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Neuroscience

संयुक्त optogenetic और रुक-फ्रैक्चर प्रतिकृति immunolabeling माउस प्रमस्तिष्कखंड में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के इनपुट विशेष व्यवस्था की जांच करने के लिए

Published: April 15, 2016 doi: 10.3791/53853
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology, Medical University of Innsbruck, 2Hertie Institute for Clinical Brain Research and Centre for Integrative Neuroscience, University of Tübingen

Abstract

रुक-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 40 साल के लिए ultrastructural अनुसंधान के क्षेत्र में एक प्रमुख तकनीक से किया गया है। हालांकि, झिल्ली की आणविक संरचना का अध्ययन करने के लिए प्रभावी साधन के अभाव में इसके उपयोग में एक महत्वपूर्ण गिरावट का उत्पादन किया। हाल ही में, वहाँ immunogold लेबलिंग से अभिन्न झिल्ली प्रोटीन प्रकट करने के लिए प्रभावी तरीके से विकास करने के लिए फ्रीज फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी धन्यवाद में एक प्रमुख पुनरुद्धार किया गया है। इन तरीकों में से एक के रूप में डिटर्जेंट solubilized रुक-फ्रैक्चर प्रतिकृति immunolabeling (FRIL) में जाना जाता है।

optogenetics साथ FRIL तकनीक के संयोजन केंद्रीय synapses के संरचनात्मक और कार्यात्मक संपत्तियों की एक सहसंबद्ध विश्लेषण की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग यह पहचान करने और एक टैग किए गए channelrhodopsin के अपने संबंधित अभिव्यक्ति और विशिष्ट आणविक मार्कर द्वारा दोनों पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स को चिह्नित करने के लिए संभव है। Glutamat की पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली विशेषज्ञता के विशिष्ट उपस्थितिergic आगे synapses, की अनुमति देता है ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की लेबलिंग पर, यों और इन रिसेप्टर्स की intrasynaptic वितरण का विश्लेषण करने के लिए। यहाँ, हम प्रक्रियाओं बनती प्रतिकृतियां और उन्हें कैसे immunolabel करने के लिए तैयार करने की आवश्यकता का एक कदम-दर-कदम विवरण देते हैं। हम यह भी निरंतर और FRIL तकनीक की सीमाओं को, विशेष रूप से संभावित नमूना पूर्वाग्रहों से जुड़े लोगों के बारे में चर्चा करेंगे। उच्च reproducibility और FRIL तकनीक की चंचलता, जब optogenetics के साथ संयुक्त, मस्तिष्क में पहचान न्यूरोनल microcircuits पर synaptic प्रसारण के विभिन्न पहलुओं के लक्षण वर्णन के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है।

यहाँ, हम एक उदाहरण है कि कैसे इस दृष्टिकोण माउस प्रमस्तिष्कखंड की intercalated सेल जनता के न्यूरॉन्स में उत्तेजक synapses की संरचना समारोह संबंधों में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, हम पहचान आदानों पर ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति की जांच की है याthalamic पीछे intralaminar और औसत दर्जे का geniculate नाभिक से iginated। ये synapses डर सीखने के लिए प्रासंगिक संवेदी जानकारी रिले करने के लिए और डर कंडीशनिंग पर प्लास्टिक परिवर्तन से गुजरना करने के लिए दिखाया गया है।

Introduction

nanometer पैमाने पर biomembranes के कार्यात्मक वास्तुकला की परिभाषा हाल के वर्षों में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त immunolabeling तकनीकों का एक नंबर के विकास के द्वारा चुनौती दी गई है। हालांकि, इन तकनीकों, जैसे, पूर्व और बाद embedding immunogold, महत्वपूर्ण सीमाओं, जो एंटीजन और / या झिल्ली बाध्य प्रोटीन की सीमित मात्रात्मक आकलन के गरीब का पता लगाने में शामिल की एक संख्या है। इन सीमाओं को विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र, जो सेल विविधता और अन्तर्ग्रथन विविधता के एक उच्च डिग्री की विशेषता है की ठीक संरचना की जांच में महत्वपूर्ण हो गया है। इस विविधता दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक विविधता पूर्व और postsynaptic तत्वों द्वारा और अंतर अभिव्यक्ति, संवर्धन, या इस तरह के रिसेप्टर्स, ट्रांसपोर्टरों, और प्रेरक अणुओं के रूप में संकेत प्रोटीन, की बातचीत से तय से परिणाम है।

प्रत्यक्ष immunolabe के लिए एक नया दृष्टिकोणडिटर्जेंट solubilized फ्रीज फ्रैक्चर प्रतिकृतियां (FRIL) में अभिन्न या पार से जुड़े झिल्ली प्रोटीन के लिंग मूल रूप से दो दशक पहले 1 Fujimoto द्वारा पेश किया गया था। यह मूल तरीका था, हालांकि, कई सीमाएं हैं, यानी, प्रतिकृतियां, जो इस तरह के मस्तिष्क के रूप में जटिल ऊतकों में व्यक्तिगत रूप से मैप किया कोशिकाओं के साथ लेबल अणुओं के सार्थक सहसंबंध बाधा उत्पन्न की गंभीर विखंडन। लगभग 10 साल पहले, Shigemoto और Fukazawa उत्तरोत्तर तकनीक 2 सुधार हुआ है। यह कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय के बोल्डर प्रयोगशालाओं, जो भी काफी अंतराल जंक्शनों 3 के अध्ययन के लिए तकनीक में सुधार, विशेष रूप में वैज्ञानिकों के एक अन्य समूह से प्रयासों से समानांतर था।

फ्रीज fracturing प्रोटोकॉल और मशीनों में सुधार, साथ ही जल्दी ठंड की शुरूआत (उच्च दबाव के तहत), अब हाय जांचकर्ताओं अपेक्षाकृत बड़े आकार के नमूनों की अटूट प्रतिकृतियां का उत्पादन करने की अनुमति देता हैसीमाओं और मजबूत रासायनिक fixations द्वारा उत्पादित कलाकृतियों के बिना सबसे सेलुलर घटकों के जीएच गुणवत्ता के चित्र।

FRIL तकनीक पूर्व और postsynaptic की एक तलीय देखने का अतिरिक्त लाभ के साथ, इस तरह के मस्तिष्क के रूप में मैप histologically में एक या एक से अधिक प्रोटीन (एक साथ) और जटिल ऊतकों के भीतर cytologically पहचान की कोशिकाओं के सीटू पहचान में एक बेहद मात्रात्मक के महान लाभ प्रदान करता है एक भी प्रतिकृति में तत्वों। इसलिए, FRIL तकनीक, इसके कई तकनीकी बाधाओं के बावजूद, बहुत महत्वपूर्ण वैज्ञानिक सफलताओं में से एक नंबर के लिए वादा, विशेष रूप से अलग-अलग synapses के संरचनात्मक और कार्यात्मक संपत्तियों के संबंध के लिए रखती है। पिछले कई दशकों के दौरान, जानकारी का एक बड़ा सौदा synapses के शारीरिक समारोह संरचना पर प्राप्त किया गया है, आणविक बनाने के लिए, और; अभी तक synapses आकृति विज्ञान और molecularly अत्यधिक विविध पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी देहात के आधार पर कर रहे हैंकिराए पर लेने के न्यूरॉन्स 4। केवल अन्तर्ग्रथन प्रकार की एक मुट्ठी भर के लिए थे संरचना समारोह के अध्ययन अब तक 5-7 से पूरा किया। यह ज्यादातर तकनीकी constrains कि पूर्व और postsynaptic तत्वों की प्रकृति का एक सटीक पहचान रोका की वजह से था।

Ultrastructural विश्लेषण न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स 6 में अलग synaptic संपर्कों के पार दोनों synaptic आकार और सामग्री के संदर्भ में पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली विशेषज्ञताओं की परिवर्तनशीलता, जो शक्ति और synaptic प्रसारण के plasticity पर एक बड़ा प्रभाव है में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। इसके अलावा, अनुसंधान का एक बड़ा शरीर इंगित करता है कि ionotropic ग्लूटामेट अन्तर्ग्रथन के विभिन्न प्रकारों पर व्यक्त रिसेप्टर्स की संख्या एक afferent- और लक्ष्य पर निर्भर फैशन 7-10 में विनियमित है।

इधर, एक विधि उल्लिखित है कि पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली विशेषज्ञताओं की संरचना और रिसेप्टर संरचना के विश्लेषण की अनुमति देता परिभाषित करने के साथडी प्रेस्य्नाप्तिक तत्वों और समारोह। यह दृष्टिकोण इस तरह के channelrhodopsin2 (ChR2) के रूप में हाल ही में विकसित प्रकाश के प्रति संवेदनशील काई प्रोटीन, के प्रीसानेप्टिक अभिव्यक्ति का लाभ लेता है, और FRIL तकनीक की α अमीनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic की पोस्टअन्तर्ग्रथनी अभिव्यक्ति के पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एसिड (AMPA-रुपये) और एन मिथाइल-D-aspartate (NMDA रु) ग्लूटामेट रिसेप्टर्स। इस प्रमस्तिष्कखंड (आईटीसी) की intercalated सेल जनता के न्यूरॉन्स पर पीछे thalamic औसत दर्जे geniculate नाभिक (पिन / MGN) से होने वाले एक्सोन द्वारा गठित synapses पर प्रदर्शन किया है। आईटीसी न्यूरॉन्स छोटे काँटेदार GABAergic basolateral amygdaloid परिसर (बीएलए) 11, 12 के आसपास के समूहों में संगठित कोशिकाओं रहे हैं। आईटीसी न्यूरॉन्स बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन्स से उत्तेजक आदानों प्राप्त करने के लिए और केंद्रीय नाभिक (सीईए) को लक्षित करने के लिए जाना जाता है, इस प्रकार एक निरोधात्मक गेट के रूप में कार्य जानकारी के लिए बीएलए और सीईए 12-15 के बीच प्रवाह।

हाल ही में, हम जानते हैं कि यह प्रदर्शनसी बीएलए और सीईए के बीच Medio-पृष्ठीय क्लस्टर में स्थित न्यूरॉन्स भी संवेदी thalamic और लौकिक cortical क्षेत्रों, जो डर Pavlovian श्रवण डर कंडीशनिंग 16 के दौरान सीखने पर संशोधित कर रहे हैं से प्रत्यक्ष और अभिसरण उत्तेजक आदानों प्राप्त करते हैं। डर कंडीशनिंग मस्तिष्क तंत्र के संदर्भ में साहचर्य सीखने का सबसे अच्छा समझ में आ रूपों में से एक है। डर कंडीशनिंग, शुरू में एक तटस्थ वातानुकूलित प्रोत्साहन (सीएस, जैसे, एक स्वर में) एक प्रतिकूल असुविधाजनक प्रोत्साहन (अमेरिका, जैसे, एक हल्के पैर सदमे) एक CS-अमेरिकी संघ में जिसके परिणामस्वरूप के साथ रखा जाता है और डर प्रतिक्रिया 17, 18 वातानुकूलित। उत्तेजक जो सीएस और अमेरिका का प्रतिनिधित्व करने के बारे में जानकारी ले दोनों thalamic और neocortical क्षेत्रों से जानकारी, क्रमशः, प्रमस्तिष्कखंड (ला) के पार्श्व नाभिक के पिरामिड न्यूरॉन्स पर एकाग्र करने के लिए और plasticity 19 गुजरना करने के लिए जाने जाते थे। हमारे पिछले काम से पता चला है कि संवेदी इनपुट जानकारी आईटीसी न्यूरॉन्स के लिए relayed समानांतर में भी है

व्यक्तिगत संवेदी इनपुट के एक यंत्रवत आणविक विश्लेषण दिशा में पहला कदम आईटीसी न्यूरॉन्स पर synapses के रूप में, हम व्यक्त करने के लिए ChR2 पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के साथ टैग एक एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) का इस्तेमाल किया। एएवी पिन / MGN में इंजेक्ट किया गया था और अक्षतंतु टर्मिनलों ChR2-YFP की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की गई। हम पिन / MGN अक्षतंतु टर्मिनलों से आईटीसी न्यूरॉन्स के साथ बनाई synapses पर पोस्टअन्तर्ग्रथनी AMPA रु और NMDA-रुपये के घनत्व का आकलन करने के लिए दोनों FRIL तकनीक द्वारा उत्पन्न चेहरे का इस्तेमाल किया।

Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं Regierungspraesidium Tübingen, Baden-Württemberg, जर्मनी, राज्य द्वारा और ऑस्ट्रिया के पशु प्रयोग आचार बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है, और अनुसंधान के क्षेत्र में जानवरों के इस्तेमाल पर यूरोपीय संघ के निर्देश के अनुसार थे।

1. एएवी-Channelrhodopsin2-YFP के stereotactic इंजेक्शन

नोट: स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 20 के अनुसार किए गए।

  1. 1.5 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें हीटिंग द्वारा बाँझ उपकरण तैयार।
  2. एक क्षैतिज microelectrode खींचने निम्नलिखित मानकों के साथ सेट का उपयोग कर इंजेक्शन के लिए तेज (~ 50 माइक्रोन व्यास) कांच pipettes खींचो: गर्मी = रैंप मूल्य - 20, = खींचो = 0, वेग = 100, समय = 200, दबाव 200।
    नोट: रैंप मूल्य micropipette खींचने निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों के अनुसार खरीदा कांच pipettes से प्रत्येक बहुत कुछ के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. Premix वायरस समाधान के 1 μl और 0.1% फास्ट ग्रीन समाधान बाँझ फॉस्फेट बफर खारा में (कांच पिपेट में समाधान के बेहतर दृश्यता के लिए) के 0.2 μl (पीबीएस; 25 मिमी, 0.9% सोडियम क्लोराइड, 7.4 पीएच)। एक 10 μl पिपेट और जेल-fil युक्तियों का उपयोग करके कांच पिपेट भरें। वायरल निर्माण के लिए, rAAV-Hsyn-ChR2 (H134R) -eYFP (सीरोटाइप 2/9) का उपयोग करें।
  4. एक छोटे जानवर संज्ञाहरण डिवाइस (प्रेरण के लिए ऑक्सीजन में 3% isoflurane) का उपयोग माउस anesthetize। उपयोग। इस अध्ययन के लिए, 3 प्रकार के जंगली ~ 6 सप्ताह के आयु वर्ग के चूहों का उपयोग करें।
  5. कान और आंखों के बीच सिर दाढ़ी और एक povidone आयोडीन आधारित समाधान के साथ कीटाणुरहित।
  6. संज्ञाहरण के दौरान आंखों के सूखने को रोकने के लिए एक आंख मरहम लागू करें। Subcutaneously एनाल्जेसिक के साथ माउस इंजेक्षन (meloxicam आधारित, एक 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 0.1 एमएल)।
  7. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में माउस प्लेस और एक गैस संज्ञाहरण डिवाइस (रखरखाव के लिए ऑक्सीजन में 2% isoflurane) के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें। एक अंग वापसी की कमी से संज्ञाहरण गहराई की जांचआगे बढ़ने से पहले पलटा।
  8. पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान संभव के रूप में सबसे अच्छा के रूप में बाँझ शर्तों को बनाए रखें। एक डिस्पोजेबल चेहरा मुखौटा, एक शल्य गाउन और दस्ताने पहनें।
  9. कैंची का उपयोग कर 20 सिर के शीर्ष पर लगभग 1 सेमी की त्वचा चीरा। धीरे कुंद संदंश का उपयोग करने के पक्ष त्वचा खींच, एच 2 ओ 2 के साथ खोपड़ी की सतह और साफ खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए clamps के साथ तय कर लो।
  10. खोपड़ी पर मार्क इंजेक्शन साइटों एक अच्छी टिप स्थायी मार्कर का उपयोग कर। उल्लेखनीय स्थल पर खोपड़ी में एक छोटा सा छेद (व्यास में लगभग 1 मिमी) ड्रिल। शीर्षस्थान से (मिमी): पीछे 3.0, 1.8 ± पार्श्व, उदर 3.8 इस संवर्धन में एकतरफा पिन / MGN इंजेक्शन के लिए, निम्न निर्देशांक का उपयोग करें।
  11. माउंट एक दबाव इंजेक्शन डिवाइस से जुड़े स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर कांच पिपेट भरा और स्थिति शीर्षस्थान के लिए पिपेट लाने के लिए।
  12. ठीक सीधे टिप संदंश का उपयोग गिलास पिपेट की नोक बंद तोड़। यकीन विंदुक टिप बनाओ applyin से खुला हैga कुछ दबाव दालों और वायरस समाधान की बूंदों के अवलोकन के बाहर निकालना।
  13. वांछित इंजेक्शन निर्देशांक पर जाएं और पिपेट सामग्री (~ 0.5 μl) के दबाव इंजेक्शन डिवाइस पर निम्न सेटिंग्स का उपयोग कर के आधे इंजेक्षन: दबाव 20 साई, औसत पल्स लंबाई 30 एमएस, दाल 50 की औसत संख्या।
  14. धीरे-धीरे (1 मिमी / मिनट) से पहले ~ 1 मिनट यह retracting के लिए जगह में पिपेट छोड़ दें।
  15. पीबीएस (7.4 पीएच) और अकड़न हटाने के साथ स्वच्छ खोपड़ी। धीरे एक साथ त्वचा खींच, और चीरा सीवन (3 - 4 समुद्री मील)। घाव के आसपास कीटाणुनाशक (povidone आयोडीन आधारित) लागू करें।
  16. संज्ञाहरण बंद करो और पूरी तरह से जाग तक पहुंच से बाहर माउस छोड़ नहीं है। चूहों एकल रखे रखें। ऑपरेशन के बाद स्वास्थ्य की स्थिति पर नजर रखने के लिए जारी; यदि आवश्यक हो तो प्रशासन एनाल्जेसिक।
  17. मस्तिष्क निर्धारण से पहले 4 सप्ताह के लिए जानवरों को रखने वायरल अभिव्यक्ति के उचित स्तर को सुनिश्चित करने के लिए।

2. नमूना तैयार

  1. ब्रेन निर्धारण </ Strong>
    1. लगानेवाला की तैयारी
      1. लगानेवाला के 1 एल के लिए, paraformaldehyde के 10 ग्राम वजन और विआयनीकृत एच 2 ओ की 300 मिलीलीटर के लिए इसे जोड़ने ~ के लिए निरंतर क्रियाशीलता के साथ 10 मिनट 60 डिग्री सेल्सियस - 55 के लिए गर्मी।
      2. गर्मी बंद स्विच और 7 जोड़ - 4 एन NaOH के 8 बूँदें। समाधान ~ 10 मिनट में स्पष्ट हो जाना चाहिए।
      3. यह आरटी के लिए ठंडा होने दें, रंगाई एसिड की एक संतृप्त समाधान के 150 मिलीलीटर जोड़ने और विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ 500 मिलीलीटर के लिए इसे लाने
      4. 0.2 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब) के 500 मिलीलीटर जोड़ें। फिल्टर पेपर के साथ फ़िल्टर। NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें।
      5. 6 डिग्री सेल्सियस के लिए लगानेवाला कूल, 6 डिग्री सेल्सियस पर एक से अधिक दिन के लिए काले शीशे की बोतलों में यह दुकान।
    2. transcardiac छिड़काव
      1. thiopental (120 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) की एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहों anesthetize। यकीन है कि पशु गहरा पेडल वापसी refl जाँच करके anesthetized है सुनिश्चित करेंपूर्व, जो अनुपस्थित होने चाहिए। नीचे बंधे चार पांव के साथ एक छिड़काव की मेज पर अपनी पीठ पर पशु रखें।
      2. कुंद अंत कैंची से longitudinally पेट की दीवार खोलें और डायाफ्राम बेनकाब करने के लिए laterally रिब पिंजरे की दुम सीमा पर दो अतिरिक्त कटौती, बनाते हैं। डायाफ्राम दूर कट और दोनों पक्षों पर osteocartilageneous सीमा पर वक्ष दीवार काट दिया। उरोस्थि दिल को बेनकाब करने वाले वक्ष दीवार के केंद्रीय स्लैब की दुम अंत लिफ्ट।
      3. पेरीकार्डियम निकालें, छिड़काव उपकरण की प्रवेशनी स्वीकार करने के लिए बाएं वेंट्रिकल की नोक में एक छोटा सा सटीक काट कर। 0.6 मिमी की एक आंतरिक व्यास के साथ एक कुंद प्रवेशनी का प्रयोग करें। वेंट्रिकल के माध्यम से धीरे प्रवेशनी दर्रे तक टिप आरोही महाधमनी में प्रकट होता है और एक क्लैंप के साथ प्रवेशनी सुरक्षित। रक्त और रक्त प्रवाह से बाहर निकलने के लिए perfusates अनुमति देने के लिए, सही आलिंद में कटौती कर सकते हैं।
      4. छिड़कना चूहों transcardially एक प्रवाह दर पर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग5 मिलीग्राम / लगभग 1 मिनट के लिए पीबीएस के साथ पहली बार में न्यूनतम (25 मिमी, 0.9% सोडियम क्लोराइड, पीएच 7.4), 7 मिनट के लिए बर्फ ठंडा लगानेवाला द्वारा पीछा किया।
      5. निर्धारण के बाद, कैंची की एक जोड़ी के साथ माउस सिर तोड़ और फिर गर्दन से नाक के midline के माध्यम से त्वचा में कटौती। मांसपेशियों को पूरी तरह से खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए निकालें।
      6. तेज कैंची का प्रयोग, पश्चकपाल और interparietal हड्डियों रंध्र मैग्नम से शुरू के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य काट कर। का प्रयोग ठीक चिमटी इन हड्डियों को दूर पूरे सेरिबैलम बेनकाब करने के लिए। तब पार्श्विका और ललाट हड्डियों नाक की हड्डी तक के माध्यम से एक और अनुदैर्ध्य काट कर और पूरे मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए चिमटी के साथ उन्हें हटा दें।
      7. एक रंग का प्रयोग यह नुकसान पहुँचाए बिना मस्तिष्क को हटा दें, और ठंडा 0.1 एम पंजाब में जगह है।
  2. सेक्शनिंग और नमूनों की trimming
    1. उस्तरा हित के क्षेत्र युक्त ब्लेड के साथ 6 मिमी - लगभग 5 का एक राज्याभिषेक ब्लॉक में कटौती। के धारक पर यह गोंदएक cyanoacrylate गोंद के साथ vibroslicer। ऊतक ब्लॉक ओरिएंट इतना है कि नियोकॉर्टेक्स हिल ब्लेड सामना करना पड़ता है। स्लाइस राज्याभिषेक वर्गों, ठंडा 0.1 एम पंजाब में vibroslicer (चित्रा 1 ए) के साथ 140 माइक्रोन पर प्रमस्तिष्कखंड, युक्त, और उन्हें एक ही बफर में 6 अच्छी तरह से थाली में इकट्ठा।
    2. एक stereomicroscope के तहत, ब्याज के क्षेत्र से बाहर ट्रिम टुकड़ा से (यहाँ, आईटीसी के मिडफील्डर-पृष्ठीय paracapsular क्लस्टर, चित्रा 1 बी देखें)। सिलिकॉन elastomer के साथ लेपित और 0.1 एम पंजाब के साथ भरा एक पेट्री डिश में यह मत करो, एक नेत्र छुरी का उपयोग कर। सुनिश्चित करें कि छंटनी ब्लॉकों स्पेसर (लगभग 1.5 मिमी) (चित्रा 1 बी) के छेद में फिट बनाओ।
    3. 6 डिग्री सेल्सियस पर (में 0.1 एम पीबी 30% ग्लिसरॉल) हे / एन cryoprotection समाधान में छंटनी ब्लॉक हटो।

3. उच्च दाब बर्फ़ीली

नोट: FRIL 6 आवश्यक कदम के होते हैं (चित्रा 2): 1) उच्च दबाव (2,300 पर साथ तेजी से ठंड - नमूना के 2,600 बार)। 2) नमूना के fracturing। एक आधा है कि पुरस (पी-चेहरा) से सटे स्थित है और एक आधा है कि बाह्य अंतरिक्ष या exoplasmic से सटे निहित है (ई: फ्रैक्चर विमान आम तौर पर उन्हें दो आधे झिल्ली पत्रक में बंटवारे, जमे हुए झिल्ली के केंद्रीय कोर हाइड्रोफोबिक इस प्रकार है चेहरा)। 3) प्लेटिनम और कार्बन के निर्वात-जमाव से नमूना की प्रतिकृति। 4) ऊतक के डिटर्जेंट पाचन। 5) immunogold लेबलिंग। 6) एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रतिकृति का विश्लेषण।

  1. तांबे के वाहक की तैयारी
    ध्यान दें: FRIL प्रक्रिया के क्रमिक चरणों के माध्यम से नियंत्रित किया जा करने के लिए, नमूनों धातु (सोना या तांबा) वाहक पर मुहिम शुरू की जानी चाहिए। इन मार्गों को fracturing और मशीनों का इस्तेमाल किया प्रकार की विधा के अनुसार आकार और डिजाइन में भिन्नता है। यहाँ हम तांबे वाहक (चित्रा 1 बी, ई) और एक hinged "डबल प्रतिकृति तालिका" का इस्तेमाल किया; (देखें चित्र 3 बी), जो जब खोला जमे हुए नमूना के माध्यम से एक तन्य फ्रैक्चर (चित्रा 2) पैदा करता है। इस बनाए रखने और खंडित नमूना के दोनों पक्षों को दोहराने के लिए अनुमति देता है।
    1. साबर त्वचा के एक पत्रक का उपयोग कर एक धूमिल पदच्युत के साथ पॉलिश तांबे के वाहक।
    2. एक कांच के बर्तन और स्वच्छ दो बार एक sonicating नहाने के पानी में एक गैर ईओण डिटर्जेंट (पीएच ~ 1.5) के साथ में रखें वाहक, तो बड़े पैमाने पर नल का पानी विआयनीकृत पानी से पीछा में धोने और फिर इथेनॉल के साथ दो बार कुल्ला।
    3. 15 मिनट के लिए एसीटोन में तांबे के वाहक Sonicate।
    4. फिल्टर पेपर पर वाहक सुखाने के लिए रखें।
    5. एक तांबे वाहक (चित्रा 1 सी) है, जो छंटनी ब्लॉक (पकड़े वाहक) के लिए अच्छी तरह से पकड़ के रूप में काम करेगा करने के लिए दो तरफा टेप की एक अंगूठी संलग्न।
  2. नमूना की ठंड
    ध्यान दें: देखभाल और उचित काले चश्मे पहनने के साथ तरल नाइट्रोजन संभाल लेना।
    1. मुक्त उच्च दबाव चालू करेंZing इकाई (चित्रा 1F) नमूना ठंड के साथ शुरू करने से पहले कम से कम 1.5 घंटा।
    2. "एयर हीटर" बटन दबाकर हीटिंग प्रारंभ करें, और 50 मिनट के लिए बाहर सेंकना। 80 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट करें।
    3. उच्च दबाव ठंड इकाई के लिए नाइट्रोजन टैंक कनेक्ट और तरल नाइट्रोजन के साथ अंदर देवर को भरने के लिए "नाइट्रोजन" बटन दबाएँ। "नाइट्रोजन स्तर" दीपक रोशनी। "ठंडा" बटन दबाने से ठंडा करने की शुरुआत करें।
    4. बटन "में ड्राइव" प्रेस जब "नाइट्रोजन स्तर" बाहर चला जाता है। जाँच करें कि हाइड्रोलिक प्रणाली पिस्टन आगे और पीछे चलता 3 बार।
    5. "ऑटो" बटन, और "नाइट्रोजन" बटन दबाएँ। जैसे ही "तैयार" रोशनी, उच्च दबाव ठंड इकाई उच्च दबाव ठंड के लिए तैयार है।
    6. जो एजी में पिघल गई है डबल पक्षीय टेप (चित्रा 1 बी) के एक प्लैटिनम तार पाश का उपयोग कर के छेद में एक छंटनी ब्लॉक रखेंलड़की पिपेट।
    7. cryoprotectant समाधान फिल्टर पेपर या एक ब्रश का उपयोग कर के अतिरिक्त निकालें।
      नोट: इस प्रक्रिया का भी हवा के बुलबुले कि ऊतक के आसपास फार्म का हो सकता है और ऊतकों के आकार और / या फैटी की विकृति का कारण बन सकता है जो दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    8. एक stereomicroscope के तहत, एक और वाहक के साथ पकड़े वाहक कवर इतना है कि ऊतक ब्लॉक दो वाहकों के बीच sandwiched है।
    9. उच्च दबाव ठंड इकाई (चित्रा -1) का नमूना धारक में वाहक सैंडविच डालें। उच्च दबाव ठंड इकाई में नमूना धारक डालें (नीचे टिप) और नमूना धारक में पंगा लेना द्वारा सुरक्षित।
    10. "जेट-ऑटो" बटन दबाने से ठंड चक्र आरंभ। के रूप में जल्दी संभव के रूप में कार्य करना, नमूना धारक को हटाने और एक अछूता बॉक्स में तरल नाइट्रोजन के साथ टिप डूब। उन्हें शांत करने के लिए तरल नाइट्रोजन में संदंश के दो जोड़े के सुझावों को विसर्जित कर दिया।
    11. ध्यान हटाने वेंई नमूना धारक से वाहक सैंडविच और एक पूर्व ठंडा cryovial में जगह है। सुनिश्चित करें कि वाहक केवल तरल नाइट्रोजन ठंडा संदंश के साथ नियंत्रित किया जाता है सुनिश्चित करें। Cryovials शीशी (चित्रा 1G) से बाहर प्रवाह करने के लिए नाइट्रोजन अनुमति देने के लिए छिद्रित किया जाना चाहिए।
    12. दोहराएँ 3.2.11 के लिए 3.2.6 कदम जब तक सभी वांछित नमूने जमे हुए किया गया है। नमूना के एक ही प्रकार से युक्त एकाधिक वाहक सैंडविच ही शीशी में संग्रहित किया जा सकता है।
    13. जब तक प्रतिकृति (चित्रा 1H) एक cryotank में वाहकों युक्त cryovials स्टोर।

आकृति 1
चित्रा 1. ऊतक तैयार और उच्च दबाव ठंड। (ए) Vibroslicer ऊतक अनुभाग के लिए इस्तेमाल किया।   (बी) के एक परिणामस्वरूप राज्याभिषेक माउस मस्तिष्क एसी के साथ कंधे से कंधा मिलाकर प्रमस्तिष्कखंड दिखाए युक्त अनुभागopper वाहक दो तरफा टेप की एक अंगूठी के साथ लगाया। धराशायी बॉक्स है कि आईटीसी की औसत दर्जे का paracapsular क्लस्टर में शामिल हित के क्षेत्र इंगित करता है। दो तरफा टेप में छेद का व्यास लगभग 1.5 मिमी है। (सी) तांबा वाहक की तैयारी के लिए उपकरण। डबल पक्षीय टेप, चिमटी, पंचर, तांबा वाहक, और कैंची: शीर्ष बाएँ एक घड़ी ढंग से। (डी) उच्च दबाव ठंड के लिए नमूना धारक में वाहक सैंडविच की निवेशन। वाहक सैंडविच नमूना धारक के छेद में रखा गया है। (ई) के बिना और दो ​​तरफा टेप की एक अंगूठी और "वाहक सैंडविच" के साथ कॉपर वाहक।   (एफ) दबाव टैंक यह करने के लिए तरल नाइट्रोजन खिलाने के साथ उच्च दबाव ठंड इकाई। (छ) एक cryovial जमे हुए ऊतकों शेयर करने के लिए। नोट शीशी शीशी (नोक) से बाहर प्रवाह करने के लिए नाइट्रोजन गैस की अनुमति के उच्च मध्यम स्थिति में खामियां हैं। (एच) Cryotank जमे हुए ऊतक के भंडारण के लिए। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

4. रुक-फ्रैक्चर और प्रतिकृति

  1. इलेक्ट्रॉन बीम बंदूकों की तैयारी
    1. इलेक्ट्रॉन बीम बंदूकों डालने से पहले, "झुकानेवाला प्लेट" के साथ ढाल को हटा दें। "सेटिंग गेज" कम कैथोड कवर के माध्यम से कोलिट चक में रेशा केंद्रित के लिए रखें।
      नोट: जबकि छोटे व्यास अंत प्लैटिनम बंदूक के लिए है सेटिंग गेज के बड़े व्यास अंत कार्बन बंदूक के लिए प्रयोग किया जाता है।
    2. गेज से अधिक नए रेशा स्लाइड जब तक "दबाव laminae" रेशा के सिरों दबाना कर सकते हैं, यह सुनिश्चित करना है कि फिलामेंट का तार एक कोण पर झूठ नहीं है।
    3. सेटिंग गेज निकालें और कार्बन रॉड डालने। सह कस द्वारा इसे ठीक करेंबाष्पीकरण छड़ी धारक की llet चक, यह सुनिश्चित करना है कि छड़ी के अंत की ऊंचाई नीचे से दूसरे तार के बीच में है। प्लैटिनम बंदूक के लिए, प्लैटिनम छड़ी के अंत की ऊंचाई ऊपर से दूसरे रेशा तार के बीच में होना चाहिए।
    4. झुकानेवाला प्लेट की जगह और फ्रीज फ्रैक्चर इकाई में बंदूकों डालें। उपयोग के बाद एक रेत विस्फ़ोटक के साथ बंदूकों को साफ करें।

चित्र 2
चित्रा 2. FRIL तकनीक का महत्वपूर्ण कदम का चित्रण।
तैयारी और प्रतिकृति के विश्लेषण के लिए आवश्यक विभिन्न चरणों की रूपरेखा। (1) ऊतक के उच्च दबाव ठंड। (2) विभंजन। जमे हुए ऊतक के fracturing के दौरान, प्लाज्मा झिल्ली के लिपिड bilayer हाइड्रोफोबिक इंटरफेस में दो हिस्सों में विभाजित है। प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन या तो exoplasmic (ई-चेहरा) या आद्य पर आवंटित कर रहे हैंplasmic झिल्ली (पी-चेहरा)। (3) प्रतिकृति। कार्बन (सी) के वाष्पीकरण खंडित ऊतक की सतह पर लिपिड और प्रोटीन जाल। सामग्री एक और 15 एनएम कार्बन परत है जो प्रतिकृति की संरचना (सी-परत, पंडित-ग्रहण) को मजबूत के साथ एक 60 डिग्री के कोण पर ग्रहण के लिए 2 एनएम प्लैटिनम / कार्बन के साथ लेपित, और फिर रहा है। (4) solubilization। प्रतिकृति झिल्ली द्वारा फँस नहीं ऊतक तो एसडीएस समाधान के साथ solubilized है। (5) लेबलिंग। प्रोटीन के हित के विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी (प्राथमिक Ab) और माध्यमिक एंटीबॉडी (माध्यमिक Ab) एक सोने के कण (एयू) के साथ संयुग्मित से बना एक जटिल का उपयोग कर प्रतिकृति पर देखे जा सकते हैं। सोने के कणों के विभिन्न आकारों का उपयोग एक ही प्रतिकृति पर एक से अधिक प्रोटीन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। (6) immunolabeling के बाद, प्रतिकृतियां तांबा जाल ग्रिड पर एकत्र कर रहे हैं और 80 एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण -। 100 केवी कृपया क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ k।

  1. फ्रीज फ्रैक्चर इकाई की स्थापना
    1. फ्रीज फ्रैक्चर और नकल प्रक्रियाओं की एक विस्तृत वर्णन के लिए 1 करने के लिए साधन बदल कर फ्रीज फ्रैक्चर इकाई (चित्रा 3 ए) पर स्विच, निर्माता द्वारा प्रदान ऑपरेटिंग निर्देश देखें।
    2. फ्रीज फ्रैक्चर डिवाइस ठंडा करने से पहले गर्म हवा के साथ यूनिट के पूरे शीतलन प्रणाली बाहर सेंकना। एमटीसी 010 डिवाइस में "विगलन" बटन (तापमान नियंत्रण इकाई) (चित्रा 3 ए) प्रेस और 45 मिनट के लिए सेंकना बाहर प्रक्रिया चलाते हैं।
    3. वैक्यूम स्टेशन को सक्रिय करें। 10 -7 मिलीबार - रुक फ्रैक्चर इकाई आमतौर पर ~ 10 -6 के एक निर्वात रेंज में चल रही है।
    4. नाइट्रोजन टैंक को भरने और इसे फ्रीज फ्रैक्चर इकाई से कनेक्ट। जाँच करें कि वाल्व धारक सूखी है और यह भी वाल्व धारक के सम्मिलन से पहले टैंक के प्रवेश को साफ (आर्द्रता vacuu के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंएम और एन के संकेत टैंक के 2 भरने)।
    5. -115 डिग्री सेल्सियस के तापमान की स्थापना करके ठंडा करने की शुरुआत करें। शीतलक के बारे में 45 मिनट लगते हैं।
    6. इलेक्ट्रॉन बीम बंदूकों डालें और वाष्पीकरण के लिए निम्नलिखित मानकों तक पहुँचने के लिए वर्तमान और वोल्टेज समायोजित:
      कार्बन बंदूक: पर रोटेशन, स्थिति 90 डिग्री, कार्बन संचय की दर 0.1 - 0.2 एनएम / सेक
      कार्बन-प्लैटिनम बंदूक: रोटेशन बंद, स्थिति 60 डिग्री, संचय 0.06 की दर - 0.1 एनएम / सेक
      नोट: एक बंदूक कार्बन या प्लेटिनम रॉड, उपयोग से पहले 3 मिनट के लिए देगास के आदान-प्रदान के बाद पहली बार के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. Fracturing और नकल
    1. सुनिश्चित करें कि सभी जोड़तोड़ तरल नाइट्रोजन में किया जाता है बना रही है डबल प्रतिकृति तालिका में जमे हुए वाहक सैंडविच डालें।
    2. एक देवर पोत के लिए डबल प्रतिकृति तालिका स्थानांतरण और नमूना चरण रिसीवर के लिए यह 45 डिग्री के कोण पर तय कर लो। तरल नाइट्रोजन का स्तर हमेशा दोहरी प्रतिकृति तालिका के ऊपर होना चाहिए। तालिका जोड़तोड़ के साथ डबल प्रतिकृति तालिका उठाओ और ठंड मंच पर फ्रीज फ्रैक्चर इकाई में डालें। डबल प्रतिकृति तालिका के तापमान -115 डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित करने के लिए अनुमति देने के लिए लगभग 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. जाँच करें कि वैक्यूम नीचे 10 -6 मिलीबार है और तापमान -115 डिग्री सेल्सियस है।
    4. कफन डबल प्रतिकृति तालिका के ऊपर रखा से जुड़े पहिया के मैनुअल काउंटर दक्षिणावर्त रोटेशन से ऊतक फ्रैक्चर। जब कफन बदल जाता है, यह डबल प्रतिकृति तालिका बलों को खोलने के लिए, ऊतक fracturing।
    5. "उच्च तनाव" फ्रीज फ्रैक्चर इकाई (चित्रा 3 ए) के ईवीएम 030 डिवाइस (इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण नियंत्रण इकाई) में बटन दबाएँ।
    6. एक इलेक्ट्रॉन बीम 5 एनएम के एक मोटाई के लिए एक 90 डिग्री के कोण पर तैनात बंदूक के माध्यम से कार्बन (घूर्णन) के वाष्पीकरण से दोहराने की हड्डी टूट ऊतक (चित्रा 3 सी) के उजागर सतहों, एक दिशाहीन shado द्वारा पीछा किया2 एनएम के एक मोटाई के लिए एक 60 डिग्री के कोण पर प्लैटिनम कार्बन के साथ पंख। अंत में, एक 90 डिग्री के कोण (घूर्णन) से कार्बन की एक 15 एनएम मोटी परत लागू होते हैं।
    7. वाष्पीकरण के लिए निम्नलिखित मानकों का उपयोग करें:
      1 कार्बन: पर रोटेशन, स्थिति 90 °; गति 0.1 - 0.2 एनएम / सेकंड; 5 एनएम
      2 कार्बन-प्लेटिनम: स्थिति 60 °; गति 0.06 - 0.1 एनएम / सेकंड; 2 एनएम
      3 कार्बन: पर रोटेशन, स्थिति 90 °; गति 0.3 - 0.5 एनएम / सेकंड; 15 एनएम
    8. फ्रीज फ्रैक्चर इकाई से दोहराया नमूनों निकालें और उन्हें एक चीनी मिट्टी के 12 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 4 ए) टीबीएस के साथ भरा करने के लिए स्थानांतरण (Tris खारा बफर, 7.4 पीएच)।
    9. एक प्लैटिनम पाश वायर रॉड का प्रयोग, नमूना वाहक (चित्रा -4 ए) से दोहराया ऊतक को हटा दें।
    10. दोहराएँ 4.3.10 के लिए 4.3.1 कदम जब तक सभी नमूने दोहराया गया है।

चित्र तीन r /> चित्रा 3. रुक-fracturing और प्रतिकृति।
(ए) फ्रीज फ्रैक्चर इकाई। मशीन कई नियंत्रण इकाइयों और एक मॉनिटर शामिल हैं। नमूने चैम्बर के बाईं ओर एक बंदरगाह के माध्यम से चैम्बर में पेश कर रहे हैं। एक दबाव तरल नाइट्रोजन कंटेनर चरण शांत करने के लिए फ्रीज फ्रैक्चर इकाई से जुड़ा है। इकाइयों में से दो के शो बढ़े दृश्य (यूपीसी 010 और एमडीसी 010) और मॉनिटर दूसरी कार्बन की परत के वाष्पीकरण के दौरान मानकों को प्रदर्शित चित्र के नीचे।   (बी) खोला (बाएं) और बंद (दाएं) डबल प्रतिकृति तालिका के विचार। "वाहक सैंडविच" तालिका के स्लॉट में डाला जाता है (तीर द्वारा संकेत)। छोटे हथियारों हेरफेर के दौरान बाहर गिरने से रोकने "वाहक सैंडविच"। (सी) एक खंडित और दोहराया नमूना। नकली खंडित ऊतक के शीर्ष पर के रूप में पतली काली फिल्मों दिखाई देते हैं।53 / 53853fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. प्रतिकृति के एसडीएस पाचन
    1. एक 4 मिलीलीटर कांच एसडीएस पाचन बफर (2.5% सोडियम सल्फेट Lauryl, 15 मिमी Tris में 20% सुक्रोज, पीएच 8.3) के 1 मिलीलीटर के साथ भरा शीशी स्थानांतरण प्रतिकृति। (45 स्ट्रोक / मिनट) झटकों के साथ 80 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए डाइजेस्ट।
    2. स्थानांतरण एक नया आरटी पर एसडीएस पाचन बफर और दुकान के साथ भरा ट्यूब के लिए प्रतिकृतियां।

5. immunolabeling

नोट: सभी incubations एंटीबॉडी के साथ incubations के लिए छोड़कर, कोमल झटकों के साथ आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. ताजा एसडीएस पाचन बफर में 10 मिनट के लिए प्रतिकृति धो लें।
  2. 5 मिनट के लिए टीबीएस में 2.5% बीएसए (गोजातीय सीरम albumin), और फिर 3 एक्स 10 0.1 के साथ मिनट% बीएसए टीबीएस में के साथ एक बार प्रतिकृति धो लें।
  3. 1 घंटे के लिए 5% BSA के साथ टीबीएस में ब्लॉक गैर विशिष्ट बंधन साइटों।
  4. प्राथमिक विरोधी लागू करेंशव 2% बीएसए टीबीएस में पतला। 72 घंटे के लिए 15 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4C) पर एक 30 μl ड्रॉप (चित्रा 4 बी) एक नम कक्ष में incubations प्रदर्शन करना।
    1. इस अध्ययन, प्रक्रिया दोनों खंडित ऊतक से प्रतिकृतियां के लिए। (: 1: 200 कमजोर पड़ने) या एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन के खिलाफ उठाया अमीनो एसिड 660 को कवर 754 माउस GluR1 सभी AMPA आर सब यूनिटों के लिए आम की - एक गिनी पिग पॉलीक्लोनल अमीनो एसिड 717 के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के साथ एक प्रतिकृति सेते - NMDA-आर के NR1 सबयूनिट के 811, और एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के खिलाफ उठाया (कमजोर पड़ने: 500: 1) (कमजोर पड़ने: 1: 300)।
    2. (: 1: 500 कमजोर पड़ने) 398 चूहे μ-opioid रिसेप्टर की - एक खरगोश पॉलीक्लोनल एक सिंथेटिक पेप्टाइड के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी एसिड 384 एमिनो करने के लिए इसी के साथ अन्य प्रतिकृति सेते हैं।
  5. 0.05% BSA के साथ टीबीएस में धो (3 एक्स 5 मि।)।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें। इस अध्ययन यू के लिएएसई सोना (ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए 5 एनएम, 10 के लिए μ-opioid रिसेप्टर्स और / या ChR2-YFP के लिए 15 एनएम) संयुग्मित 2% BSA के साथ टीबीएस में पतला एंटीबॉडी। माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1:30 और 15 डिग्री सीओ / एन पर एक 30 μl ड्रॉप में सेते हैं।
  7. आरटी पर 0.05% बीएसए टीबीएस में धो 3 एक्स 5 मिनट।
  8. धो ultrapure पानी में 2 एक्स 5 मिनट।
  9. Formvar लेपित 100-रेखा समानांतर बार ग्रिड (चित्रा 4D) पर माउंट प्रतिकृति।

6. प्रतिकृति विश्लेषण

  1. छवि पर 80 या 100 केवी एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) के साथ प्रतिकृतियां। एक सीसीडी (चार्ज डिवाइस युग्मित) कैमरा के माध्यम से डिजिटल छवियों मोल।
  2. ऑफलाइन, दोनों स्थलों का उपयोग कर प्रतिकृतियां (चित्रा 4E) से छवियों पर इसी क्षेत्रों पाते हैं। छवि जे पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र और immunogold लेबल कणों का विश्लेषण किया रिसेप्टर के खिलाफ निर्देशित की संख्या का निर्धारण का उपयोग कर डिजिटल छवियों का विश्लेषण।


चित्रा 4. प्रतिकृति की immunolabeling।
(ए) जोड़ तोड़ और प्रतिकृतियां धोने के लिए उपकरण। एक चीनी मिट्टी के 12 अच्छी तरह से थाली (शीर्ष सही) और कांच pipettes के 2 प्रकार (ऊपर बाएं)। दौर टिप (नीचे बाएँ) के साथ कांच पिपेट प्रतिकृति हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और प्लेटिनम की छड़ (नीचे केंद्र) के साथ पिपेट प्रतिकृतियां प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कपड़े धोने बफर में एक प्रतिकृति (नीचे सही)। (बी) प्रतिकृतियां के immunolabeling बूँदें (30 μl) एक टिशू कल्चर 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा पर रखा में किया जाता है। ध्यान दें कि एक प्रतिकृति बफर युक्त एंटीबॉडी की एक बूंद से आच्छादित है। वाष्पीकरण को रोकने के लिए, टिशू पेपर का एक टुकड़ा सिक्त अच्छी तरह के भीतरी किनारे के आसपास फिट है। (सी) immunolabeling कदम के लिए इनक्यूबेटर। Incubations 15 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है। (डी) पर मुहिम शुरू की एक प्रतिकृति एक formvar लेपित 100-रेखा समानांतर बार ग्रिड। (ई) प्रतिकृतियां की एक जोड़ी से कम बढ़ाई micrographs। बिंदीदार चौकों तीन विशिष्ट स्थलों का संकेत इसी प्रतिकृतियां में एक स्थान की पहचान करने के लिए। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन। सभी डेटा को दिखाया जाता है के रूप में मतलब ± SEM यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

FRIL तकनीक, जब माइक्रोबियल उत्पत्ति 21, यानी, प्लाज्मा झिल्ली में एकीकृत और प्रभावी ढंग से एक्सोन साथ anterogradely जाया चैनलों की optogenetic actuators की अभिव्यक्ति के साथ संयुक्त, एक परिभाषित उपसमूह पर मात्रात्मक की AMPA रु और NMDA रु पोस्टअन्तर्ग्रथनी अभिव्यक्ति की जांच करने की अनुमति देता है synapses के। यह यहां प्रमस्तिष्कखंड में आईटीसी न्यूरॉन्स पर अलग thalamic नाभिक (जैसे, पिन / MGN) से होने वाले एक्सोन के लिए दिखाया गया है। यह दृष्टिकोण आईटीसी न्यूरॉन्स, कोशिकाओं का एक समूह है कि अब तक एक विस्तृत संरचनात्मक और आणविक लक्षण वर्णन करने के लिए आग रोक दिया गया है पर व्यक्तिगत संवेदी इनपुट synapses के एक आणविक विश्लेषण सक्षम बनाता है।

चार सप्ताह पिन / MGN में rAAV-ChR2-YFP के stereotactic इंजेक्शन के बाद, ChR2-YFP पॉजिटिव एक्सोन घनी ला, amygdalostriatal संक्रमण क्षेत्र (Astria) और औसत दर्जे का paracapsular मैं इन्नेर्वतेद प्रमस्तिष्कखंड में टीसी क्लस्टर, एक पैटर्न पिछले ट्रेसिंग के साथ पूरी तरह से संगत 16 अध्ययन, 22। हम यह भी तीव्र सोने rAAV-ChR2-YFP- से axons और फ्रीज फ्रैक्चर प्रतिकृति में टर्मिनलों के पी चेहरे पर ChR2-YFP के लिए immunolabeling का पता चला इंजेक्शन चूहों (चित्रा 5 ए), लेकिन गैर इंजेक्शन चूहों से प्रतिकृतियां में नहीं है। एक प्रतिकृति में ग्लूटामेटरगिक synapses के पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली विशेषज्ञता प्लाज्मा झिल्ली 2, 23 की ई-चेहरे पर intramembrane कणों (आईएमपीएस) का एक समूह के रूप में मनाया जा सकता है, और अक्सर अपने प्रेस्य्नाप्तिक प्लाज्मा झिल्ली 7 के पी चेहरे के साथ है (चित्रा 5 ब-सी)। इन सुविधाओं पिन / MGN अक्षतंतु टर्मिनल द्वारा गठित ग्लूटामेटरगिक synapses के पोस्टअन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञता की पहचान करने की अनुमति दी (चित्रा 5 और 6)। हम एक एंटीबॉडी कि, सभी चार यूनिटों (GluA1-4) को पहचानता है, जबकि NMDA रु आवश्यक NR1 सबयूनिट के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग पाया गया साथ लेबल AMPA रु।

ntent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> उपकरण एक ही प्रतिकृति है कि क्या इन synapses वृक्ष के समान कांटा या आईटीसी न्यूरॉन्स की शाफ्ट के साथ किए गए थे पर पता लगाने के लिए की कमी की वजह से, हम μ के लिए इसी प्रतिकृति चेहरे लेबल -opioid रिसेप्टर्स के रूप में आईटीसी न्यूरॉन्स इन रिसेप्टर्स 24 की postsynaptically उच्च स्तर व्यक्त करते हैं। यह दो प्रतिकृतियां (चित्रा 5C-एफ और चित्रा 6A-डी) में एक ही पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रोफाइल की पहचान के लिए आवश्यक है कि एक रणनीति स्थलों को रोजगार का उपयोग कर (चित्रा 4E) ।

चित्रा 5
चित्रा 5. immunogold कणों द्वारा प्रतिकृति पर ChR2-YFP और ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की जांच। (ए) एक-पार की हड्डी टूट अक्षतंतु टर्मिनल (हल्का नीला) और उसके पी-चेहरा 15 एनएम सोने का पता लगाने के ChR2-YFP कणों के साथ लेबल के छोटे हिस्से। टर्मिनल के भीतर, झिल्ली ओच कई synaptic पुटिकाओं मनाया जा सकता है (एसवी)। प्लाज्मा झिल्ली को प्रतिबंधित बड़े हिस्से में immunolabeling की विशिष्टता पर ध्यान दें। ChR2 के लिए लेबलिंग पिन / MGN से होने के रूप में टर्मिनल को पहचानती है। टर्मिनल एक रीढ़ की हड्डी के साथ एक असममित अन्तर्ग्रथन रूपों। पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली विशेषज्ञता (PSD) ई-चेहरे पर intramembrane कणों की एक विशेषता क्लस्टर पता चलता है और 5 एनएम सोने खुलासा AMPA रु कणों के साथ लेबल है। (बी) के एक ChR2 व्यक्त अक्षतंतु (15 एनएम सोने के कणों के साथ लेबल) के पी-फेस दो डेन्ड्राइट, उन्हें दो PSDs 5 एनएम सोने खुलासा NMDA रु कणों के साथ लेबल रखने की एक सीमा से सटे दिखाया गया है। (सीडी) एक पिन / MGN-आईटीसी अन्तर्ग्रथन के पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली के सामने चेहरे। (सी) टर्मिनल के पी चेहरे ChR2 (15 एनएम सोने के कणों के साथ लेबल) को व्यक्त करता है और दो ​​वृक्ष के समान शाफ्ट, उन्हें दो PSDs के लिए AMPA रु (5 एनएम सोने के कणों) लेबल युक्त में से एक के ई चेहरे पर फैली हुई है। ( (एफई) धराशायी लाइनों द्वारा उल्लिखित क्षेत्रों के बढ़े हुए देखा गया। स्केल सलाखों:। 500 एनएम कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

के लिए पिन / MGN-आईटीसी synapses में AMPA रु Immunoparticles सभी छोटा सा क्लस्टर से अधिक पाया गया था, पोस्टअन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञता (चित्रा 5E) के भीतर एक सजातीय वितरण का सुझाव दे। एक काफी उच्च (unpaired टी परीक्षण पी <0.018) AMPA आर लेबलिंग का घनत्व पिन / MGN में मनाया गया आईटीसी कांटा पर synapses (715 ± 38 सोने के कणों / माइक्रोन 2 n = 32) आईटीसी dendrites पर synapses की तुलना में (590 ± 44 सोने के कणों / माइक्रोन 2 n = 32)। कुल मिलाकर, का पिन / MGN-आईटीसी synapses में AMPA रु घनत्व एक अपेक्षाकृत कम से पता चलाविचरण (विचरण का गुणांक, सीवी = 0.37) एक सजातीय वितरण के साथ संगत।

के लिए पिन / MGN-आईटीसी synapses में NMDA रु Immunoparticles अक्सर असमान पोस्टअन्तर्ग्रथनी छोटा सा समूहों (चित्रा 5 ब) के भीतर वितरित मनाया गया। NMDA आर लेबलिंग का घनत्व समान था (unpaired टी परीक्षण पी = 0.39) पिन / MGN के बीच आईटीसी कांटा पर synapses (1070 ± 153 सोने के कणों / माइक्रोन 2 n = 8) और आईटीसी डेन्ड्राइट (812 ± 183 सोने के कणों / माइक्रोन 2 n = 9)। क्या AMPA रु मनाया गया विपरीत, की पिन / MGN-आईटीसी synapses में NMDA रु घनत्व अत्यधिक चर रहा था (सीवी = 0.54)।

चित्रा 6
चित्रा 6 AMPA रु और NMDA रु immunolabeling की पहचान की पिन / MGN-आईटीसी synapses पर।
(अटल बिहारी) एक पिन / MGN-आईटीसी के पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली के सामने चेहरेएक वृक्ष के समान रीढ़ जिसमें टर्मिनल के पी चेहरे व्यक्त ChR2 पर बनाया अन्तर्ग्रथन (15 एनएम सोने के कणों के साथ लेबल) और एक वृक्ष के समान रीढ़ पर PSD के लिए AMPA रु (5 एनएम सोने के कणों) लेबल है। (सीडी) धराशायी लाइन द्वारा उल्लिखित क्षेत्रों के बढ़े हुए देखा गया। इन क्षेत्रों में PSD का एक बेहतर विचार अनुमति देने के लिए लगभग 45 डिग्री वामावर्त घुमाया गया है। (ई) AMPA आर कणों आईटीसी कांटा और dendrites में synaptic क्षेत्र बनाम की संख्या का Scatterplots। दोनों संरचनाओं में, एक सकारात्मक संबंध पाया गया है। (एफ) आईटीसी कांटा और dendrites में synaptic क्षेत्र के खिलाफ NMDA आर कणों की संख्या का Scatterplots। एक महत्वपूर्ण सकारात्मक संबंध केवल वृक्ष के समान spines में पाया गया था। स्केल सलाखों:। 500 एनएम कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

इसलियेअक्सर हिस्से में छोटा सा पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्लस्टर मढ़ा प्रेस्य्नाप्तिक प्लाज्मा झिल्ली के पी-चेहरा, हम synapses के केवल 30% की synaptic क्षेत्र का अनुमान सकता है (कांटा: 0.032 माइक्रोन 2, सीमा क्षेत्र का मतलब: 0.007 0.063 माइक्रोन से 2 n = 8; डेन्ड्राइट: 0.047 माइक्रोन 2, रेंज: 0.024 0.166 माइक्रोन से 2 n = 11)। ये एक ऐसी ही रेंज में थे के रूप में पहले विश्लेषण किया telencephalic glutamatergic synapses 25।

दोनों कांटा और dendrites में, के लिए व्यक्तिगत synapses में AMPA रु सोने immunoparticles की संख्या सकारात्मक synaptic क्षेत्र के साथ सहसंबद्ध था (स्पीयरमैन, कांटा: आर = 0.88, डेन्ड्राइट: आर = 0.60, पी <0.0001) (चित्रा 6E)। लेकिन डेन्ड्राइट (आर = 0.21, पी = 0.29) (चित्रा 6F में नहीं: इसके विपरीत, के लिए NMDA रु सोने immunoparticles की संख्या कांटा (आर = 0.90, पी <0.002 स्पीयरमैन, कांटा) में synaptic क्षेत्र के साथ संबंध स्थापित करने के लिए मिला था )।

Discussion

रुक-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 40 साल के लिए ultrastructural अनुसंधान के क्षेत्र में एक प्रमुख तकनीक से किया गया है। हालांकि, झिल्ली की आणविक संरचना का अध्ययन करने के लिए प्रभावी साधन के अभाव में इसके उपयोग में एक महत्वपूर्ण गिरावट का उत्पादन किया। हाल ही में, वहाँ immunogold लेबलिंग 1, 2, अर्थात् FRIL तकनीक से अभिन्न झिल्ली प्रोटीन प्रकट करने के लिए प्रभावी तरीके से विकास के कारण फ्रीज फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में एक प्रमुख पुनरुद्धार किया गया है।

FRIL तकनीक अन्य immunogold ultrastructural तरीकों पर कई फायदे के पास। सबसे पहले, प्रोटीन संवेदनशीलता बढ़ रही एंटीबॉडी के लिए आसानी से सुलभ हैं। दूसरा, इस तरह के पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली के रूप में प्लाज्मा झिल्ली विशेषज्ञताओं, प्रतिकृति के दो आयामी सतह पर, के बड़े हिस्से का जोखिम सेरी की श्रमसाध्य और समय लेने वाली पुनर्निर्माण के बिना स्थानिक वितरण और ब्याज के अणुओं के भौतिक समीपता के निरीक्षण की अनुमति देता हैअल ultrathin वर्गों। तीसरा, प्लाज्मा झिल्ली के दोनों हिस्सों की उपलब्धता प्रोटीन है कि प्रत्येक व्यक्ति संरचना के लिए लेबल किया जा सकता है की संख्या, बशर्ते उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध हैं बढ़ जाती है। fracturing पर, विभाजन झिल्ली के हाइड्रोफोबिक चेहरे कार्बन-प्लैटिनम कि खंडित सतह पर शेष प्रोटीन डोमेन entrenches साथ लेपित है। यह इन डोमेन में एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग रोकता है। एक प्रतिकृति का पी-चेहरे पर उदाहरण के लिए केवल पुरस-संबंधी अंतरिक्ष का सामना करना पड़ epitopes जबकि ई-चेहरा केवल exoplasmic अंतरिक्ष एंटीबॉडी द्वारा बाध्य किया जा सकता का सामना करना पड़ epitopes पर, एंटीबॉडी से पता लगाया जा सकता है (देखें चित्र 2)।

दूसरी ओर, FRIL तकनीक को भी कुछ सीमाएं 2 से ग्रस्त है। भंग बेतरतीब ढंग से उत्पन्न होती है, यह विशिष्ट कोशिकाओं या संरचनाओं को लक्षित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। यह भी एक नमूना पूर्वाग्रह, जैसे करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं अन्तर्ग्रथन संग्रह में, एफआरए के विभिन्न संभावना दियाविभिन्न वक्रता (जैसे, शाफ्ट बनाम कांटा) के साथ संरचनाओं की झिल्ली के साथ cturing। इसके अलावा, दो चेहरों में से एक के लिए झिल्ली प्रोटीन के आवंटन अप्रत्याशित है। इसलिए, पी-चेहरा है या ई-सामना करने के लिए एक प्रोटीन का वितरण, विशेष रूप से मात्रात्मक अध्ययन के लिए, ध्यान से होना चाहिए intracellular और बाह्य डोमेन के लिए प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी का उपयोग कर जांच की। अंत में, इस तरह के प्रेस्य्नाप्तिक अक्षतंतु टर्मिनल के रूप में कुछ संरचनाओं, की प्रतिकृति में पहचान है, जब केवल रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर मुश्किल हो सकता है। हालांकि, मार्कर प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करें या टैग किए अभिन्न झिल्ली प्रोटीन या वायरल वैक्टर अतिरिक्त उपकरणों का उपयोग प्रदान करता चैनलों के पारगमन की हड्डी टूट झिल्ली की पहचान की सुविधा के लिए। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन μ-opioid रिसेप्टर्स के लिए प्रमस्तिष्कखंड या लेबलिंग में उनके axonal efferents की पहचान करने के thalamic न्यूरॉन्स में ChR2-YFP के पारगमन का फायदा उठाया पोस्टअन्तर्ग्रथनी मेरे प्रकट करने के लिएआईटीसी न्यूरॉन्स की mbranes।

आदेश FRIL तकनीक को सफलतापूर्वक करने के लिए, विशेष रूप से ध्यान ऊतक निर्धारण के विषय में लिया जाना चाहिए। मजबूत ऊतक निर्धारण (> 2% paraformaldehyde) पार भंग होने का एक उच्च दर और लेबलिंग संवेदनशीलता में कमी हो सकती है। दूसरी ओर, कमजोर fixations ऊतक से निपटने की तैयारी (जैसे, वर्गों के काटने) कठिन बनाते हैं। यह भी है कि छंटनी ब्लॉक की मोटाई दो तरफा टेप की मोटाई मैचों को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अगर नमूना की मोटाई टेप की तुलना में कम है, ऊतक की सतहों दो धातु वाहक की सतह को संलग्न नहीं हो सकता है, फलस्वरूप जमे हुए नमूना खंडित नहीं है। ऊतक गहरा हो जाता है, तो यह अनिवार्य संरचनात्मक विकृतियों के साथ संकुचित हो जाएगा जब दो तांबे के वाहकों के सैंडविच बना है। तापमान जिस पर नमूना खंडित किया जाता है (इस प्रोटोकॉल में, -115 डिग्री सेल्सियस) भी एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैप्रतिकृति की संरचना पर। उच्च तापमान ऐसे ऊतक की सतह पर जल वाष्प का संघनन के रूप में पूर्व या वाष्पीकरण के दौरान कलाकृतियों की एक उच्च दर का उत्पादन कर सकता है। कम तापमान (<-125 डिग्री सेल्सियस) fracturing के दौरान सामग्री के बंद बंटवारे का खतरा बढ़ सकता है। इस सामग्री नमूना की सतह पर गिर जाते हैं या इसे से जुड़े रह सकते हैं। सामग्री के इन गुच्छे भी लेपित और छवि पर काले धब्बे के उत्पादन विपरीत है। कम तापमान पर fracturing भी विशेष रूप से इस तरह के वृक्ष के समान कांटा के रूप में छोटे से ठीक संरचनाओं के लिए पार भंग की आवृत्ति को प्रभावित कर सकते हैं। प्रतिकृतियां की तैयारी में एक और महत्वपूर्ण कदम डिटर्जेंट पाचन है। अगर पाचन अधूरा है, पचाया नहीं ऊतक प्रतिकृति के रूप में काले धब्बे दिखाई देता है, मंदिर में संरचना का विश्लेषण confounding। इसके अलावा, पचाया नहीं ऊतक गैर विशेष रूप से जाल या बाँध एंटीबॉडी कर सकते हैं, पृष्ठभूमि लेबलिंग बढ़ रही है। दूसरी ओर, डिटर्जेंट के उपयोग केऊतक पाचन के लिए उनके द्वितीयक और तृतीयक संरचनाओं में फेरबदल प्रतिकृति के लिए जुड़े अणुओं denature कर सकते हैं। इसलिए, कुछ एंटीजन के लिए यह धीरे-धीरे अतिरिक्त धोने कदम के साथ एसडीएस की एकाग्रता को कमजोर करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

immunolabeling के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित सोने के कण के विभिन्न आकारों की उपलब्धता एक ही समय में पता लगाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन केवल गुणात्मक, कई प्रोटीन, ऐसे पोस्टअन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञता के रूप में प्लाज्मा झिल्ली के विशिष्ट microdomains, में भी। हालांकि, steric बाधा की वजह से, मात्रात्मक अध्ययन आम तौर पर सिर्फ एक अणु का पता लगाने के लिए सीमित हैं। सोने के कण का आकार भी लेबलिंग प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकते हैं।

FRIL में लेबलिंग की व्याख्या के लिए, यह लचीला जटिल फार्म के कारण मन है कि immunogold कण प्रतिजन से 20-25 एनएम के एक त्रिज्या के साथ एक गोलार्द्ध के भीतर कहीं भी स्थित हो सकता है में रखा जाना चाहिएप्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी 26 से एड। सिद्धांत और FRIL और संबंधित तकनीकों के अभ्यास पर अधिक जानकारी के लिए, हम अन्य पद्धति लेख 27, 28 के लिए भी पाठक देखें।

FRIL तकनीक हाल ही में विविध अन्तर्ग्रथन आबादी 29, 30। इसके अलावा, के लिए AMPA रु FRIL तकनीक का पता लगाने संवेदनशीलता एक कार्यात्मक AMPA प्रति एक immunogold कण के रूप में उच्च के रूप में अनुमान लगाया गया था ग्लूटामेट रिसेप्टर स्थानीयकरण के उच्च संकल्प मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है आर चैनल 29। इस प्रकार, इस दृष्टिकोण समग्र यों और केंद्रीय synapses पर AMPA रु और NMDA रु पोस्टअन्तर्ग्रथनी अभिव्यक्ति के पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए बहुत उपयोगी है। यहाँ, हम पिन / MGN-आईटीसी synapses पर इसके लागू, एक साइट की संभावना सबसे अधिक डर कंडीशनिंग के दौरान अमेरिकी जानकारी relaying के लिए महत्वपूर्ण प्रदर्शन किया। एक एंटीबॉडी AMPA रिसेप्टर सब यूनिटों ग्लू का अत्यधिक संरक्षित बाह्य अमीनो एसिड के अवशेष के खिलाफ उठाया का उपयोगA1-GluA4, हम एक भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली विशेषज्ञताओं को इसी IMP समूहों के भीतर सोने के कणों का वितरण पाया। आईटीसी कांटा में AMPA रु घनत्व पिन / MGN thalamic afferents द्वारा लक्षित शाफ्ट synapses की तुलना में काफी अधिक था। दोनों रीढ़ की हड्डी और शाफ्ट synapses पर, के लिए AMPA रु लेबलिंग और पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र के बीच एक सकारात्मक संबंध का पता चला था, एक सुविधा अन्य ग्लूटामेटरगिक synapses 25 के लिए आम। की पिन / MGN-आईटीसी synapses में AMPA रु घनत्व में कम विचरण cortical synapses 25 से thalamic efferents 7 द्वारा गठित अन्य synapses के समान है, लेकिन अलग एक सजातीय वितरण इंगित करता है। इसके विपरीत, की NMDA रु घनत्व अधिक चर रहा था और तुलना AMPA रु एक अलग विनियमन सुझाव रीढ़ की हड्डी और शाफ्ट synapses के बीच अलग नहीं किया था। भविष्य में, FRIL तकनीक के उच्च reproducibility केवल केंद्रीय synapses के बेसल आणविक संरचना का आकलन करने के लिए अनुमति नहीं दी जाएगी, लेकिन सी का पता लगाने की सुविधा हो सकती हैडर सीखने के बाद ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर संख्या और sub अन्तर्ग्रथनी वितरण में hanges, पूरक इन सूचनाओं के पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी गुण के पूर्व vivo रिकॉर्डिंग।

अंत में, इस दृष्टिकोण अन्य जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है कई अन्य तंत्रिका सर्किट में इनपुट-विशिष्ट उत्तेजक synapses की संरचना समारोह संबंधों में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, जिसमें आदानों की उत्पत्ति और प्रकृति और पोस्टअन्तर्ग्रथनी तत्वों की संरचना को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन समस्याग्रस्त है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Stereotactic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectants
Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointments
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Name Company Catalog Number Comments
Tissue preparation
Paraformaldehyde EM grade Agar Scientific Ltd., United Kingdom AGR1018
Saturated picric acid solution Sigma-Aldrich, USA P6744-1GA
Na2HPO4-2H20 Merck Millipore, Germany 1065860500
NaH2PO4-2H2O  Merck Millipore, Germany 1063451000
NaCl Merck Millipore, Germany 1064041000
4N NaOH Carl Roth, Germany T198.1
Thiopental Sandoz, Austria 5,133
Glycerol Sigma-Aldrich, USA G5516-500ML
GenPure ultrapure water system Thermo Fisher Scientific, USA 50131235
Peristaltic pump ISMATEC, Germany ISM 930C
Filter Paper MACHEREY-NAGEL, Germany MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S Leica Microsystems, Austria
Ophthalmic scalpel Alcon Laboratories, USA can be replaced by other ophthalmic scalpels
Perfusion cannula Vieweg, Germany F560088-1 can be replaced by similar items from other companies
Name Company Catalog Number Comments
High-pressure  Freezing
Copper carriers Engineering Office M. Wohlwend, CH 528
Sidol Polish Henkel, Germany can be replaced by same item from other companies
Chamois skin Household supply store
Hole punch, 1,5mm Stubai, Austria can be replaced by same item from other companies
Denatured ethanol Donauchem, Austria can be replaced by same item from other companies
Acetone Roth, Germany 9372.5 CAUTION!
High Pressure Freezing Machine HPM 010 BalTec, CH; now Leica Microsystems HPM010 not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100
Stereo-microscope Olympus, Japan SZX10
Liquid nitrogen CAUTION!
Cryo-vials Roth, Germany E309.1 can be replaced by same item from other companies
CryoCane Nalge Nunc International,USA 5015-0001 can be replaced by same item from other companies
CryoSleeve Nalge Nunc International,USA 5016-0001 can be replaced by same item from other companies
Liquid nitrogen storage vessel Cryopal, France GT38 can be replaced by same item from other companies
Non-ionic detergent (Lavocid) Werner & Mertz Professional, Germany
Name Company Catalog Number Comments
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1 JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany SANDURET 2-K can be replaced by same item from other companies
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21µ JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany 955932
Freeze Fracture System BAF 060 BalTec, CH; now Leica Microsystems BAF060
Ceramic 12 well plate Gröpel, Austria 14511 can be replaced by same item from other companies
Trizma base SIGMA, USA T1503 can be replaced by same item from other companies
Trizma hydrochloride SIGMA, USA T3253 can be replaced by same item from other companies
Sodium chloride Merck, Germany 1,064,041,000 can be replaced by same item from other companies
SDS, Sodium lauryl sulfate Roth, Germany 5136.1 CAUTION! ;  can be replaced by same item from other companies
Sucrose Merck, Germany 1,076,871,000 can be replaced by same item from other companies
TRIS Roth, Germany 5429.3 can be replaced by same item from other companies
Universal Hybridization Oven Binder, Germany 7001-0050 can be replaced by same item from other companies
Name Company Catalog Number Comments
Immunolabelling
BSA SIGMA, USA A9647 can be replaced by same item from other companies
Anti-GFP Antibody Molecular Probes, USA A11122
Anti-pan-AMPAR Antibody Frontier Institute, Japan pan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 Merck Millipore, Germany MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody ImmunoStar, USA 24216
EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody BBInternational, UK EM.GAG5
EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody BBInternational, UK EM.GAR15
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody AURION, Netherlands DAR 10nm
Copper grids, 100 Parallel Bar  Agar scientific, UK G2012C
Incubator Major Science, USA MO-RC can be replaced by same item from other companies
Pioloform Powder  Agar scientific, UK R1275
Chloroform Roth, Germany 3313.1 CAUTION! ;  can be replaced by same item from other companies
Name Company Catalog Number Comments
EM analysis
Philips CM120 TEM Philips/FEI
Morada CCD camera Soft Imaging Systems, Germany
iTEM Ver. 5.2, imaging software Soft Imaging Systems, Germany

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References

  1. Fujimoto, K. SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application. Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).
  2. Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).
  3. Rash, J. E., Yasumura, T. Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis. Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).
  4. Emes, R. D., Grant, S. G. Evolution of synapse complexity and diversity. Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).
  5. Matsuzaki, M., et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).
  6. Rollenhagen, A., Lübke, J. H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function. Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).
  7. Tarusawa, E., et al. Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses. J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).
  8. Nusser, Z., et al. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).
  9. Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus. Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).
  10. Nicholson, D. A., Geinisman, Y. Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).
  11. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
  12. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
  13. Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala. Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).
  14. Duvarci, S., Pare, D. Amygdala microcircuits controlling learned fear. Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).
  15. Jüngling, K., et al. Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala. Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).
  16. Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
  17. Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).
  18. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
  19. Sigurdsson, T., et al. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
  20. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  22. Bienvenu, T. C. M., et al. Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information. J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).
  23. Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes. Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).
  24. Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction. Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).
  25. Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).
  26. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  27. Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).
  28. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).
  29. Tanaka, J., et al. Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum. J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).
  30. Mansouri, M., et al. Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex. Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).

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संयुक्त optogenetic और रुक-फ्रैक्चर प्रतिकृति immunolabeling माउस प्रमस्तिष्कखंड में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के इनपुट विशेष व्यवस्था की जांच करने के लिए
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Schönherr, S., Seewald, A., Kasugai, Y., Bosch, D., Ehrlich, I., Ferraguti, F. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (110), e53853, doi:10.3791/53853 (2016).

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