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Neuroscience

Enregistrement combiné de Mécaniquement Stimulé Afférent Sortie et Nerve Terminal Etiquetage Souris follicule pileux lancéolées Endings

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

Une technique de dissection et l'enregistrement roman est décrit pour afférences de surveillance tir évoqué par déplacement mécanique des poils dans le pavillon de la souris. La technique est très rentable et facilement réalisé avec des matériaux rencontrés dans la plupart des laboratoires d'électrophysiologie, ou facilement achetés. La dissection est simple et rapide, avec le déplacement mécanique fournie par une plaquette électrocéramique générique contrôlée par un logiciel propriétaire. Le même logiciel enregistre et analyse également la sortie de electroneurogram. L'enregistrement de l'activité nerveuse évoquée est à travers un amplificateur différentiel commercial relié à microélectrodes en verre standard poli-feu. Conseils utiles sont donnés pour améliorer la qualité de la préparation, la stimulation et les conditions d'enregistrement pour optimiser la qualité d'enregistrement. Le système est adapté pour analyser les propriétés électrophysiologiques et optiques des terminaux lancéolées de terminaisons palissadiques des follicules pileux, ainsi que lales résultats de leur manipulation pharmacologique et / ou génétique. Un exemple de combiner l'enregistrement électrique avec la stimulation mécanique et l'étiquetage avec un colorant vital styryl pyridinium est donnée.

Introduction

Les bornes lancéolées des axones sensoriels innervant follicules pileux chez les mammifères forment autour des palissades de l'épithélium des cheveux arbre. Leur but est de détecter le déplacement mécanique des poils qu'ils entourent. Ils sont un mélange rapidement et lentement, en adaptant les terminaisons qui produisent de façon prédominante de courtes rafales d'activité en réponse au mouvement des cheveux. Activité cesse très rapidement lorsque le mouvement cesse, même en présence d'un déplacement continu. Ici, nous décrivons le développement de ce modèle de pinna murin pour les études corrélatives de la structure et la fonction dans les terminaux lancéolées. Le pavillon possède de nombreuses caractéristiques avantageuses pour l'étude de ces terminaisons. Tout d'abord, le pavillon est essentiellement deux couches de la peau apposés dos-à-dos, avec peu d'autres tissus entre interférer avec l'accès aux follicules et terminaux. La peau est très fine et facilement disséquée en raison de quantités minimes de tissu conjonctif dur. L'innervation est facilement accessible et identifiable. Alors que les cheveux follicles sont présents, ils sont relativement peu distribués, ce qui facilite la stimulation de groupes individuels ou en petits follicules mécaniquement. La mince couche dermique sous-jacente donne une bonne accessibilité aux terminaisons nerveuses avec des médicaments et des colorants pharmacologiques. Cela les rend particulièrement idéal pour des études d'imagerie par microscopie à fluorescence. L'imagerie peut être soit dans les terminaux vivants, ou après la fixation et le traitement ultérieur histologique.

Les réponses des neurones mécano innervant les follicules pileux ont traditionnellement été étudiés chez les rongeurs vibrisses 1,2 et, dans une moindre mesure, dans les préparations isolées de la peau 3,4. Ceux-ci nous ont beaucoup appris sur les principes généraux de la physiologie mécanosensorielle dans les terminaisons nerveuses entourant la tige du cheveu. La préparation vibrisse permet un contrôle exquis sur le mouvement d'un seul follicule pileux. Cependant, il peut être difficile de déchiffrer la sortie en raison de sa complexité, comme vibrissefollicules contiennent au moins 8 types de fin mécanosensorielle anatomiquement distincts 5 différents et l'adaptation de ces types morphologiques aux réponses électrophysiologiques spécifiques est encore un sujet de litige. La peau de la souris / saphène préparation de nerf est le plus souvent utilisé dans son état épilée pour enquêter sur les réponses tactiles et de la douleur. L'innervation des follicules pileux dans une telle préparation est moins complexe , mais la densité des follicules pileux, plus la présence de trois types de follicules différents (de garde, Poinçon / auchene et poils en zigzag) dans une telle proximité 6, signifie étudier les réponses spécifiques de un seul follicule ou d'un type unique de fin est à nouveau difficile. En outre, cette préparation implique une dissection complexe. Enfin, dans les deux vibrisse et d' autres préparations pour la peau, il est difficile de visualiser les terminaisons impliqués tandis que l'ex vivo des préparations sont encore en vie. Ainsi, le sectionnement des tissus est nécessaire même dans des lignées de souris exprimant la GFP. alternatiVely, il nécessite un traitement ultérieur histologique / immunologique telles que la fixation et / ou de l'anticorps d'incubation immunofluorescence.

Nous avons donc mis au point la préparation de penne et l'a utilisé pour faire des enregistrements électriques à partir d'une population restreinte de cheveux afférences du follicule et de montrer que le cyclisme de la membrane se produit dans ces terminaisons lancéolées, comme en témoigne l'absorption de colorants styryl pyridinium. Enfin, nous avons montré que le colorant ne pas interférer avec la sensibilité mécanique, ce qui indique qu'il ne bloque pas les canaux de mécanotransduction. Les résultats des protocoles de stimulation et d'analyse simples sont illustrés.

Protocol

récolte des tissus post-mortem de la souris doit utiliser des méthodes approuvées éthiques. Au Royaume-Uni, la dislocation cervicale est une méthode approuvée par le gouvernement pour les souris adultes (a énuméré l'annexe 1 méthode dans le Royaume-Uni Animaux (Procédures scientifiques) Loi de 1986 et de la directive européenne 2010/63 / UE). Cette loi est appliquée localement à l'Université d'Aberdeen par le bien-être animal et éthique Commission de révision qui a examiné et approuvé toutes les procédures utilisées dans le protocole suivant.

Remarque: Ces méthodes ont été utilisées dans la recherche présentée dans Banks et al 7.

1. Oreilles Préparation pour électrophysiologie

  1. Avant la dissection, préparer une solution saline physiologique standard, tel que Liley (1956) et la saturer avec 90% O 2/5% CO 2. Une solution saline de liley (mM) comprend: NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), du NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) et du glucose(11).
  2. Humainement euthanasier une souris adulte sans endommager le crâne près des oreilles. Ici, nous utilisons des souris C57 / BL6J et MF1 mais toute souche de laboratoire standard de la souris peut être utilisée. Idéalement, utiliser des souris qui sont <25 g si l'enregistrement électrique doit être associé à un étiquetage styryle de colorant, comme l'étiquetage chez des souris plus grandes est moins fiable, étant souvent trouvé seulement dans les zones circonscrites restreintes.
  3. Retirez la tête avec de grands ciseaux ou cisailles à os.
  4. Placez le côté dorsal de la tête dans gazés Liley est dans un plat de dissection à fond large (50 cm est généralement pratique) sur la scène d'une dissection au microscope stéréo. Régulièrement (~ 10 min) écluse ou plonger la tête avec une solution saline gazés.
  5. inciser soigneusement et séparer la peau à la base de l'oreille externe (pinna) avec des ciseaux springbow et # 3 forceps, ce qui expose le cartilage du conduit auditif externe (MAE). Identifier les branches du trijumeau (division mandibulaire, MDV) et de grands nerfs auriculaires tels qu'ils ressortent from le crâne dans la fente du projet commun et de la mandibule à travers la base de cartilage innervent la partie concave (antérieure) et convexe (postérieure) aspects de la peau Pinna, respectivement.
  6. Près du crâne, d'identifier où les branches de sortie de deux nerfs dans la gorge entre la mâchoire et le processus mastoïde. Maximiser leur longueur en tirant doucement le pavillon loin du crâne et couper les nerfs au plus près du crâne que possible.
  7. Retirez le pavillon de la tête avec des ciseaux de springbow, en prenant soin d'éviter les souches distales des nerfs divisés et en minimisant la quantité de pelage dense à la base de l'oreille qui est enlevée.
  8. Transférez le pavillon à un caoutchouc de silicone flexible (PDMS) plat -Doublés rempli de liquide de gazé Liley. Ouvrez le EAM en le divisant le plus étroit le point (la plus antérieure). Aplatir la penne, la peau antérieure (concave) côté vers le bas et la broche au PDMS soigneusement les bords avec ~ 6-8 régulièrement espacées très fines (~ 0,2 mm de diamètre) broches d'insectes.
  9. Remove la peau de la face postérieure du pavillon complètement et retirer partiellement le cartilage pinna par dissection avec # 3 forceps, assurant la peau antérieure est laissée intacte.
  10. Avec la pointe d'une épingle d'insectes bien compris par # 3 pinces, étendre doucement les branches (généralement 2) du MDV qui émergent en arrière entre la peau et les cartilages EAM. Pin ceux-ci aux PDMS avec les plus belles broches d'insectes possibles, empalant le tissu conjonctif attenant à leurs extrémités coupées et non les troncs nerveux eux-mêmes.
  11. Retirer la plupart du tissu conjonctif environnant autour d'eux, en évitant soigneusement les dommages causés par l'excès de traction ou de coupe.

2. électrophysiologique Recording Set Up

  1. Epingler la peau penne à la PDMS-alignés la base d'une chambre d'enregistrement avec des épingles insectes fines autour des bords (~ 6-8 par oreille), en plaçant les nerfs nettoyés à la base de l'oreille près de deux électrodes d'aspiration - un pour l'enregistrement (à prendre le nerf) et le otelle une électrode indifférente (pour fournir le signal neutre à un amplificateur différentiel, voir 7).
  2. Pour l'électrode d'enregistrement, correspondre soigneusement l'ouverture et le diamètre interne de l'ouverture à l'épaisseur combinée des deux nerfs, de sorte qu'ils correspondent aussi parfaitement que possible et aussi grande longueur possible.
  3. Tirer les nerfs dans l'électrode par aspiration douce à partir d'une seringue de 2 ml fixée à l'autre extrémité avec un tube en caoutchouc de silicone. Vérifiez que les nerfs sont droites, pas plié ou doublé.
  4. Développer une résistance / impédance ajustement électrique élevée à l'aide d'aspiration plus forte pour aspirer le tissu conjonctif ou un tissu adipeux pour former un bouchon qui scelle hermétiquement l'ouverture autour du nerf.
  5. Remplir l'autre (indifférent) électrode avec une solution saline, par aspiration, si nécessaire (il peut se remplir par capillarité).
  6. Placez les fils d'enregistrement identiques (argent ou platine) dans l'alésage interne des électrodes d'enregistrement à communiquer avec le sérum physiologique et le nerf(Enregistrement) ou rétrécies, fin poli-feu (indifférent) de l'électrode. Chaque électrode est soudé individuellement à différents noyaux de deux-core du câble blindé. Placer l'électrode (Ag / AgCl pastille) bain (masse) dans le bain et on le broie à l'écran du câble à deux âmes reliées aux électrodes d'enregistrement.
  7. Nourrir l'activité électrique des deux électrodes dans les canaux séparés d'un amplificateur différentiel, filtre (bande passé 0,2-2 kHz), et vue sur un écran d'oscilloscope. Vérifier que le canal A (enregistrement) et le canal B (indifférent) les niveaux de bruit électriques ressemblent. A ce stade, il peut ne pas être possible de voir les potentiels d'action spontanés normaux dans le canal A avant que les deux électrodes sont équilibrées.
  8. Redresser les différences dans le bruit de fond entre les électrodes en augmentant l'impédance de l'enregistrement (canal A) ou indifférents (canal B) électrodes. Pour ce faire, en suçant aréolaire (adipeux) du tissu conjonctif plus loin dans une ou l'autre électrode, et /ou en appliquant une plus grande force d'aspiration sur la seringue de 50 ml.
    1. Une fois «équilibrée» de cette façon, revenir au différentiel (AB) d'enregistrement et de rechercher des potentiels spontanés d'action (PA) dans la trace ou quand caressant les poils à la marge du pavillon. Si aucune activité (dopage) est vu, re-vérifier l'ajustement serré du nerf dans l'électrode d'enregistrement et le tissu conjonctif aréolaire dans l'électrode indifférente - habituellement le plus serré (résistance plus élevée) le sceau et plus égale l'impédance dans les deux électrodes, le meilleur. Avec la pratique, cela permet d'obtenir une bonne qualité (> 2: 1) le signal: bruit.
  9. Notez le electroneurogram via un logiciel d'interface de laboratoire et l'électrophysiologie en cours d'exécution sur un ordinateur. Une sortie audio du dopage est très utile et peut être obtenu en alimentant le neurogramme à travers un amplificateur audio et de haut-parleur audio associé. Régler le seuil pour être juste au-dessus du bruit de fond (identifié par l'absence de blanc-noise 'sifflera').
  10. Pour augmenter la drogue ou de l' accès fluorescent styryle de colorant pour les terminaisons lancéolées, soigneusement décoller la couche sous-cutanée adipeux près de la marge de penne, ouverture d' une fenêtre de ~ 5 mm x 5 mm d' exposer le derme et la base des follicules (figure 1A, B ).
  11. Pin arrière un pli de ~ 1 mm de la peau de l'oreille adipeux défrichée à la marge avant (au niveau de la fenêtre vient de produire, le cas échéant), en laissant un espace rempli de solution saline claire entre les couches apposées de la peau. Doucement caresser les poils dépassant le long du bord plié avec une épingle ou une pince fine à la terre, sans toucher la peau, de localiser la zone de sortie maximale AP sur l'oscilloscope et le caractère distinctif «clics» et «pops» dans la sortie audio.

3. Potentiels d'action d'enregistrement de stimulation évoquées

  1. Positionner la sonde de stimulation mécanique - 10 cm en verre borosilicate de microélectrodes poli-le-feu fixé à un ceramic actuateur piézo-électrique - si le mouvement est parallèle avec le pli de la peau. Placez la pointe d'environ 0,5-1 mm de pli cutané, de sorte qu'il touche les cheveux, mais pas la peau. Vérifiez la stimulation efficace en déplaçant lentement la pointe de la sonde manuellement pour dévier les poils et observer / écouter le dopage.
  2. Utilisez le logiciel pour conduire la stimulation mécanique de 1-3 poils (par exemple 3 secondes à 5 sinusoïdes Hz, toutes les 10 sec. Sonde déplacement 200-500 um), et d' enregistrer les réponses de stimulation évoqués dans les nerfs.
  3. Donnez plusieurs trains mécaniques identiques de stimulation à intervalles de 10 sec. Optimiser la position de la sonde pour la répétabilité, puis réduire la fréquence de stimulation selon le protocole expérimental (par exemple , des taux de répétition de chute de 10 secondes à 30 secondes).
  4. Utilisez le logiciel pour discriminer l' activité AP-comme par exemple à l' aide d' un simple seuil fixé à ~ 2x à haute fréquence amplitude du bruit et ~ 25% des plus grands points d' accès.
  5. Comptez les points d'accès traversant le seuil«événements», de quantifier la fréquence et les caractéristiques des produits APs.

4. Firing Enregistrement de stimulation évoquée Combiné avec la N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromide Étiquetage

  1. Pour examiner les effets des colorants styryle sur stimulus évoqué afférences tir et l'étiquetage terminal, ajouter la concentration appropriée d'un colorant styryle de choix, à la solution de bain et continuer avec l'enregistrement électrique.
  2. Après le temps d'exposition requis (habituellement au moins 30 min), préparer la préparation à la visualisation des follicules. Dépliez le rabat de la peau en enlevant les goupilles de retenue, et exposer la zone cutanée autorisé à révéler l'étiquetage terminal.
  3. Laver le colorant externe avec une solution saline sans colorant, faire 3 changements complets de solution saline.
  4. Incuber dans le dernier changement de gazés solution saline sans colorant pendant 10-15 min pour permettre la contamination de colorant le plus persistant de lessivage de membranes exposées / externes.
  5. Éliminer le colorant non internalisés restant sur membranes avec un agent séquestrant (sulfobutylated bêta-cyclodextrine, 1 mM, 5 min) dans une solution saline.
  6. Transférer la chambre d'enregistrement à la scène d'un microscope à épifluorescence verticale et engager la chambre avec le mécanisme de déplacement étape / slide.
  7. Illuminez la préparation avec de la lumière d'excitation appropriée pour le colorant styryle. Utilisez un objectif de microscope 10X ou 25X fluorescence pour observer l'étiquetage du follicule (Figure 1).

Representative Results

Le dispositif d'enregistrement électrophysiologique du tissu adipeux sous-cutané enlevée pour exposer des follicules pileux, est représentée sur la figure 1A. Une partie de cette zone exposée est représentée à un grossissement plus élevé dans l' illumination de fond clair dans la figure 1B. Pliage de la marge penne vers le haut et sur lui-même dans cette zone expose la surface de l'épiderme. Ceci positionne les poils sur le bord du pli à saillir horizontalement, dans une situation idéale pour la stimulation mécanique , d'une sonde émoussée (non représenté). La figure 1C montre que , après l' exposition du colorant et en retournant la marge à la position déployée à nouveau, les follicules stimulés à ce poste ont été marquées avec un colorant styryle pyridinium. Electroneurograms de préparations présentent généralement une activité continue AP même en l'absence de mouvement imposées de la sonde en fibre de verre, y compris les points d' accès de la plus grande taille (figure 2A (Figure 2Bi-iii)). Ceci est très reproductible, même si la phase de la forme d' onde à laquelle les réponses sont verrouillées dépend de leur position, à savoir à quel moment le mouvement de la sonde de vibration en contact avec la cheveux. Une détection de seuil simple , (ligne horizontale traversant les traces de neurogramme dans A (i-iii)) a été utilisé pour cette analyse. Cependant, la fonctionnalité d'un logiciel d'enregistrement peut souvent être utilisé d'une manière plus sophistiquéediscriminer les caractéristiques de la taille de la pointe et la forme. Cela peut ensuite isoler les réponses de particulier des fibres afférences par ces caractéristiques pour permettre une analyse d'enregistrement pseudo-unité simple à entreprendre.

Figure 1
Figure 1:. Électrophysiologique arrangement d'enregistrement et de N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromide Étiquetage des follicule pileux terminaisons Afférent lancéolées (A) Un pavillon préparation mis en place pour une expérience électrophysiologique montrant le pavillon l'orientation, la localisation des nerfs, les électrodes d'enregistrement et la zone exposée du follicule innervation après le retrait du tissu adipeux. (B) Plusieurs follicules pileux sont visibles en plein éclairage de terrain dans la zone débarrassée des tissus adipeux recouvrant vers le bas pour le derme. L'obscurité, habituellement bilobée, les formes sont des glandes sébacées. ( 7, avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: (A) Activité de stimulation évoquée enregistrée de la Pinna Mouse. (Ai-iii) Exemples, prises à partir de 3 expériences différentes, de l' activité de neurograms continue de pennes dans une solution saline de la norme Liley. Chaque enregistrement représente une coupe de 5 secondes environ 5 minutes après le début de l'enregistrement, y compris une période de 3 sec de déplacement sinusoïdal commenuméro de centre d'arbres de cheveux. La stimulation mécanique a été répétée toutes les 30 secondes tout au long de l'enregistrement continu, qui durait habituellement pendant 1-2 heures. fichiers de script personnalisés marqués événements individuels qui ont franchi un seuil fixé par le curseur horizontal (pointes), ainsi que le début de chaque cycle sinusoïdal (période). (Aiv) Le signal de commande pour le déplacement sinusoïdal. (B) Analyse de stimulation-Smasher évoqué l' activité. (Bi-iii) histogrammes de cycle à 3 ° bacs construits à partir des échantillons de neurogramme (Ai-iii) respectivement, montrant les réponses des présumés terminaisons lancéolées à la stimulation mécanique de 5 Hz déplacement sinusoïdal des arbres de cheveux par une sonde de verre. Notez le verrouillage de phase marquée, à différentes phases du cycle, en fonction de leur position par rapport à la position de départ de la sonde mécanique. (Biv) sonde Normalized déplacement sinusoïde; l'amplitude réelle était d'environ 1001;. M S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous avons mis au point une préparation relativement simple qui peut être disséqué rapidement, a une faible densité des follicules pileux et permet une stimulation mécanique relativement sélective d'un petit nombre de follicules pileux. Il est facilement accessible pour l' enregistrement électrophysiologique et des cellules vivantes imagerie de fluorescence, y compris les réponses à teindre l' application pour visualiser les follicules pileux stimulées mécaniquement, à savoir les follicules d'imagerie avec des réponses électrophysiologiques définies. Bien que nous ayons pas fait, ce système semble aussi facilement prête à sous-division du nerf sensitif pour une seule unité (axone sensorielle unique) l'enregistrement et l'utilisation de la GFP-expression ciblée pour la visualisation sensorielle terminale se terminant la morphologie.

Nous avons utilisé la préparation de la peau de l' oreille pour étudier les caractéristiques de l'intériorisation et la libération de la fluorescence styryle membrane pridinium colorants 7, une technique développée à l' origine pour étudier Vesic localiséele recyclage dans la membrane 8 terminaisons synaptiques. En synapses, l' imagerie est également facilement combiné avec enregistrement électrophysiologique simultanée des réponses dans les terminaux identifiés 8,9. Ce fut dans ces premières études que nous avons d' abord noté les colorants ont également été internalisés par les terminaisons mécanosensoriels 10. Pour les neurones sensoriels dans la culture et dans les cellules ciliées de la cochlée, une grande partie de l'étiquetage par des colorants styryle pyridinium semble impliquer des colorants qui passent à travers les canaux mécanosensoriels, qu'ils ont ensuite bloquent 11,12. Les colorants étiquettent ensuite les membranes intracellulaires, et cet étiquetage est irréversible. Cependant, dans les cellules ciliées qui ne sont pas mécaniquement stimulée 13,14 et primaires terminaux complètement différenciées sensorielles nerveuses in situ, comme les terminaisons Ia dans les fuseaux neuromusculaires 15 et dans les terminaisons lancéolées ici 7, l' étiquetage styryle de colorant semble refléter l' endocytose de la membrane, puisque l'étiquetage est réversible et ne bloque pas les res mécanosensorielsponses 7,15,16. Alors que certains intériorisation de colorant par canal perméation dans ces terminaisons ne peut pas être totalement écartée, il est clair à partir de la mise à feu continu pendant colorant incubation et la réversibilité de l'étiquetage que la grande majorité de l'étiquetage dans les terminaux différenciés in situ est par intériorisation avec recyclage vésiculaire membrane. Ainsi, cette technique simple est facilement utilisé pour la surveillance électrique et optique combinés d'une gamme de fonctions terminales mécanosensoriels ex vivo dans les tissus.

Comme avec la plupart des techniques pratiques, la reproductibilité nécessitera la répétition et la pratique. Certains des points clés mérite une attention particulière sera maintenant décrite. Tout au long de la session de dissection et d' enregistrement, de maximiser la viabilité des tissus et de la survie en assurant en permanence la préparation est perfusée avec une solution saline totalement saturé avec 95% O 2/5% CO 2. Assurez-vous les cheveux follicules ne sont pas déplacées pendant ce processus, which stimuleront sensorielle fin tir. Soit utiliser, un système continu d'écoulement laminaire de perfusion, ou bien le gaz de bulles dans le bain d'organe avec des tubes bien à distance de la préparation, ou rafraîchissez soigneusement solutions toutes les 20-30 minutes, en gardant la préparation sous la surface de la solution saline à tout moment. électrodes d'enregistrement d'aspiration sont réalisées en modifiant tranchants pipettes électrode de borosilicate normalement utilisées pour l'enregistrement intracellulaire. Tout d'abord, soigneusement rompre les bouts pointus avec # 3 pinces pour donner le diamètre interne approprié pour tenir les nerfs et le feu-polonais par une très brève (<1 sec) exposition à la flamme du brûleur Bunsen (voir 2.4 et 2.5). Pour obtenir un bon rapport signal-bruit lors de l'enregistrement, il est essentiel que l'impédance électrique (résistance) dans ces deux électrodes est à la fois optimisée et égale. Pour ce faire, en faisant attention à ce qui suit dans les deux électrodes. Pour l'électrode d'enregistrement, vérifiez que le diamètre interne est un ajustement serré pour le nerf, et la longueur maximale de nerve est aspiré dans l'électrode d'enregistrement. Essayez d'utiliser le tissu conjonctif entourant le nerf pour sceller efficacement la pointe de l'électrode. En variante, ou en outre, attirer l'extrémité étroite, une pièce conique de taille appropriée du tissu adipeux dans le long du nerf. Ensuite, branchez la pointe d'électrode en appliquant une forte aspiration pour ~ 1 min avec une seringue de 50 ml fixée à la tubulure. Pour une pointe bien étanche, en appliquant une forte aspiration simplement renforcer l'efficacité de la prise et ne sera pas attirer plus de liquide ou d'un nerf. Pour éviter des lésions nerveuses, cependant, veiller à ce que le tissu conjonctif amortit le nerf de la compression sur le matériau environnant et EAM cartilage. L'électrode indifférente devrait mimer la résistance / d'impédance de l'électrode d'enregistrement le plus près possible. Ceci est facilité par précaution la pointe comme petite une ouverture possible sans réellement sceller polissage-le-feu. Si plus de résistance est nécessaire, puis branchez l'extrémité de l'électrode indifférente avec adiposoi tissu conjonctif, tel que décrit ci-dessus pour l'électrode d'enregistrement.

Le électrocéramique donne un contrôle exquis sur déplacement mécanique, à la fois spatialement et temporellement. Cependant, prendre soin des connexions électriques - températures élevées détruisent, il ne faut pas utiliser la soudure à chaud. Utilisez la colle époxy chargée de métal, ou utilisez une prise emmanchement spécialiste recommandé par le fournisseur. Ce sera à la fois tenir fermement et établir la connectivité électrique. Attacher la sonde de stimulation de verre à l'électrocéramique avec une résine époxy standard. Fire-polish la fin d'une norme de 10 cm x 1,5 mm de diamètre borosilicate tube capillaire de verre utilisé pour la fabrication de patch ou électrodes pointues pour l'enregistrement électrophysiologique pour réduire au minimum le risque de dommages aux tissus. Si la stimulation du follicule pileux unique est nécessaire, le feu-polish la pointe pour adapter un seul cheveu, et positionner la sonde avec un seul cheveu à l'intérieur de l'ouverture ouverte. Cela donne un contrôle exquis sur un seul cheveu. Pour styryle dye étiquetage, il est généralement plus uniforme dans les tissus des animaux plus jeunes. Il est pas très bien pourquoi, mais cela reflète probablement moins un traumatisme mécanique et l'élimination des tissus profonds plus efficace des tissus plus jeunes. Être complet en enlevant la couche mousseuse ressemblant à du polystyrène expansé recouvrant la base des follicules pileux. Toutefois, éviter d'être trop vigoureuse, car cela risque d'élimination de la couche nerf du plexus et des terminaux lancéolées associés. S'il y a peu ou pas de réponse électrique pour un mouvement de follicules pileux, et l'application styryle de colorant conduit à l'étiquetage prédominante des glandes sébacées (jaune / blanc), avec une autofluorescence distincte de la base de la tige du cheveu plutôt que de fins lancéolées (jaune orange /), jeu trop enthousiaste a endommagé les tissus sous-jacents. Enfin, l'utilisation d'un agent chélateur formateur de colorant avant l'imagerie améliore considérablement le contraste d'image et de la qualité des images finales.

Cette technique pourrait être utile dans une gamme d'autres études. Ces coULD comprennent, par exemple, le criblage de la chaîne mécanosensorielle (s) responsable des réponses évoquées par étirage, par incubation de la préparation avec des ligands sélectifs pour les canaux pharmacologiques candidats ou le criblage des lignées de souris génétiquement avec ces canaux supprimés. Ce dernier pourrait être combiné avec l' évaluation de la fluorescence de tout changement dans la morphologie terminale due à la manipulation génétique des lignées de souris, par exemple avec l' expression de la GFP Npy2r liée 17. Un dernier exemple peut être étudier le rôle des vésicules synaptiques-like (SLV) 7 dans ces terminaux lancéolées en examinant l'effet de modulateurs de chiffre d'affaires SLV (Ca, Mg, latrotoxine, des ligands de récepteurs de glutamate) sur les réponses d'étirement évoqués et l' absorption styryle de colorant /Libération. Ainsi, cette nouvelle technique ouvre un éventail de pistes potentiellement intéressantes de la recherche en neurosciences mechansensory.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14, (4), 300-309 (2009).
  2. Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
  3. Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407, (6807), 1007-1011 (2000).
  4. Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516, (7529), 121-125 (2014).
  5. Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449, (2), 103-119 (2002).
  6. Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
  7. Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591, (10), 2523-2540 (2013).
  8. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, (5041), 200-203 (1992).
  9. Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
  11. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  12. Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (1), 1 (2007).
  13. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  14. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20, (1), 41-50 (2004).
  15. Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562, (2), 381-394 (2005).
  16. Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21, (PC22), (2010).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, (7), 1615-1627 (2011).
Enregistrement combiné de Mécaniquement Stimulé Afférent Sortie et Nerve Terminal Etiquetage Souris follicule pileux lancéolées Endings
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Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

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