaktion 17, 18. Excitatorisk input fra både thalamiske og neocorticale områder, som bærer information, der repræsenterer CS og USA henholdsvis var kendt for at konvergere på pyramideformede neuroner i den laterale kerne af amygdala (LA) og til at gennemgå plasticitet 19. Vores tidligere arbejde viste, at sanseindtryk oplysninger også i parallel videresendes til ITC neuroner Som et første skridt i retning af en mekanistisk molekylær analyse af individuelle sanseindtryk synapser på ITC neuroner, brugte vi en adenoassocieret virus (AAV) at udtrykke CHR2 mærket med gult fluorescerende protein (YFP). AAV blev injiceret i PIN / MGN og axonterminaler blev identificeret ved deres ekspression af CHR2-YFP. Vi brugte begge sider genereret af FRIL teknik til at vurdere tætheden af postsynaptiske AMPA-R og NMDA-R'er på synapser dannet med ITC neuroner ved PIN / MGN Axon terminaler.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Regierungspraesidium Tübingen, delstaten Baden-Württemberg, Tyskland, og af den østrigske dyreforsøg Ethics Board, og var i overensstemmelse med EU-direktiv om anvendelse af dyr til forskning.
1. stereotaktisk injektion af AAV-Channelrhodopsin2-YFP
BEMÆRK: stereotaktisk injektioner blev udført ifølge en tidligere offentliggjort protokol 20.
- Fremstille sterile redskaber ved opvarmning ved 180 ° C i 1,5 timer.
- Træk skarpe (~ 50 um diameter) glas pipetter til injektioner med en horisontal mikroelektrode aftrækker sæt med følgende parametre: Heat = Rampe værdi - 20, Pull = 0, Velocity = 100, Time = 200, Pressure = 200.
BEMÆRK: Rampe værdi skal bestemmes for hvert parti af indkøbte glas pipetter i henhold til instruktionerne fra mikropipetten aftrækker producenten. - Premix 1 pi virus opløsning og 0,2 pi 0,1% fast green opløsning (for bedre synlighed af opløsningen i glaspipette) i steril phosphatbuffer saltvand (PBS; 25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4). Fyld glaspipette ved anvendelse af en 10 pi pipette og gel-fil tips. For den virale konstruktion, brug rAAV-hSyn-CHR2 (H134R) -eYFP (serotype 2/9).
- Bedøver musen med en lille dyr anæstesi indretning (3% isofluran i oxygen til induktion). Brug. Til denne undersøgelse bruge 3 vildtypemus alderen ~ 6 uger.
- Shave hoved mellem ører og øjne og desinficere med en povidon-jod baseret løsning.
- Påfør et øje salve for at forhindre udtørring af øjne under bedøvelse. Subkutant injicere mus med analgetiske (meloxicam-baseret, 0,1 ml af en 5 mg / ml opløsning).
- Placer musen i stereotaktisk ramme og opretholde anæstesi via en gas anæstesi indretning (2% isofluran i oxygen til vedligeholdelse). Check anæstesi dybde af mangel på en tilbagetrækning lemmerrefleks, før du fortsætter.
- Opretholde sterile betingelser som bedst muligt under hele kirurgiske procedure. Bær en engangs ansigt-maske, en kirurgisk kjole og handsker.
- Lav en hud snit på ca. 1 cm på toppen af hovedet med en saks 20. Træk forsigtigt huden til siden ved hjælp af stumpe pincet, fix med klemmer til at eksponere kraniet overflade og ren kranium med H 2 O 2.
- Mark injektionssteder på kraniet ved hjælp af en fin spids permanent markør. Bore et lille hul (ca. 1 mm i diameter) i kraniet på det markerede sted. For ensidig PIN / MGN injektion i denne stud, bruge følgende koordinater: fra bregma (mm): posterior 3.0, laterale ± 1,8, ventral 3.8.
- Mount fyldt glaspipette på stereotaktisk ramme forbundet til et tryk injektionsanordning og bringe pipetten til bregma position.
- Bræk spidsen af glaspipette med fint lige spids pincet. Sørg for, at pipettespids er åben ved applyinga par trykimpulser og observere ekstrudering af dråber virusopløsning.
- Gå til den ønskede injektion koordinater og injicere halvdelen af pipetten indhold (~ 0,5 ul) ved hjælp af følgende indstillinger på tryk indsprøjtning enhed: tryk 20 psi, gennemsnitlig puls længde 30 ms, gennemsnitlige antal impulser 50.
- Efterlad pipette på plads til ~ 1 min før langsomt (1 mm / min) tilbagetrækning den.
- Ren skull med PBS (pH 7,4) og fjern klemmer. Træk forsigtigt huden sammen, og sutur snittet (3 - 4 knob). Påfør desinfektionsmiddel (povidon-iod baseret) omkring såret.
- Stop anæstesi og ikke forlader musen uden opsyn indtil helt vågen. Hold mus single-opstaldet. Postoperativt, fortsat overvåge sundhedstilstanden; om nødvendigt administrerer analgetikum.
- Hold dyr til 4 uger før hjernen fiksering for at sikre passende niveauer af viral udtryk.
2. Klargøring
- Brain fiksering </ Strong>
- Fremstilling af fiksativ
- For 1 I fiksativ afvejes 10 g paraformaldehyd og føje den til 300 ml deioniseret H2O Varme til 55 - 60 ° C for ~ 10 min med kontinuerlig omrøring.
- Sluk for varmen og tilsæt 7 - 8 dråber 4 N NaOH. Opløsningen skal være klar i ~ 10 min.
- Lad det køle af til stuetemperatur, tilsættes 150 ml af en mættet opløsning af Picrinsyre og bringe det til 500 ml med deioniseret H2O
- Der tilsættes 500 ml 0,2 M phosphatpuffer (PB). Filter med filtrerpapir. Indstil pH til 7,4 med NaOH.
- Afkøl fiksativ til 6 ºC, skal det opbevares i mørke glasflasker for ikke mere end én dag ved 6 ºC.
- Transcardiac perfusion
- Bedøver mus med en intraperitoneal injektion af thiopental (120 mg / kg legemsvægt). Sørg for, at dyret er dybt bedøvet ved at kontrollere pedal tilbagetrækning REFLex, som bør fraværende. Placer dyret på ryggen på en perfusion tabel med fire ekstremiteter bundet ned.
- Åbn bugvæggen længderetningen med stump-end saks og gøre yderligere to snit sideværts langs den kaudale grænse af brystkassen, at eksponere membranen. Skær væk mellemgulvet og skære bryst væg ved osteocartilageneous grænse på begge sider. Løft kaudale ende af den centrale plade af thorax væg indeholdende brystbenet at blotlægge hjertet.
- Fjern hjertesækken, lave en lille præcist snit i spidsen af venstre ventrikel til at indrømme kanylen af perfusion apparatet. Brug en stump kanyle med en indvendig diameter på 0,6 mm. Passerer kanylen forsigtigt gennem ventriklen indtil spidsen vises i aorta ascendens og fastgør kanylen med en klemme. For at tillade blodet og perfusater at afslutte fra blodbanen, lave et snit i højre atrium.
- Perfundere mus transkardialt anvendelse af en peristaltisk pumpe med en strømningshastighedpå 5 ml / min ved først med PBS (25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4) i ca. 1 min, efterfulgt af isafkølet fiksativ i 7 min.
- Efter fiksering adskille Mouse hoved med en saks og derefter skære huden gennem midterlinjen fra hals til næsen. Fjern musklen til fuldt ud at eksponere kraniet.
- Ved hjælp af skarp saks, lave en langsgående snit gennem occipital og interparietal knogler startende fra foramen magnum. Brug fine pincet fjerne disse knogler til at eksponere hele lillehjernen. Så gør en anden langsgående snit gennem parietale og frontale knogler indtil den nasale knogler og fjerne dem med en pincet til at eksponere hele hjernen.
- Ved hjælp af en spatel fjerne hjernen uden at beskadige den, og læg den i iskold 0,1 M PB.
- Fremstilling af fiksativ
- Sektionering og trimning af prøverne
- Skær en coronal blok på ca. 5 - 6 mm med barberblade indeholdende det interessante område. Lim det på holderen afden vibroslicer med en cyanoacrylatlim. Orientere vævsblokken så neocortex vender den vibrerende klinge. Skær koronale sektioner, indeholdende amygdala, ved 140 um med vibroslicer (figur 1A) i iskold 0,1 M PB, og samle dem i en 6-brønds skål i den samme buffer.
- Under et stereomikroskop, trim den region af interesse (her, den medio-dorsale paracapsular klynge af ITC, se figur 1B) fra skive. Gøre dette i en petriskål coatet med silicone-elastomer og fyldt med 0,1 M PB, ved anvendelse af en oftalmisk skalpel. Sørg for, at de trimmede blokke passer ind i hullet af afstandsstykket (ca. 1,5 mm) (figur 1B).
- Flyt trimmede blokke i kryobeskyttelse løsning (30% glycerol i 0,1 M PB) O / N ved 6 ºC.
3. High Pressure Nedfrysning
BEMÆRK: FRIL består af 6 væsentlige trin (figur 2): 1) Hurtig nedfrysning med højt tryk (ved 2300 - 2600 bar) af prøven. 2) Frakturering af prøven. Brudplanet følger generelt den centrale hydrofobe kerne af frosne membraner, opdele dem i to halve-membran foldere: en halv, der ligger ved siden af protoplasma (P-face) og en halv, der ligger op til det ekstracellulære eller exoplasmic rum (E- ansigt). 3) Replication af prøvemateriale ved vakuum-aflejring af platin og kulstof. 4) Detergent-fordøjelse af vævet. 5) immunguld mærkning. 6) Analyse af replika anvendelse af et transmissionselektronmikroskop.
- Fremstilling af kobber bærere
BEMÆRK: For at blive håndteret gennem de forskellige stadier af den FRIL procedure, skal monteres på metal (guld eller kobber) bærere prøver. Disse luftfartsselskaber varierer i størrelse og udformning i overensstemmelse med den tilstand af frakturering og typen af maskiner, der anvendes. Her brugte vi kobber luftfartsselskaber (figur 1B, E) og en hængslet "dobbelt replika table"; (se figur 3B), som når de åbnes frembringer en trækstyrke fraktur gennem de frosne prøve (figur 2). Dette gør det muligt at fastholde og replikere begge sider af frakturerede prøve.- Polske kobber luftfartsselskaber med en plette remover ved hjælp af en plade af vaskeskind hud.
- Placer bærere i et glas pot og ren to gange med et ikke-ionisk detergent (pH ~ 1,5) i et sonikerende vandbad, derefter grundigt vaske i postevand efterfulgt af deioniseret vand og derefter skylles to gange med ethanol.
- Sonikeres kobber bærere i acetone i 15 min.
- Placer bærerne på filterpapir til tørring.
- Vedhæft en ring af dobbeltklæbende tape til en kobber luftfartsselskab (figur 1C), der vil tjene som holder godt for den trimmede blok (holding luftfartsselskab).
- Indefrysning af prøven
BEMÆRK: Håndter flydende nitrogen med omhu og iført passende beskyttelsesbriller.- Tænd for højt tryk fripift enhed (figur 1F) mindst 1,5 time før start med modellen frysning.
- Start opvarmning ved at trykke på "AIR HEATER" knappen, og bages ud i 50 minutter. lufttemperatur indstillet til 80 ° C.
- Forbind nitrogentanken til det høje tryk frysning enheden og tryk på "nitrogenbundet" knappen for at udfylde indersiden Dewar med flydende nitrogen. De "KVÆLSTOF LEVEL" lyser. Start køling ved at trykke på "Køling" knappen.
- Tryk på "DRIVE IN" knappen, når "KVÆLSTOF LEVEL" slukker. Kontroller at det hydrauliske system bevæger stemplet frem og tilbage 3 gange.
- Tryk på "AUTO" knappen, og "NITROGEN" knappen. Så snart "READY" lyser, det høje tryk frysning enhed er klar til højtryk frysning.
- Anbring en trimmet blok i hullet af den dobbeltklæbende tape (figur 1B) med en platintråd løkke, som er blevet smeltet ind aglass pipette.
- Fjerne overskuddet af den kryobeskyttende opløsning ved hjælp filtrerpapir eller en børste.
BEMÆRK: Denne procedure er også vigtigt at fjerne luftbobler, der kan danne omkring vævet, og som kan forårsage forvrængning af vævet form og / eller ultrastruktur. - Under et stereomikroskop, dække bedrift bæreren med en anden bærer, således at vævet blok er indlagt mellem de to bærere.
- Sæt carrier-sandwich i prøveholderen af det høje tryk fryseenhed (figur 1D). Sæt præparatholderen i højtryk frysning enhed (tip ned) og fastgør det ved at skrue holderen prøven.
- Indled indefrysning cyklus ved at trykke på "Jet-Auto" -knappen. Arbejde så hurtigt som muligt, fjerne holderen prøven og nedsænkes spidsen med flydende nitrogen ind i en isoleret kasse. Fordybe spidserne af to par tænger i flydende nitrogen for at køle dem.
- Fjern forsigtigt the carrier-sandwich fra indehaveren af prøven og læg den i en præ-kølet kryohætteglas. Sørg for, at luftfartsselskaber kun håndteres med flydende nitrogen-afkølet pincet. Kryoglas bør være perforeret for at tillade nitrogen at strømme ud fra hætteglasset (figur 1G).
- Gentag trin 3.2.6 til 3.2.11, indtil alle de ønskede prøver er blevet indefrosset. Flere carrier-sandwich, der indeholder den samme type prøve kan opbevares i samme hætteglas.
- Opbevar kryoglas indeholder bærere i et cryotank indtil replikation (Figur 1 H).
Figur 1. Tissue Forberedelse og Højtryks-Frysning. (A) Vibroslicer bruges til afsnittet vævet. (B) En resulterende coronal musehjerne sektion indeholdende amygdala vist side om side med acopper bærer udstyret med en ring af dobbeltklæbende tape. Den stiplede kasse angiver det område af interesse, der indeholder den mediale paracapsular klynge af ITC. Diameteren af hullet i dobbeltsidede tape er cirka 1,5 mm. (C) Værktøj til udarbejdelse af kobber luftfartsselskaber. Fra øverst til venstre i urets måde: dobbeltsidede tape, pincet, puncher, kobber luftfartsselskaber, og saks. (D) Insertion af carrier-sandwich i prøveholder højtryk frysning. Luftfartsselskabet-sandwich placeres i hullet i holderen prøven. (E) Kobber luftfartsselskaber uden og med en ring af dobbeltklæbende tape og "carrier-sandwich". (F) højtryk fryseenhed med tryktank fodring flydende nitrogen til det. (G) En kryohætteglas at lagerføre de frosne væv. Bemærk hullerne i det øverste midterste position af hætteglasset tillader nitrogengas til at strømme ud af hætteglasset (pilespids).
4. Freeze-fraktur og replikering
- Forberedelse af elektronstrålekanoner
- Inden du sætter de elektronstrålekanoner, fjerne skjoldet med "deflektor plade". Placer "indstilling gauge" til centrering glødetråden i spændepatronen gennem den nederste katode dæksel.
BEMÆRK: større ende af indstillingen gauge diameter anvendes til kulstof pistol mens den mindre ende diameter er for platin pistol. - Skub den nye filament over målet, indtil "trykket lagene" kan klemme enderne af filamentet, der sikrer, at glødetråden spolen ikke ligger i en vinkel.
- Fjern indstillingen gauge og indsæt carbon stang. Løs det ved at spænde collet chuck af stangholdere fordamperen, hvilket sikrer, at højden af enden af stangen er i midten af den anden spole fra bunden. For platin gun, bør højden af enden af platin stang være på midten af den anden glødetråd spole fra toppen.
- Sæt deflektor pladen og indsætte kanoner i freeze fraktur enhed. Rengør kanoner med en sand-blaster efter brug.
- Inden du sætter de elektronstrålekanoner, fjerne skjoldet med "deflektor plade". Placer "indstilling gauge" til centrering glødetråden i spændepatronen gennem den nederste katode dæksel.
Figur 2. Illustration af de vigtigste skridt i FRIL Teknik.
Oversigt over de forskellige trin, der kræves til forberedelse og analyse af replika. (1) Højt tryk frysning af væv. (2) Frakturering. Under frakturering af frosset væv, er lipiddobbeltlaget af plasmamembraner opdelt i to halvdele på den hydrofobe interface. Proteiner i plasmamembranen fordeles på enten exoplasmic (E-face) eller protoplasmiske membraner (P-face). (3) Replication. Fordampningen af kulstof (C) fælder lipider og proteiner på overfladen af det brækkede væv. Materialet overtrækkes med 2 nm platin / carbon til shadowing ved en 60 ° vinkel, og derefter med en anden 15 nm carbon lag, som styrker strukturen af replika (C-lag, Pt-shadowing). (4) Solubilisering. Vævet ikke fanget af replika membranen solubiliseres derefter med SDS-opløsning. (5) Mærkning. Proteiner af interesse kan visualiseres på replika anvendelse af et komplekst fremstillet af specifikke primære antistoffer (Primary Ab) og sekundære antistoffer (sekundære ab) konjugeret med en guldpartikler (Au). Anvendelsen af forskellige størrelser af guldpartikler tillader påvisning af mere end et protein på samme replika. (6) Efter immunolabeling, er replikaer indsamles på kobber mesh net og analyseret med en transmissions elektron mikroskop ved 80 -. 100 kV venligst klikk her for at se en større version af dette tal.
- Opsætning af fryse fraktur enhed
- Tænd for freeze fraktur enhed (figur 3A) ved at dreje MAINS til 1. For en detaljeret beskrivelse af de fryse-fraktur og replikering procedurer, se betjeningsvejledningen fra producenten.
- Før afkøling af fryse-fraktur-enhed, bage ud hele kølesystemet af enheden med varm luft. Tryk på "Optøning" knappen i MTC 010-enheden (temperatur kontrolenhed) (figur 3A) og lad bage proces køre i 45 min.
- Aktivere vakuum station. Fastfrysningen fraktur enhed normalt opererer i et vakuum vifte af ~ 10 -6 - 10 -7 mbar.
- Fyld kvælstof tank og tilslut det til fryse fraktur enhed. Kontroller, at indehaveren af ventilen er tør og også rense posten af tanken før indsættelse af indehaveren ventilen (fugtighed kan forstyrre vacuum og angivelse af N2 fyldning af tanken).
- Start på afkøling ved at indstille temperaturen til -115 ° C. Afkøling tager ca. 45 min.
- Sæt elektronstrålekanoner og justere strøm og spænding for at nå de følgende parametre for fordampning:
Carbon pistol: rotation på, position 90 °, satsen for akkumulering af kulstof 0,1-0,2 nm / sek
Carbon-platin pistol: rotation fra, position 60 °, satsen for akkumulering 0,06-0,1 nm / sek
BEMÆRK: Hvis der anvendes en pistol for første gang efter ombytning af carbon eller platin stang, afgasses i 3 min før brug.
- Frakturering og replikation
- Indsæt frosne carrier-sandwich i dobbelt replika bordet og sørg alle manipulationer er udført i flydende nitrogen.
- Overfør dobbelt replika bordet til en Dewar fartøj og ordne det med modellen scenen modtageren i en vinkel på 45 °. Det kvælstof niveau væske skal altid være over dobbelt replika bordet. Saml den dobbelte replika tabellen med tabellen manipulator og indsætte det i fryse fraktur enheden på den kolde fase. Vent ca. 20 minutter for at tillade temperaturen af den dobbelt replika tabellen at justere til -115 ° C.
- Kontroller at vakuumet er under 10 -6 mbar, og temperaturen er -115 ° C.
- Fraktur vævet ved manuel drejning mod uret af hjulet tilsluttet afskærmningen placeret over dobbelt replika bordet. Når svøbet drejer, tvinger den dobbelte replika tabellen for at åbne, knusning vævet.
- Tryk på "High spænding" knappen i EVM 030-enheden (elektronstråle fordampning styreenhed) for indefrysningen fraktur enhed (figur 3A).
- Replikere de eksponerede overflader af det brækkede væv (figur 3C) ved inddampning af kulstof (roterende) ved hjælp af en elektronstråle pistol anbragt i en 90 ° vinkel til en tykkelse på 5 nm, efterfulgt af en ensrettet Shadofløj med platin-carbon ved en 60 ° vinkel til en tykkelse på 2 nm. Endelig anvende en 15 nm tykt lag af carbon fra en 90 ° vinkel (roterende).
- Brug følgende parametre for fordampning:
1. carbon: rotation på, position 90 °; hastighed 0,1 - 0,2nM / sek; 5 nm
2. kulstof-platin: position 60 °; hastighed 0,06 - 0,1 nM / sek; 2 nm
3. carbon: rotation på, position 90 °; hastighed 0,3 - 0,5 nM / sek; 15 nm - Fjern de replikerede prøver fra freeze fraktur enhed og overføre dem til en keramisk plade med 12 brønde (figur 4A) fyldt med TBS (Tris-bufret saltvand, pH 7,4).
- Med et platinoeje valsetråd, fjerne det replikerede væv fra prøvebæreren (figur 4A).
- Gentag trin 4.3.1 til 4.3.10, indtil alle prøver er blevet kopieret.
(A) Fryse fraktur enhed. Maskinen indeholder flere styreenheder og en monitor. Prøverne indføres i kammeret gennem en port på venstre side af kammeret. En tryksat nitrogen beholdervæske er forbundet til fryse fraktur enheden afkøle scenen. Billeder nedenfor viser forstørret udsigt over to af de enheder (UPC 010 og MDC 010) og skærmen viser parametre under fordampning af den anden kulstof lag. (B) Åbnet (til venstre) og lukkede (højre) udsigt over dobbelt replika bordet. De "bærer-sandwich" indsættes i spalterne i tabellen (angivet ved pile). De små arme forhindrer "carrier-sandwich" falde ud under manipulation. (C) En brækket og replikeres prøve. Replikaer vises som tynde sorte film på toppen af det brækkede væv.53 / 53853fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
- SDS-fordøjelse af replika
- Overførsel replika til en 4 ml glasbeholder fyldt med 1 ml SDS-fordøjelse puffer (2,5% natriumlaurylsulfat, 20% sucrose i 15 mM Tris, pH 8,3). Digest i 18 timer ved 80 ° C med omrystning (45 slag / min).
- Overførsel replikaer til et nyt rør fyldt med SDS-spaltningsbuffer og opbevares ved stuetemperatur.
5. immunolabeling
BEMÆRK: Alle inkubationer udføres ved stuetemperatur under forsigtig omrystning, undtagen for inkuberinger med antistoffer.
- Vask replika i 10 minutter i frisk SDS-spaltningsbuffer.
- Vask replika en gang med 2,5% BSA (bovint serumalbumin) i TBS i 5 min, og derefter 3 x 10 min med 0,1% BSA i TBS.
- Blokere ikke-specifikke bindingssteder i TBS med 5% BSA i 1 time.
- Anvend primære antiorganer fortyndet i 2% BSA-TBS. Udfør inkubationer i en 30 pi dråbe (figur 4B) i et fugtigt kammer ved 15 ° C i 72 timer (Figur 4C).
- Til denne undersøgelse proces både replikaer fra det brækkede væv. Der inkuberes en replika med et marsvin polyklonalt antistof rejst mod aminosyrerne 717 - 754 af muse GluR1 fælles for alle AMPA-R underenheder (fortynding: 1: 200) eller et monoklonalt muse-antistof rejst mod et rekombinant fusionsprotein, der omfatter aminosyrerne 660 - 811 af NR1-underenhed af NMDA-R (fortynding: 1: 500), og et polyklonalt kaninantistof dannet mod det grønne fluorescerende protein (fortynding: 1: 300).
- Inkubér den anden replika med et kanin polyklonalt antistof rejst mod et syntetisk peptid svarende til aminosyrerne 384 - 398 af rotte μ-opioid receptor (fortynding: 1: 500).
- Vask i TBS med 0,05% BSA (3 x 5 min.).
- Påfør sekundære antistoffer. Til denne undersøgelse uSE guld (5 nm for ionotrope glutamatreceptorer, 10 for μ-opioidreceptorer og / eller 15 nm for CHR2-YFP) konjugerede antistoffer fortyndet i TBS med 2% BSA. Fortynd sekundære antistoffer 01:30 og inkuber i en 30 pi dråbe ved 15 ° CO / N.
- Vask 3 x 5 min i 0,05% BSA-TBS ved stuetemperatur.
- Vask 2 x 5 min i ultrarent vand.
- Mount replika på Formvar-coated 100-line Barre gitter (figur 4D).
6. Replica Analysis
- Billeddata replikaer med et transmissionselektronmikroskop (TEM) ved 80 eller 100 kV. Anskaf digitale billeder via en CCD (charged coupled device) kamera.
- Offline, find tilsvarende områder på billeder fra begge replikaer hjælp vartegn (Figur 4E). Analysere digitale billeder ved hjælp Billede J. Bestem postsynaptisk område og antallet af immunoguld-mærkede partikler rettet mod den analyserede receptor.
Figur 4. immunolabeling af Replica.
(A) Værktøjer til at manipulere og vask af reproduktioner. En keramisk plade med 12 brønde (øverst til højre) og 2 typer glaspipetter (øverst til venstre). Den glaspipette med rund spids (nederst til venstre) bruges til at overføre replika, og pipetten med platin stang (nederst i midten) bruges til at udfolde replikaer. En replika i vaskebuffer (nederst til højre). (B) immunmærkning af replikaer udføres i dråber (30 pi) placeret på et lille stykke parafilm i en brønd i en vævsdyrkningsplade med 6 brønde. Bemærk, at en kopi er dækket af et slip af buffer indeholdende antistoffer. For at forhindre fordampning, er en fugtet stykke silkepapir anbragt omkring den indre kant af brønden. (C) Inkubator for immunolabeling trin. Inkubationer udføres ved 15 ° C. (D) En replika monteret på en Formvar-coated 100-line Barre gitter. (E) lav forstørrelse mikrografier fra et par reproduktioner. De punkterede firkanter angiver tre typiske landmærker at identificere en placering i de tilsvarende replikaer. Målestokken: 10 um. Vises Alle data som middelværdier ± sem Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Den FRIL teknik, når de kombineres med ekspression af optogenetic aktuatorer af mikrobiel oprindelse 21, dvs. kanaler integreret i plasmamembranen og effektivt transporteres anterogradely langs axoner, gør det muligt at undersøge kvantitativt den postsynaptiske ekspression af AMPA-R og NMDA-R ved en defineret undergruppe af synapser. Dette er vist her i axoner, der stammer fra særskilte thalamiske kerner (fx PIN / MGN) på ITC neuroner i amygdala. Denne fremgangsmåde muliggør en molekylær analyse af de enkelte sanseindtryk synapser på ITC neuroner, en gruppe af celler, der har været refraktære over for en detaljeret anatomisk og molekylær karakterisering hidtil.
Fire uger efter stereotaktisk injektion af rAAV-CHR2-YFP i PIN / MGN, CHR2-YFP-positive axoner tæt innerverede LA, det amygdalostriatal overgangsområde (Astria) og den mediale paracapsular I TC klynge i amygdala, et mønster i fuld overensstemmelse med tidligere opsporing studerer 16, 22. Vi har detekteret også intens guld immunolabeling for CHR2-YFP på P-ansigt axoner og terminaler i fryse-fraktur replika fra rAAV-CHR2-YFP- injicerede mus (figur 5A), men ikke i replikaer fra ikke-injicerede mus. Den postsynaptiske membran specialisering af glutamaterge synapser i en replika kan observeres som en klynge af intramembrane partikler (IMP) på E-flade på plasmamembranen 2, 23, og er ofte ledsaget af P-flade af dens præsynaptisk plasmamembran 7 (figur 5B-C). Disse træk lov til at identificere den postsynaptiske specialisering af glutamaterge synapser dannet af PIN / MGN axonterminaler (figur 5 og 6). Vi mærkede AMPA-R'er med et antistof, der genkender alle fire underenheder (GluA1-4), hvorimod der ikke blev påvist NMDA-R'er anvendelse af et antistof mod de væsentlige NR1 underenheden.
ntent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> På grund af manglen på redskaber til at spore på det samme replika, om disse synapser blev foretaget med dendritiske pigge og aksler af ITC neuroner, mærket vi den tilsvarende replika ansigt for μ opioid receptorer, som ITC neuroner udtrykker postsynaptisk høje niveauer af disse receptorer 24. Dette krævede identifikation af de samme postsynaptiske profiler i de to replikaer (figur 5C-F og figur 6A-D) under anvendelse af en strategi, der anvender landmærker (figur 4E) .
Figur 5. Påvisning af CHR2-YFP og ionotrope glutamatreceptorer på Replika af immunoguld Partikler. (A) En cross-brud Axon terminal (lyseblå) og små dele af dets P-ansigt mærket med 15 nm guldpartikler påvisning CHR2-YFP. Inden terminalen, membranen of talrige synaptiske vesikler kan observeres (sv). Bemærk specificiteten af immunmærkning i vid udstrækning begrænset til plasmamembranen. Mærkning for CHR2 identificerer terminalen som hidrørende fra PIN / MGN. Terminalen danner en asymmetrisk synapse med en rygrad. Specialiseringen postsynaptiske membran (PSD) på E-ansigt viser et karakteristisk klynge af intramembrane partikler og er mærket med 5 nm guldpartikler afslører AMPA-R'er. (B) P-flade af en CHR2-udtrykkende axon (mærket med 15 nm guldpartikler) er vist grænser op to dendritter, en af dem besidder to PSDs mærket med 5 nm guldpartikler afslører NMDA-R'er. (CD) modstående flader af for- og postsynaptiske membraner af en PIN / MGN-ITC synapse. (C) P-flade af terminalen udtrykker CHR2 (mærket med 15 nm guldpartikler) og strækker sig over E-ansigt to dendritiske aksler, hvoraf den ene indeholder to PSDs mærket til AMPA-R'er (5 nm guldpartikler). (
Immunoparticles for AMPA-R'er i PIN / MGN-ITC synapser blev fundet over hele IMP klynge, hvilket tyder på en homogen fordeling inden den postsynaptiske specialisering (figur 5E). En signifikant højere (uparret t-test p <0,018) blev observeret tæthed af AMPA-R mærkning i PIN / MGN synapser på ITC pigge (715 ± 38 guldpartikler / um 2, n = 32) sammenlignet med synapser onto ITC dendritter (590 ± 44 guldpartikler / um 2, n = 32). Samlet er densiteten af AMPA-R'er i PIN / MGN-ITC synapser udviste en relativt lavvarians (Koefficient af varians, CV = 0,37) i overensstemmelse med en homogen fordeling.
Immunoparticles for NMDA-R'er i PIN / MGN-ITC synapser blev ofte observeret ujævnt fordelt inden postsynaptiske IMP klynger (figur 5B). Densiteten af NMDA-R mærkning var ens (uparret t-test p = 0,39) mellem PIN / MGN synapser på ITC pigge (1070 ± 153 guldpartikler / um 2, n = 8) og ITC dendritter (812 ± 183 guldpartikler / um 2, n = 9). I modsætning til, hvad der blev observeret for AMPA-R'er, tætheden af NMDA-R'er i PIN / MGN-ITC synapser var meget variabel (CV = 0,54).
Figur 6. AMPA-R og NMDA-R'er immunolabeling på Identificerede PIN / MGN-ITC synapser.
(AB) modstående flader af for- og postsynaptiske membraner af en PIN / MGN-ITCsynapse lavet på en dendritisk rygsøjle, hvor P-flade af terminalen udtrykker CHR2 (mærket med 15 nm guldpartikler) og PSD på en dendritisk rygsøjle er mærket til AMPA-R'er (5 nm guldpartikler). (CD) forstørrede billeder af de områder, der ved den stiplede linie. Disse områder er blevet drejet ca. 45 ° mod uret for at tillade en bedre visning af PSD. (E) Scatterplots af antallet af AMPA-R-partikler versus synaptisk område i ITC pigge og dendritter. I begge strukturer, har en positiv korrelation blevet observeret. (F) Scatterplots af antallet af NMDA-R-partikler mod synaptisk område i ITC pigge og dendritter. En signifikant positiv korrelation blev fundet kun i dendritiske pigge. Scale barer:. 500 nm Klik her for at se en større version af dette tal.
FordiP-flade af den præsynaptiske plasmamembran ofte overlejret delvis den postsynaptiske IMP klynge, kunne vi anslår den synaptiske areal på kun 30% af synapserne (spines: betyde område 0,032 um 2, range: 0,007 til 0,063 um 2, n = 8; dendritter: 0.047 um 2, interval: 0,024 til 0,166 um 2, n = 11). Disse var i en lignende område som tidligere analyseret telencephalic glutamaterge synapser 25.
I begge pigge og dendritter, blev antallet af guld Immunoparticles for AMPA-R'er i de enkelte synapser positivt korreleret med den synaptiske område (Spearman, pigge: r = 0,88, dendritter: r = 0,60, p <0,0001) (Figur 6E). Omvendt er antallet af guld Immunoparticles til NMDA-R'er fundet at korrelere med den synaptiske område i pigge (Spearman, spines: r = 0,90, p <0,002), men ikke i dendritter (r = 0,21, p = 0,29) (Figur 6F ).
Discussion
Fryse-fraktur elektronmikroskopi har været et stort teknik i ultrastrukturel forskning i over 40 år. Men manglen på effektive midler til at studere den molekylære sammensætning af membraner produceret et markant fald i brugen. For nylig har der været en stor vækkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopi som følge af udviklingen af effektive måder at afsløre integrale membranproteiner ved immunguld mærkning 1, 2, nemlig FRIL teknik.
Den FRIL teknik har adskillige fordele frem for andre immunogold ultrastrukturelle metoder. Første, proteiner er let tilgængelige for antistoffer forøgelse af følsomheden. Sekund, eksponering af stor del af plasmamembran specialiseringer, såsom den postsynaptiske membran på den todimensionale overflade af replika tillader inspektion af den rumlige fordeling og fysisk grænseforholdet af molekyler af interesse uden besværlig og tidskrævende genopbygning af alvoral ultratynde sektioner. Tredje, tilgængeligheden af begge halvdele af plasmamembranen øger antallet af proteiner, der kan mærkes for hver enkelt struktur, forudsat egnede antistoffer er tilgængelige. Ved frakturering, er den hydrofobe forside af den opdelte membran belagt med carbon-platin, der befæster proteindomæner forbliver på brudfladen. Dette forhindrer adgang af antistoffer til antigener på disse områder. For eksempel på P-flade af en replika kan detekteres kun epitoper overfor protoplasmisk rum med antistoffer, hvorimod på E-ansigt kun epitoper overfor exoplasmic rum kan bindes af antistoffer (se figur 2).
På den anden side, den FRIL teknik lider også af visse begrænsninger 2. Som frakturer opstår tilfældigt, kan det være svært at målrette specifikke celler eller strukturer. Dette kan også føre til en sampling bias, fx i synapse indsamling betragtning af den forskellige sandsynlighed for FRActuring langs membranen af strukturer med forskellig krumning (f.eks, pigge versus aksler). Endvidere tildeling af membranproteiner til en af de to flader er uforudsigelig. Derfor fordelingen af et protein til P-ansigt eller E-ansigt, især for kvantitative undersøgelser, bør undersøges nøje ved anvendelse af antistoffer reaktive mod intracellulære og ekstracellulære domæner. Endelig identifikation i replika af visse strukturer, såsom præsynaptiske Axon terminaler, kan være svært, når kun baseret på morfologiske træk. Men anvendelsen af specifikke antistoffer for markørproteiner eller transduktionen af taggede integrale membranproteiner eller kanaler ved hjælp virale vektorer tilbyder yderligere værktøjer lettere at identificere de frakturerede membraner. For eksempel denne undersøgelse benyttede transduktion af CHR2-YFP i thalamiske neuroner til at identificere deres axonale efferents i amygdala eller mærkning af μ-opioidreceptorer at afsløre postsynaptiske migmbranes af ITC neuroner.
For at kunne udføre den FRIL teknik med succes, skal der tages særlig omhu vedrørende vævsfiksering. Stærk vævsfiksering (> 2% paraformaldehyd) kan resultere i en høj grad af tværgående frakturer og et fald i følsomhed mærkning. På den anden side, svage fikseringer gøre vævet håndtering og tilberedning (fx skæring af sektioner) vanskelig. Det er også vigtigt at kontrollere, at tykkelsen af de trimmede klodser passer tykkelsen af det dobbeltsidede tape. Hvis tykkelsen af prøven er lavere end den af båndet, kan overfladerne af væv ikke vedhæfte til overfladen af de to metal bærere er dermed de frosne prøve ikke brækket. Hvis vævet er tykkere, vil det blive komprimeret med uundgåelige strukturelle forvridninger, når sandwichen af de to kobber bærere er lavet. Den temperatur, ved hvilken prøven er brækket (i denne protokol, -115 ° C) spiller også en vigtig rollepå strukturen af replika. Højere temperaturer kan frembringe en højere artefakter, såsom kondensering af vanddamp på overfladen af vævet før eller under fordampning. Lavere temperaturer (<-125 ° C) kan øge risikoen for fraspaltning af materiale under frakturering. Dette materiale kan falde på overfladen af prøven eller holde forbindelsen til det. Disse flager af materiale er også belagt og kontrast producerer mørke pletter på billedet. Briste ved lavere temperaturer kan også påvirke hyppigheden af cross-frakturer især for små fine strukturer såsom dendritiske pigge. En yderligere afgørende skridt i forberedelsen af replikaer er vaskemiddel-fordøjelse. Hvis fordøjelsen er ufuldstændig, vises ufordøjet væv som mørke pletter på replika, confounding analysen af strukturen på TEM. Desuden ufordøjet væv kan uspecifikt fælde eller binder antistoffer, hvilket øger mærkningen baggrunden. På den anden side er anvendelsen af detergents for vævsfordøjelse kan denaturere molekylerne forbundet til replika ændre deres sekundære og tertiære strukturer. Derfor, for visse antigener kan det være nødvendigt gradvist at fortynde koncentrationen af SDS med yderligere vasketrin.
For immunolabeling, tilgængeligheden af forskellige størrelser af guldpartikler konjugeret til sekundære antistoffer gør det muligt at detektere på samme tid, men kun kvalitativt multiple proteiner, selv i særlige mikrodomæner af plasmamembranen, såsom den postsynaptiske specialisering. Men på grund af sterisk hindring, kvantitative undersøgelser er generelt begrænset til påvisning af blot ét molekyle. Størrelsen af guldpartikler og kan også påvirke effekten mærkning.
Ved fortolkningen af mærkningen i FRIL, skal det holdes for øje, at immunoguld partiklen kan placeres hvor som helst inden for en halvkugle med en radius på 20-25 nm fra antigenet på grund af den fleksible komplekse formulared af den primære og sekundære antistof 26. For yderligere information om teori og praksis af FRIL og relaterede teknikker, henviser vi læseren også til andre metodologiske artikler 27, 28.
Den FRIL Teknikken er for nylig blevet anvendt til høj opløsning kvantitative analyser af glutamat receptor lokalisering i diverse synapse populationer 29, 30. Desuden påvisning følsomheden af FRIL teknik til AMPA-R'er blev anslået så højt som en immunguld partikel pr en funktionel AMPA -R kanal 29. Således er denne tilgang er generelt meget nyttigt at kvantificere og analysere mønstret af postsynaptiske udtryk for AMPA-R og NMDA-R'er på centrale synapser. Her demonstrerede vi dens anvendelighed på PIN / MGN-ITC synapser, et websted sandsynligvis vigtigt for genudlægning amerikanske oplysninger under frygt condition. Anvendelse af et antistof dannet mod de stærkt konserverede ekstracellulære aminosyrerester af AMPA receptor-underenheder GluA1-GluA4, fandt vi en jævn fordeling af guldpartikler inden IMP klynger svarende til postsynaptiske membran specialiseringer. Tætheden af AMPA-R'er i ITC pigge var signifikant højere i forhold til aksel synapser målrettet med PIN / MGN thalamiske afferenter. På begge rygsøjlen og akslen synapser, blev en positiv korrelation mellem mærkning af AMPA-R'er og postsynaptiske område opdaget, en funktion fælles for andre glutamaterge synapser 25. Den lave varians i tætheden af AMPA-R'er i PIN / MGN-ITC synapser indikerer en homogen fordeling ligner andre synapser dannet af thalamiske efferents 7, men forskellig fra kortikale synapser 25. Omvendt tætheden af NMDA-R'er var mere variabel og var ikke forskellig mellem rygsøjlen og akslen synapser tyder en anden regulering end AMPA-R'er. I fremtiden vil den høje reproducerbarhed FRIL teknik ikke kun tillader at vurdere basale molekylære sammensætning af centrale synapser, men kan lette afsløringen af cNDRINGER i ionotrope glutamat receptor numre og subsynaptic fordeling efter frygt læring, der supplerer ex-vivo optagelser af præ- og postsynaptiske egenskaber af disse indgange.
Afslutningsvis kan denne fremgangsmåde bruges af andre forskere at få indblik i mellem struktur og funktion af input-specifikke excitatoriske synapser i mange andre neurale kredsløb, hvor udrede oprindelsen af indgangene og arten og sammensætningen af postsynaptiske elementer er afgørende, men problematisk .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Stereotactic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
| Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue preparation | |||
| Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
| Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
| Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
| NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
| NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
| 4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
| Thiopental | Sandoz, Austria | 5,133 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
| GenPure ultrapure water system | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
| Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
| Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
| Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
| Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
| Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure Freezing | |||
| Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
| Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
| Chamois skin | Household supply store | ||
| Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
| Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
| Acetone | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
| High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
| Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
| Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
| Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
| CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
| CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
| Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
| Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-fracture and Replication | |||
| Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
| Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
| Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
| Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
| Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
| Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
| Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
| SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
| Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
| TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
| Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunolabelling | |||
| BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
| Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
| Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
| Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
| Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
| EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody | BBInternational, UK | EM.GAG5 | |
| EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody | BBInternational, UK | EM.GAR15 | |
| Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
| Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
| Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
| Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
| Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EM analysis | |||
| Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
| Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
| iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |
References
- Fujimoto, K. SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application. Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).
- Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).
- Rash, J. E., Yasumura, T. Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis. Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).
- Emes, R. D., Grant, S. G. Evolution of synapse complexity and diversity. Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).
- Matsuzaki, M., et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).
- Rollenhagen, A., Lübke, J. H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function. Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).
- Tarusawa, E., et al. Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses. J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).
- Nusser, Z., et al. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).
- Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus. Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).
- Nicholson, D. A., Geinisman, Y. Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
- Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
- Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala. Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).
- Duvarci, S., Pare, D. Amygdala microcircuits controlling learned fear. Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).
- Jüngling, K., et al. Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala. Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).
- Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
- Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).
- Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Sigurdsson, T., et al. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
- Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Bienvenu, T. C. M., et al. Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information. J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).
- Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes. Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).
- Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction. Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).
- Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).
- Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
- Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).
- Tanaka, J., et al. Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum. J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).
- Mansouri, M., et al. Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex. Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).
