Kombinert Opptak av mekanisk stimulert afferent Output og Nerve Terminal Merking i Muse hårsekken lansettformede Endings

Abstract

En ny disseksjon og registreringsteknikk er beskrevet for å overvåke afferent avfyring fremkalt av mekanisk forskyvning av hår i mus øremuslingen. Teknikken er svært kostnadseffektivt og enkelt foretas med materialer som vanligvis finnes i de fleste elektrofysiologiske laboratorier, eller lett kjøpt. Disseksjon er enkel og rask, med mekanisk forskyvning levert av en generisk elektrokeramiske wafer kontrollert av proprietær programvare. Den samme programvaren også poster og analyserer electroneurogram utgang. Registreringen av fremkalt nerveaktivitet er gjennom en kommersiell differensialforsterker som er koblet til brann polert standard glassmikroelektroder. Nyttige tips er gitt for å forbedre kvaliteten på forberedelse, stimulering og opptaksforholdene for å optimalisere opptakskvalitet. Systemet er egnet for analysering av elektrofysiologiske og optiske egenskapene til lansettformete terminaler fra Palisade avslutninger av hårsekkene, samtResultatene fra deres farmakologiske og / eller genetisk manipulasjon. Et eksempel på kombinasjon av elektriske opptak med mekanisk stimulering og merking med en styryl pyridinium vital fargestoff blir gitt.

Introduction

De lansettformede terminalene på sensoriske aksoner innervating hårsekkene hos pattedyr danner palisader rundt håret-aksling epitel. Deres formål er å oppdage mekanisk forskyvning av hårene de omgir. De er en blanding av hurtig og sakte tilpasse avslutninger som hovedsakelig produserer små pakker med aktivitetsnivået til håret bevegelse. Aktiviteten opphører meget raskt når bevegelsen stanser, selv i nærvær av fortsatt forskyvning. Her beskriver vi utviklingen av denne murine pinna modell for samsvarende studier av struktur og funksjon i lansettformete terminaler. Øremuslingen har mange fordelaktige egenskaper for å studere disse avslutninger. Først er det ytre øret hovedsak to lag av huden apposed back-to-back, med lite annet vev mellom å forstyrre tilgangen til follikler og terminaler. Huden er meget tynn og lett dissekert på grunn av minimale mengder av seigt bindevev. Den innervasjon er lett tilgjengelig og identifiserbare. Mens håret follicles er til stede, de er forholdsvis tynt fordelt, legge til rette for stimulering av enkeltpersoner eller små grupper av follikler mekanisk. Den tynne underliggende dermal lag gir god tilgjengelighet til nerveterminalene med farmakologiske stoffer og fargestoffer. Dette gjør dem spesielt ideelt for bildediagnostikk ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Bildebehandling kan enten være i levende terminaler, eller etter fiksering og videre histologisk behandling.

Responsene til mechanosensory neuroner innervating hårsekkene har tradisjonelt blitt studert i gnager vibrissae ^1,2 og, i mindre grad, i isolerte hudpreparater ^3,4. Disse har lært oss mye om de generelle prinsippene for mechanosensory fysiologi i nerveterminalene rundt håret. Den vibrissal forberedelse gjør utsøkt kontroll over bevegelse av en enkelt hårsekken. Imidlertid kan det være vanskelig å tyde utgang på grunn av sin kompleksitet, som vibrissalfollicles inneholde minst 8 forskjellige typer anatomisk tydelig mechanosensory avslutning ^fem og matching av disse morfologiske typer til spesifikke elektrofysiologiske responser er fortsatt omstridt. Musen hud / saphenous nerve forberedelse er oftest brukt i sin hårfrie staten til å undersøke berørings og smerte svar. Den innervasjon av hårsekkene i et slikt preparat er mindre kompleks, men tettheten av hårsekkene, pluss tilstedeværelsen av tre ulike hårsekken typer (vakt, Syl / auchene og sikksakk hår) i slik nærhet ^6, betyr å studere de spesifikke svarene av en enkelt hårsekken eller én type ending blir igjen utfordrende. Videre innebærer dette preparat et kompleks disseksjon. Til slutt, i både vibrissal og andre hudpreparater, er det vanskelig å visualisere de avslutninger som er involvert, mens den ex vivo preparater er fortsatt i live. Således er vevet snitte nødvendig selv i GFP-uttrykkende mus linjer. Alternatisvis, det krever ytterligere histologisk / immunologisk behandling, for eksempel fiksering og / eller antistoff inkubering i immunfluorescens.

Vi har derfor utviklet øremuslingen forberedelse og brukte den til å lage elektriske opptak fra en begrenset populasjon av hårsekken afferente og vise at membran sykling skjer i disse lansettformede avslutninger, dokumentert av opptak av styryl pyridinium fargestoffer. Til slutt viste vi at fargen ikke forstyrrer mekanisk følsomhet, noe som indikerer at det ikke blokkerer mechanotransduction kanaler. Resultatene av enkle stimulering og analyseprotokoller er illustrert.

Protocol

Mus post mortem vev høst skal det brukes godkjent etiske metoder. I Storbritannia er halshugging en regjering godkjent metode for voksen mus (en fredet Schedule en metode i Storbritannia Animals (Scientific Procedures) Act, 1986 og EU-direktiv 2010/63 / EU). Denne lovgivningen håndheves lokalt ved Universitetet i Aberdeen ved dyrevelferd og etisk Review Board som gjennomgått og godkjent alle prosedyrer som brukes i følgende protokoll.

Merk: Disse metodene ble brukt i forskning rapportert i Banks et al ^7.

1. Klar Ears for Elektro

1. Før disseksjon, tilberede en standard fysiologisk saltvann, for eksempel Liley s (1956) og mette den med 90% _O2 / 5% _CO2. Liley s saltvann (mM) består av: _NaHCO3 (12), KCl (4), KH _{2PO 4} (1), NaCl (138,8), _MgCl2 (1), _CaCl2 (2) og glukose(11).
2. Humant avlive en voksen mus uten å skade hodeskallen nær ørene. Her benyttes C57 / Bl6J og MF1 mus, men en hvilken som helst standard laboratorie-mus-stamme kan anvendes. Ideelt sett bruker mus som er <25 g hvis elektriske opptak skal kombineres med styryl fargestoff merking, som merking i større mus er mindre pålitelige, ofte blir funnet bare i begrenset avgrensede områder.
3. Fjern hodet med store saks eller bein sakser.
4. Plasser hodet ryggsiden opp i gasset Liley er i en bred bunn disseksjon tallerken (50 cm er vanligvis praktisk) på scenen av en stereo disseksjon mikroskop. Regelmessig (~ 10 min) sluse eller senk hodet med gasset saltvann.
5. Nøye innsnittet og skille huden på undersiden av det ytre øret (pinna) med springbow saks og # 3 tang, utsette brusken i den ytre øregang (CRM). Identifiser grener av trigeminal (kjeve divisjon, MDV) og flotte auricular nerver som de dukker opp from skallen i kløften i kjeveledd og prosjekt gjennom brusken base for å innerverer konkav (anterior) og konveks (posterior) aspekter av pinna hud, henholdsvis.
6. Nær skallen, identifisere hvor de to nerve grener exit i sporet mellom kjeven og mastoid prosessen. Maksimere sin lengde ved å dra det ytre øret bort fra hodeskallen og kutte nervene så nær skallen som mulig.
7. Fjern pinna fra hodet med springbow saks, ta vare å unngå de fjerne stubber av de delte nerver og minimere mengden tette pelsen på undersiden av øret som blir fjernet.
8. Overfør øremuslingen til en fleksibel silikongummi (PDMS) -lined tallerken fylt med gasset Liley væske. Åpne EAM ved å dele den på sitt smaleste (anterior-mest) punkt. Flat øremuslingen, anterior huden (konkav) siden ned og pin til PDMS nøye på kantene med ~ 6-8 jevnt fordelte veldig fine (~ 0,2 mm diameter) insekt nålene.
9. Remove huden av den bakre del av det ytre øret helt og delvis fjerne det ytre øret brusk ved stump disseksjon med # 3 tang, slik at det fremre huden er intakt.
10. Med poenget med en fin insekt pin grep med # 3 tang, forsiktig utvide grenene (vanligvis 2) av MDV som dukker opp baktil mellom huden og EAM brusk. Fest disse til PDMS med de fineste mulige insekt pins, impaling bindevev tilstøtende sine kuttet endene og ikke nervebadebukser selv.
11. Fjerne det meste av det omgivende bindevev rundt dem, nøye unngå skade fra overflødig å trekke eller skjæring.

2. Elektro Recording sette opp

1. Pin øremuslingen huden til PDMS-foret bunnen av et registreringskammer med fine insekt nålene i området rundt kantene (~ 6-8 per øre), plassere de rengjorte nervene ved bunnen av øret nær to suge elektroder - en til opptak (i ta nerve) og othennes en nøytral elektrode (for å gi den nøytrale signal til en differensialforsterker, se ^7).
2. For opptaket elektrode, nøye samsvarer med åpningen og indre diameter av åpningen til den samlede tykkelse av de to nerver, slik at de passer så tett som mulig og så stor lengde som mulig.
3. Tegn nervene i elektroden ved forsiktig suging fra en 2 ml sprøyte festet til den andre enden med silikongummirør. Sørg for at nervene er rett, ikke brettes eller doblet opp.
4. Utvikle en høy elektrisk motstand / impedans i form ved hjelp av sterkere sug for å trekke bindevev eller en fettvev for å danne en plugg som tett tetter åpningen rundt nerve.
5. Fylle den andre (likegyldig) elektrode med saltvann ved suge om nødvendig (det kan fylles ved kapillarvirkning).
6. Plasser identiske opptaks ledninger (sølv eller platina) inn i den indre boring i opptaks elektrodene til kontakt med saltvann og nerve(Opptak) eller smalere, brann-polert slutten (likegyldig) av elektroden. Hver elektrode er loddet individuelt til forskjellige kjerner av to-kjerne skjermet kabel. Plasser badekaret (jord) elektrode (Ag / AgCl pellet) i badekaret, og knuste den til skjermen på to kjerne kabelen koblet til opptaks elektrodene.
7. Mate den elektriske aktiviteten fra de to elektroder inn i separate kanaler med en differensialforsterker, filter (band-bestått 0,2-2 kHz), og visning på et oscilloskop skjermen. Kontroller at kanalen A (opptak) og kanal B (likegyldig) elektriske støynivåer ligne. På dette stadiet kan det ikke være mulig å se de normale spontane aksjonspotensialer i kanal A før de to elektrodene er balansert.
8. Avhjelpe eventuelle forskjeller i bakgrunnsstøy mellom elektrodene ved å øke impedansen for opptak (kanal A) eller likegyldig (kanal B) elektroder. Gjør dette ved å suge areolar (adipose) bindevev videre inn i enten elektrode, og /eller bruke større sugekraft på 50 ml sprøyte.
   1. Når "balanserte" på denne måten, bytte tilbake til differensial opptak (AB) og se etter spontane aksjonspotensialer (APS) i spor eller når stryke hårene på grensen til det ytre øret. Hvis ingen aktivitet (spiking) er sett, re-sjekk tett tilpasning av nerve i innspillingen elektroden og areolar bindevev i likegyldig elektrode - vanligvis strammere (høyere motstand) selen og mer lik impedansen i to elektroder, jo bedre. I praksis vil dette få en god kvalitet (> 2: 1) signal: støyforhold.
9. Noter electroneurogram via en lab-grensesnitt og elektrofysiologi programvare som kjører på en datamaskin. En lydutgang for spiking er svært nyttig og kan oppnås ved å mate neurogram gjennom en forsterker og tilhørende høyttaler. Juster terskel til å være like over grunnlinjen støy (identifisert ved fraværet av hvit-nOise 'susing').
10. For å øke narkotika eller fluorescerende styryl fargestoff tilgang til lansettformede avslutninger, nøye skrelle bort sub-dermal adipose lag nær pinna margin, åpner et vindu på ~ 5 mm x 5 mm utsette dermis og bunnen av follikler (figur 1A, B ).
11. Pin tilbake en fold av ~ 1 mm av adipose-ryddet øret huden på ledende margin (på nivå av vinduet bare produsert, hvis det er aktuelt), og etterlater en klar salt-fylt gapet mellom apposed hudlagene. Stryk hårene som stikker ut langs den brettede kanten med en nål eller jordede fin pinsett, uten å berøre huden, for å finne arealet av maksimal AP utgangen på oscilloskop og den karakteristiske "klikker" og "sprette" i lydutgangen.

3. Opptaks Stimulus-evoked aksjonspotensialer

1. Plasser mekanisk stimulering probe - en flammepolert 10 cm borosilikat microelectrode glass festet til en Ceramic piezo-elektrisk aktuator - slik at bevegelsen er parallell med huden fold. Plasser tuppen ca 0,5-1 mm fra hudfold, så den berører hårene, men ikke huden. Kontroller effektiv stimulering av sakte beveger probespissen manuelt for å avlede hårene og observere / lytte til spiking.
2. Bruk programvare for å drive mekanisk stimulering av 1-3 hår (f.eks 3 sek på 5 Hz sinuskurver, hvert 10 sek. Probe forskyvning 200-500 nm), og registrere stimulerings-fremkalt reaksjoner i nervene.
3. Gi flere identiske mekanisk stimulering tog på 10 sek mellomrom. Optimal sonden posisjon for repeterbarhet, og deretter redusere hyppigheten av stimulering i henhold til forsøksprotokoll (for eksempel slippe repetisjonshastigheten fra 10 sek til 30 sek).
4. Bruk programvare for å diskriminere AP-lignende aktivitet for eksempel ved hjelp av en enkel terskel innstilt på ~ 2 x høy-frekvensstøy amplitude og ~ 25% av de største aksesspunkter.
5. Telle APs krysser terskelen som"hendelser", som kvantifiserer hyppighet og karakteristikker av APs produsert.

4. Opptak Stimulus-fremkalt Firing Kombinert med N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) Pyridinium dibromide Merking

1. For å undersøke effekten av styryl fargestoffer på stimulus-fremkalt afferent skyting og terminal merking, tilsett passende konsentrasjon av en styryl fargestoff av valget, til bade løsning og fortsette med det elektriske opptaket.
2. Etter den nødvendige eksponeringstid (vanligvis minst 30 min), forberede forberedelse for visning follikler. Brett ut huden klaff ved å fjerne låsepinnene, og utsett ryddet dermal området for å avdekke terminalen merking.
3. Vask bort ekstern fargestoff med dye-fri saltvann, noe som gjør 3 komplette endringer av saltvann.
4. Inkuber i den endelige endring av gasset farvestoff-frie saltoppløsning i 10-15 minutter for å tillate den mest vedvarende fargestoff forurensning til å lekke fra eksponerte / utvendige membraner.
5. Fjerne ikke-internalisert fargestoff igjen på membraner med et sekvestreringsmiddel (sulfobutylated beta-cyklodekstrin, 1 mM, 5 min) i saltoppløsning.
6. Overfør opptak kammer til scenen av en oppreist epifluorescence mikroskop og engasjere seg i kammeret med scenen / lysbilde bevegelsesmekanisme.
7. Belyse forberedelse med eksitasjon lys passer for styryl fargestoff. Bruk en 10X eller 25X fluorescens mikroskop mål å observere hårsekken merking (figur 1).

Representative Results

Den elektrofysiologiske registreringsarrangement, med sub-kutan fettvev fjernes for å frilegge hårsekkene, er vist i figur 1A. En del av dette utsatte området er vist ved et høyere forstørrelse i lysfelt belysning i figur 1B. Folding øremuslingen margin opp og tilbake på seg selv i dette området eksponerer epidermal overflaten. Dette posisjonerer hår på kanten av bretten å stikke horisontalt, i en ideell situasjon for mekanisk stimulering med en stump sonde (ikke vist). Figur 1C viser at etter fargestoff eksponering og returnere margin til utfoldet posisjon igjen, stimulert follikler i denne posisjonen er merket med en styryl pyridinium fargestoff. Electroneurograms fra preparater vanligvis viser løpende AP aktivitet selv i fravær av pålagt bevegelse av glassfiber sonde, herunder aksess av den største størrelse (figur 2A (figur 2Bi-iii)). Dette er ganske repeterbare, selv om fasen av bølgeformen ved hvilke responser er låst avhenger av deres posisjon, det vil si ved hvilket punkt i bevegelsen de vibrerende sonde den kontakter håret. En enkel terskel deteksjon (horisontal linje krysset neurogram spor i A (i-iii)) har vært anvendt for denne analysen. Imidlertid kan innspilling programvarefunksjonalitet ofte bli brukt i en mer sofistikert måte tildiskriminere funksjonene pigg størrelse og form. Dette kan deretter isolere responser hos bestemte afferente fibre av disse karakteristikkene for å tillate pseudo-én-enhet opptak analyse som skal foretas.

Figur 1:. Elektro Recording Arrangement og N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) Pyridinium dibromide Merking av hårsekken afferente lansettformede avslutninger (A) En pinna forberedelse satt opp for en elektrofysiologisk eksperiment viser pinna orientering, plasseringen av nerver, opptaks elektroder og det eksponerte området av hårsekken innervation etter fettvev fjerning. (B) Flere hårsekker er synlig i lyse felt belysning i området ryddet for liggende fettvev ned til dermis. Den mørke, vanligvis bilobed, figurene er talgkjertler. ( 7, med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: (A) Stimulus-fremkalt aktivitet Registrert fra Mouse Pinna. (Ai-iii) Eksempler, hentet fra 3 forskjellige eksperimenter, aktivitet fra kontinuerlige neurograms fra pinnae i standard Liley er saltvannsoppløsning. Hver post viser en 5 sek seksjon ca 5 min etter start av opptak, inkludert en 3 sek periode av sinusformet forskyvning av sommall antall hår sjakter. Den mekaniske stimuleringen ble gjentatt hvert 30 sek gjennom den kontinuerlige opptak, noe som vanligvis varte i 1-2 timer. Custom script-filer merket enkelthendelser som krysset en terskel satt av horisontal markør (pigger), samt utbruddet av hver sinus syklus (periode). (Aiv) Kommandosignalet for sinusformet forskyvning. (B) Analyse av Stimulus-fremkalt Spiking aktivitet. (Bi-iii) Cycle histogrammer i 3 ° binger konstruert fra neurogram prøver henholdsvis (Ai-iii), viser svarene av antatte lansettformede avslutninger til mekanisk stimulering av 5 Hz sinusformet forskyvning av håret sjakter med et glass sonde. Legg merke til merket faselåsende, ved forskjellige faser av syklusen, avhengig av deres stilling i forhold til utgangsstillingen til den mekaniske sonde. (Biv) Normalisert sonde forskyvning sinusoid; selve amplitude var ca 1001; m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her har vi utviklet en relativt enkel forberedelse som raskt kan dissekert, har lav hårsekken tetthet og gir mulighet for relativt selektiv mekanisk stimulering av et lite antall hårsekker. Det er lett tilgjengelig for elektrofysiologisk opptak og live-celle fluorescerende bildebehandling, inkludert svar på fargestoff program for å visualisere mekanisk stimulert hårsekkene, dvs. bilde follikler med definerte elektrofysiologiske responser. Selv om vi ikke har gjort det, synes dette systemet også lett mottagelig for sub-dividere sensoriske nerve for enkelt enhet (single sensoriske axon) opptak og bruk av målrettet GFP-uttrykk for å visualisere sensorisk terminal slutter morfologi.

Vi har brukt øret huden forberedelse til å undersøke egenskapene til internalisering og frigjøring av fluorescerende membran styryl pridinium fargestoffer ^7, en teknikk som opprinnelig ble utviklet for å studere lokalisert vesicle membran gjenvinning i synaptiske terminaler ^8. I synapser, er bildebehandling også lett kombineres med samtidig elektrofysiologisk registrering av svar i identifiserte terminaler ^8,9. Det var i disse tidlige studiene som vi først bemerket fargestoffer ble også internalisert av mechanosensory avslutninger ^10. For sensoriske nevroner i kultur og i cochlea hårceller, mye av merkingen av styryl pyridinium fargestoffer synes å innebære fargestoffer som passerer gjennom mechanosensory kanaler, som de deretter blokkerer ^11,12. De fargene deretter merke intracellulære membraner, og denne merkingen er irreversible. Men i hårcellene som ikke er mekanisk stimulert ^13,14 og i fullt differensierte primære sensoriske nerveterminaler i situ, for eksempel Ia avslutninger i muskel spindler ^15, og i lansettformede avslutninger her ^7, styryl fargestoff merking synes å reflektere membran endocytose, siden merking er reversibel og ikke blokkere mechanosensory responses ^7,15,16. Mens noen fargestoff intern etter kanal gjennomtrengning i disse avslutninger ikke kan utelukkes helt ut, er det klart fra fort skyting under fargestoff inkubasjon og reversibel merkingen at den store majoriteten av merkingen i differensierte terminaler i situ er ved internalisering med resirkulering vesikkel membran. Dermed er denne enkle teknikk lett anvendes for kombinert elektrisk og optisk kontroll av en rekke mechanosensory terminalfunksjoner i ex vivo vev.

Som med de fleste praktiske teknikker vil kreve reproduserbarhet repetisjon og praksis. Noen av de viktigste punktene verdt særlig oppmerksomhet vil nå bli beskrevet. Gjennom hele disseksjon og opptakssesjon, maksimere vev levedyktighet og overlevelse ved å sikre at preparatet er konstant perfusert med saltvann fullstendig mettet med 95% _O2 / 5% _CO2. Sørg for at håret follicles er ikke fortrenges under denne prosessen, which vil stimulere sanse ending avfyring. Enten bruke en kontinuerlig, laminær strømning perfusjon system, eller forsiktig boble gass gjennom organbadet med fin røret i en avstand fra det preparat, eller forsiktig oppdatere løsningene hver 20-30 min, og holder den nedenstående fremstilling saltvann overflaten til enhver tid. Suge opptak elektrodene er laget ved å modifisere skarpe elektrode borsilikat pipetter som normalt anvendes for intracellulære opptaket. Først forsiktig bryte av de skarpe spisser med # 3 tang for å gi den riktige indre diameter for å passe nerver og brann-polish av meget kort (<1 sekund) eksponering for Bunsen-brenner-flammen (se 2.4 og 2.5). For å få en god signal-til-støy-forholdet ved innspilling, er det viktig at den elektriske impedans (motstand) i disse to elektroder er både mulig og mest mulig like. Gjør dette ved å betale oppmerksomhet til følgende i de to elektroder. For opptaket elektrode, sikre indre diameter er en tettsittende passform for nerve, og den maksimale lengden på nekurven under trekkes inn i opptaks elektroden. Prøv å bruke bindevevet rundt nerve å effektivt forsegle elektrodespissen. Alternativt, eller i tillegg, trekker den smale enden av en passende størrelse, avsmalnende del av fettvev i ved siden av nerve. Koble deretter elektrodespissen ved å bruke sterke suge for ~ 1 min med en 50 ml sprøyte festet til slangen. For en godt forseglet spissen, vil påføre sterk suge bare styrke effektiviteten av pluggen, og vil ikke trekke i mer væske eller nerve. For å unngå nerveskader, men at bindevevet blir demping nerve fra kompresjon på det omkringliggende materialet og EAM brusk. Den likegyldig elektroden skal etterligne den motstand / impedansen av opptakselektrode så tett som mulig. Dette blir hjulpet av nøye brann-polering spissen til så liten blenderåpning som mulig uten å faktisk tetting. Hvis ytterligere motstand er nødvendig, og koble enden av likegyldig elektrode med adipose bindevev, som beskrevet ovenfor for opptak elektroden.

Den elektrokeramiske gir utsøkt kontroll over mekanisk forskyvning, både romlig og tidsmessig. Men ta vare å lage elektriske forbindelser - høye temperaturer ødelegge dem, så ikke bruk varmt loddetinn. Bruk metall lastet epoxy lim, eller bruke en spesialist push fit socket anbefalt av leverandøren. Dette vil både holde den fast og etablere elektrisk tilkobling. Fest glass stimulerende proben til den elektrokeramiske med standard epoksyharpiks. Brann-polish enden av en standard 10 cm x 1,5 mm diameter borsilikatglass kapillarrør anvendes for fremstilling av plaster eller skarpe elektroder for elektrofysiologisk opptak for å minimalisere risikoen for vevsskade. Dersom enkel hårsekken stimulering er nødvendig, for å brann-polsk spissen passe en enkelt hår, og plassere sonden med et eneste hår på innsiden av åpen blender. Dette gir utsøkte kontroll over en enkelt hår. For styryl dye merking, er det generelt mer ensartet i vev fra unge dyr. Det er ikke helt klart hvorfor, men det skyldes sannsynligvis mindre mekanisk trauma og mer effektiv fjerning av dype vev fra de yngre vev. Være grundig i å fjerne den skummende lag likner ekspandert polystyren liggende hårsekken baser. Men unngå å være for kraftig, da dette risikerer å fjerne nerve plexus lag og tilhørende lansettformete terminaler. Hvis det er lite eller ingen elektrisk respons på hårsekken bevegelse, og styryl fargestoff anvendelse fører til overveiende merking av talgkjertler (gule / hvite), med tydelig autofluorescens av basen på håret i stedet for lansettformete avslutninger (orange / gul), over-entusiastisk klaring har skadet de underliggende vev. Til slutt, ved hjelp av et fargestoff-chelateringsmiddel før avbilding forbedrer bildekontrast og kvaliteten på det endelige bilde.

Denne teknikk kan være nyttig i en rekke av videre studier. disse could innbefatter for eksempel, screening for de mechanosensory kanalen (e) er ansvarlig for strekk-fremkalt respons, ved inkubering av preparat med farmakologiske ligander selektive for kandidatkanaler eller screening mus linjer med slike kanaler genetisk slettet. Sistnevnte kan kombineres med fluorescens vurdering av eventuelle endringer i terminal morfologi på grunn av genetisk manipulasjon i mus linjer, f.eks med Npy2r bundet GFP uttrykk ^17. Et siste eksempel kan være å undersøke hvilken rolle synaptiske lignende vesikler (Leverandører av ett språk) ⁷ i disse lansettformede terminalene ved å undersøke effekten av modulatorer av SLV omsetning (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat reseptorligander) på strekk-fremkalte responser og styryl fargestoff opptak /utgivelse. Dermed åpner denne nye teknikken opp en rekke potensielt interessante muligheter for forskning i mechansensory nevrovitenskap.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS - Sylgard 184	Dow Corning		Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps	Fine Science Tools	11231-20
Austerlitz Insect pins	Fine Science Tools	26002-10	Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier	Digitimer	Neurolog NL104A	Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift.
High/Low-pass Filter	Digitimer	Neurolog NL125	Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger	Digitimer	Neurolog NL201	Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy.
Audio Amplifier & speakers	Digitimer	Neurolog NL120S	Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope
Oscilloscope	Digitimer	PM3380A	We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer	Morgan Electroceramics, Southampton UK	PZT507	Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply	Home made		0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software	Cambridge Electronic Design (CED)	Spike2 v7	Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface	Cambridge Electronic Design (CED)	1401 micro	Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394	Qimaging		Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Image capture and analysis software.