Abstract
يوصف تشريح والتسجيل تقنية جديدة لاطلاق الرصد وارد أثار من النزوح الميكانيكية من الشعر في الصيوان الماوس. هذه التقنية هي جدا فعالة من حيث التكلفة والتي اتخذت بسهولة مع المواد التي توجد عادة في معظم المختبرات الكهربية، أو بسهولة شراؤها. تشريح بسيط وسريع، مع تشريد الميكانيكية التي تقدمها رقاقة electroceramic عام تسيطر عليها البرمجيات الاحتكارية. البرنامج نفسه أيضا سجلات ويحلل الناتج electroneurogram. تسجيل النشاط العصبي أثار البرنامج هو عبارة عن مكبر للصوت التفاضلية التجاري متصلة الميكروية الزجاج القياسية مصقول النار. يتم إعطاء نصائح مفيدة لتحسين نوعية إعداد وتحفيز وشروط تسجيل لتحسين جودة التسجيل. هذا النظام هو مناسبة لمعايرة الخصائص الكهربية والضوئية محطات سناني الشكل من النهايات سياجية من بصيلات الشعر، وكذلكالنتائج من التلاعب بهم الدوائي و / أو وراثي. تم اعطاء مثال الجمع بين تسجيل الكهربائية مع التحفيز الميكانيكي ووضع العلامات مع صبغة حيوية styryl البيريدينيوم.
Introduction
محطات سناني الشكل من المحاور الحسية التعصيب بصيلات الشعر في الثدييات تشكل الحواجز حول ظهارة الشعر رمح. الغرض منها هو الكشف عن تشريد الميكانيكية من الشعر يحيطون. فهي مزيج من بسرعة وببطء التكيف مع النهايات التي تنتج في الغالب رشقات نارية قصيرة من النشاط في الاستجابة لحركة الشعر. آخر يتوقف بسرعة كبيرة عندما تتوقف الحركة، حتى في وجود استمر النزوح. نحن هنا وصف تطوير هذا النموذج الصيوان الفئران للدراسات الملازمة للهيكل وتعمل في محطات سناني الشكل. الصيوان ديها العديد من الميزات مفيدة لدراسة هذه النهايات. أولا، الصيوان هو أساسا طبقتين من الجلد الرئيسي يعارضها-العودة إلى الوراء، مع الأنسجة الأخرى قليلا بين التدخل في الوصول إلى بصيلات والمحطات. الجلد رقيقة جدا وتشريح بسهولة نظرا لكميات ضئيلة من النسيج الضام صعبة. تعصيب يمكن الوصول إليه بسهولة والتعرف. في حين follicl الشعروفاق موجودة، فإنها توزع قليلة نسبيا، وتسهيل وتحفيز الأفراد أو الجماعات الصغيرة من بصيلات ميكانيكيا. طبقة الجلد الأساسية رقيقة يعطي الوصول جيدة للمحطات العصبية مع العقاقير الدوائية والأصباغ. هذا يجعلها مثالية بشكل خاص للدراسات التصوير باستخدام المجهر مضان. يمكن أن يكون التصوير سواء في محطات الحية أو بعد تثبيت ومزيد من المعالجة النسيجي.
ردود الخلايا العصبية ميكانيكية حسية التعصيب تقليديا درس بصيلات الشعر في القوارض vibrissae 1،2، وإلى حد أقل، في المستحضرات الجلدية معزولة 3،4. قد علمت هؤلاء لنا الكثير عن المبادئ العامة للعلم وظائف الأعضاء ميكانيكية حسية في النهايات العصبية المحيطة جذع الشعرة. إعداد vibrissal يسمح مراقبة رائعة على حركة جريب شعرة واحدة. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون من الصعب فك إخراج المقرر أن تعقيدها، كما vibrissalبصيلات تحتوي على ما لا يقل عن 8 أنواع مختلفة من نهاية ميكانيكية حسية مميزة تشريحيا (5) ومطابقة هذه الأنواع المورفولوجية لردود الكهربية محددة لا يزال موضع خلاف. وغالبا ما يستخدم / إعداد العصب الصافن الجلد الماوس في حالته نزعه للتحقيق استجابات اللمس والألم. تعصيب من بصيلات الشعر في مثل هذا التحضير هو أقل تعقيدا ولكن كثافة من بصيلات الشعر، بالإضافة إلى وجود ثلاثة أنواع الجريب مختلفة (حارس، الخرامه / auchene والشعر متعرجة) في مقربة من هذا القبيل 6، يعني دراسة استجابات محددة من جريب واحد أو نوع واحد من انتهاء يمثل تحديا مرة أخرى. وعلاوة على ذلك، وهذا ينطوي على إعداد تشريح المعقد. وأخيرا، في كل من vibrissal وغيرها من المستحضرات الجلدية، فإنه من الصعب تصور النهايات يشارك في حين أن المجراة سابقا الاستعدادات لا تزال على قيد الحياة. وبالتالي، لا بد باجتزاء الأنسجة حتى في خطوط الماوس، معربا عن GFP. Alternatively، فإنه يتطلب مزيدا من النسيجي / المناعية معالجة مثل تثبيت و / أو حضانة الأجسام المضادة للالمناعي.
لذا قمنا بتطوير إعداد الصيوان واستخدامها لجعل التسجيلات الكهربائية من عدد محدود من الأفراد من afferents بصيلات الشعر وتبين أن غشاء الدراجات يحدث في هذه النهايات سناني الشكل، يتضح من الإقبال على الأصباغ styryl البيريدينيوم. وأخيرا، أظهرنا أن الصبغة لا تتداخل مع حساسية الميكانيكية، مشيرا إلى أنه لا يمنع القنوات mechanotransduction. ويوضح نتائج التحفيز وتحليل بروتوكولات بسيطة.
Protocol
الماوس بعد الوفاة الحصاد الأنسجة يجب استخدام أساليب الموافقة الأخلاقية. في المملكة المتحدة، خلع عنق الرحم هو وسيلة الحكومة الموافقة على فئران بالغة (سرد طريقة الجدول 1 في الحيوانات المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) قانون و 1986 و التوجيه الأوروبي 2010/63 / الاتحاد الأوروبي). يتم فرض هذا التشريع محليا في جامعة أبردين من قبل رعاية الحيوان ومجلس المراجعة الأخلاقية الذي مراجعتها والموافقة عليها كل الإجراءات المستخدمة في بروتوكول التالي.
ملاحظة: استخدمت هذه الأساليب في البحث عنها في البنوك وآخرون 7.
1. الآذان التحضير لالكهربية
- قبل تشريح، وإعداد محلول فسيولوجي القياسية، مثل لLiley (1956) وتشبع مع 90٪ O 2/5٪ CO 2. وتتألف المالحة Liley في (ملي) من: NaHCO 3 (12)، بوكل (4)، KH 2 PO 4 (1)، كلوريد الصوديوم (138.8)، MgCl 2 (1)، CaCl 2 (2) والجلوكوز(11).
- إنسانية الموت ببطء ماوس الكبار دون الإضرار الجمجمة قرب الأذنين. هنا نستخدم C57 / Bl6J وMF1 الفئران ولكن أي سلالة الماوس المختبر القياسية يمكن استخدامها. من الناحية المثالية، استخدم الفئران التي هي <25 ز لو كان التسجيل الكهربائي لتكون جنبا إلى جنب مع وضع العلامات styryl صبغ، كما وصفها في الفئران الأكبر هو أقل موثوقية، وغالبا ما يتم العثور إلا في المناطق مقيدة مقيدة.
- إزالة الرأس مع مقص كبيرة أو المقصات العظام.
- وضع رئيس الجانب الظهري في بالغاز في Liley في طبق تشريح واسعة القاع (50 سم عادة مريحة) على مسرح المجهر تشريح ستيريو. بانتظام (~ 10 دقيقة) السد أو غمر رأسه المالحة بالغاز.
- بعناية شق وفصل الجلد في قاعدة الأذن الخارجية (الصيوان) مع مقص springbow و# 3 ملقط، ويعرض غضروف الصماخ السمعي الخارجي (EAM). التعرف على فروع مثلث التوائم (تقسيم الفك السفلي، المالديف) والأعصاب أذني كبيرة عند ظهورها ومدمج الجمجمة في الشق من الفك السفلي المشروع المشترك ومن خلال قاعدة الغضروف يعصب جوانب الصيوان الجلد مقعر (الأمامي) ومحدبة (الخلفي)، على التوالي.
- بالقرب من الجمجمة، وتحديد أين وهما عصب فروع الخروج في الأخدود بين الفك وعملية الخشاء. زيادة طولها عن طريق سحب بلطف الصيوان بعيدا من الجمجمة وقطع الأعصاب أقرب إلى الجمجمة ممكن.
- إزالة الصيوان من الرأس مع مقص springbow، مع الحرص على تجنب جذوعها البعيدة للأعصاب تقسيم وتقليل كمية من نتف الشعر الكثيف في قاعدة الأذن التي تم شطبها.
- نقل الصيوان إلى مطاط السيليكون المرن (PDMS) طبق -lined مملوءة بسائل بالغاز Liley ل. فتح زير الشئون الخارجية بتقسيمه في أضيق نقطة (الأمامية الأكثر). تتسطح الصيوان، والجلد الأمامي (مقعرة) الجانب السلبي ودبوس إلى PDMS بعناية على حواف مع ~ 6-8 متباعدة بصورة منتظمة دقيقة جدا (~ 0.2 مم) دبابيس الحشرات.
- ريماوفه الجلد من الجانب الخلفي من الصيوان بالكامل وإزالة جزء من غضروف الصيوان عن طريق تشريح حادة مع # 3 ملقط، وضمان ويترك الجلد الأمامي سليمة.
- مع نقطة دبوس الحشرات غرامة اغتنامها مع # 3 ملقط، تمديد بلطف فروع (عادة 2) من المالديف التي تظهر الخلف بين الجلد والغضاريف وزير الشؤون الخارجية. يعلقون هذه إلى PDMS مع أرقى دبابيس الحشرات الممكنة، التخوزق النسيج الضام المجاورة لها قطع ينتهي وليس جذوع الأعصاب أنفسهم.
- إزالة معظم الأنسجة الضامة المحيطة من حولهم، وتجنب بعناية ضرر من زيادة سحب أو القطع.
2. تسجيل الكهربية إعداد
- دبوس الجلد الصيوان إلى قاعدة اصطف PDMS من غرفة تسجيل مع دبابيس الحشرات الدقيقة حول حواف (~ 6-8 في الأذن)، ووضع الأعصاب تنظيف في قاعدة الأذن بالقرب قطبين شفط - واحدة للتسجيل (ل اتخاذ العصب)، وبعد التمديدلها إلكترود غير مبال (لتوفير إشارة محايدة لمكبر للصوت التفاضلية، انظر 7).
- لالقطب تسجيل، مباراة بعناية الفتحة والقطر الداخلي من الانفتاح على سمك المشتركة للأعصاب اثنين، حتى تتلاءم بشكل مريح كما ممكن، ولكبيرة كما طول ممكن.
- رسم الأعصاب إلى القطب عن طريق الشفط لطيف من حقنة 2 مل تعلق على الطرف الآخر مع أنبوب السيليكون والمطاط. ضمان الأعصاب هي على التوالي، وليس مطوية أو تضاعفت تصل.
- تطوير عالية الكهربائية تناسب مقاومة / مقاومة باستخدام شفط أقوى لرسم النسيج الضام أو الأنسجة الدهنية لتشكيل المكونات التي الاختام بإحكام الفتحة حول العصب.
- ملء (غير مبال) القطب الآخر مع المياه المالحة عن طريق الشفط إذا لزم الأمر (قد شغل قبل عمل شعري).
- وضع الأسلاك تسجيل متطابقة (الفضة أو البلاتين) في تجويف الداخلي للأقطاب تسجيل في الاتصال المالحة والعصبية(تسجيل) أو ضاقت، نهاية مصقول النار (غير مبال) من القطب. وملحوم كل قطب على حدة لالنوى مختلفة من الكابلات فرزهم الأساسيتين. ضع حمام (الأرض) القطب (حج / أجكل بيليه) في الحمام، وطحنه حتى صار شاشة كابل اثنين الأساسية المتصلة أقطاب تسجيل.
- تغذية النشاط الكهربائي من القطبين في القنوات منفصلة من مكبر للصوت التفاضلية، فلتر (-مرت الفرقة 0،2-2 كيلو هرتز)، وعرض على شاشة الذبذبات. تأكد من أن القناة ألف (تسجيل) وقناة B (غير مبال) مستويات الضوضاء الكهربائية تبدو مماثلة. في هذه المرحلة، قد لا يكون من الممكن أن نرى إمكانات العمل عفوية طبيعية في القناة وقبل القطبين متوازنة.
- معالجة أي خلافات في الضوضاء الخلفية بين الأقطاب الكهربائية عن طريق زيادة مقاومة للتسجيل (قناة A) أو غير مبال (قناة B) الأقطاب. القيام بذلك عن طريق مص الهالي (الدهنية) النسيج الضام الى مزيد إما الكهربائي، و/أو تطبيق أكبر قوة الشفط على حقنة 50 مل.
- مرة واحدة "متوازن" في هذا الطريق، والتبديل إلى التفاضلية تسجيل (AB) والبحث في إمكانات عفوية عمل (الجزائرية) في تتبع أو عندما التمسيد الشعر على هامش الصيوان. إذا كان ينظر أي نشاط (ارتفاعه)، وإعادة فحص تناسب ضيق من العصب في القطب تسجيل والنسيج الضام الهالي في القطب غير مبال - عادة ما تكون أكثر صرامة (أعلى مقاومة) الختم وأكثر مساواة للمقاومة في اثنين الأقطاب الكهربائية، كلما كان ذلك أفضل. مع الممارسة، وهذا تحقيق نوعية جيدة (> 2: 1) إشارة: نسبة الضوضاء.
- تسجيل electroneurogram عبر واجهة المختبر والكهربية البرامج التي تعمل على الكمبيوتر. إخراج الصوت من ارتفاعه مفيد جدا ويمكن أن يتحقق من خلال إطعام مخطط عصبي من خلال مكبر الصوت ومكبر الصوت المصاحب. ضبط عتبة أن تكون أعلى بقليل من الضجيج الأساسي (التي حددها غياب الأبيض نإيل دو فرانس 'همسة').
- لزيادة المخدرات أو الفلورسنت الوصول styryl صبغ إلى النهايات سناني الشكل، بعناية قشر بعيدا الطبقة الدهنية شبه الجلدي بالقرب من هامش الصيوان، وفتح نافذة لل~ 5 مم × 5 مم تعريض الأدمة وقاعدة بصيلات (الشكل 1A، B ).
- عودة دبوس أضعاف من ~ 1 ملم من تطهيرها الدهنية الجلد الأذن على هامش الرائد (على مستوى النافذة تنتج فقط، إن وجدت)، وترك فجوة واضحة مليئة المالحة بين طبقات الجلد الرئيسي يعارضها. بلطف السكتة الدماغية الشعر جاحظ على طول حافة مطوية مع دبوس أو ملقط غرامة على الارض، دون لمس الجلد، لتحديد مجال الانتاج AP الأقصى على الذبذبات ومميزة "النقرات" و "الملوثات العضوية الثابتة" في إخراج الصوت.
3. الإمكانيات العمل تسجيل التحفيز أثار-
- ضع التحقيق التحفيز الميكانيكي - 10 سم البورسليكات مسرى مكروي الزجاج المصقول النار تعلق على ceramiج بيزو كهربائي المحرك - حتى حركة موازية مع طية الجلد. مكان غيض حوالي 0.5-1 ملم من الجلد أضعاف، لذلك يمس شعرة ولكن ليس على الجلد. تحقق من التحفيز الفعال من جانب تتحرك ببطء تلميح التحقيق يدويا لتفادي الشعر ومراقبة / الاستماع إلى ارتفاعه.
- استخدام البرنامج لحملة التحفيز الميكانيكي من 1-3 الشعر (على سبيل المثال 3 ثانية في 5 الجيوب هرتز، كل 10 ثانية. دقق تشريد 200-500 ميكرون)، وتسجيل استجابات أثار التحفيز في الأعصاب.
- إعطاء عدة متطابقة القطارات تحفيز الميكانيكية في 10 ثانية فترات. ضبط موضع التحقيق عن التكرار، ثم خفض وتيرة التحفيز وفقا لبروتوكول تجريبي (على سبيل المثال تكرار معدل انخفاض من 10 ثانية إلى 30 ثانية).
- استخدام البرنامج لتميز AP-مثل النشاط على سبيل المثال باستخدام عتبة بسيطة لتعيين ~ 2X سعة ضوضاء عالية التردد و~ 25٪ من أكبر نقاط وصول.
- عد نقاط وصول عبور عتبة كما"الاحداث"، قياس وتيرة وخصائص نقاط وصول إنتاجها.
4. إطلاق النار تسجيل التحفيز أثار-جنبا إلى جنب مع N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد وصفها
- لدراسة آثار الأصباغ styryl على أثار التحفيز اطلاق ارد ووضع العلامات محطة، إضافة التركيز المناسب من صبغة styryl الاختيار، إلى حل الاستحمام والاستمرار في تسجيل الكهربائية.
- بعد وقت التعرض المطلوبة (عادة 30 دقيقة على الأقل)، وإعداد استعدادا لعرض المسام. تتكشف رفرف الجلد عن طريق إزالة المسامير الاحتفاظ، وفضح منطقة الجلد مسح للكشف عن العلامات المحطة.
- يغسل صبغ خارجي مع المياه المالحة خالية من الصبغة، مما يجعل 3 تغييرات كاملة من المياه المالحة.
- احتضان في التغيير النهائي بالغاز المالحة خالية من الصبغة لمدة 10-15 دقيقة للسماح للتلوث صبغ ثباتا ليتش من يتعرض الأغشية / الخارجية.
- إزالة الصبغة غير المنضوية المتبقية على الأغشية مع وكيل عزل (sulfobutylated بيتا سيكلودكسترين، 1 ملم، 5 دقائق) في المياه المالحة.
- نقل غرفة تسجيل لمرحلة المجهر epifluorescence تستقيم وإشراك غرفة مع الحركة الآلية مرحلة / الشرائح.
- إلقاء الضوء على التحضير مع ضوء الإثارة يتناسب مع صبغ styryl. استخدام الهدف المجهر 10X أو 25X مضان لمراقبة العلامات جريب (الشكل 1).
Representative Results
الترتيب تسجيل الكهربية، مع الأنسجة الدهنية تحت الجلد إزالة لفضح بصيلات الشعر، ويظهر في الشكل 1A. ويرد جزء من هذه المنطقة تتعرض في التكبير العالي في الإضاءة brightfield في الشكل 1B. للطي هامش الصيوان صعودا ومرة أخرى على نفسه في هذا المجال يعرض سطح البشرة. هذه المواقف الشعر على حافة حظيرة لنتأ أفقيا، في وضع مثالي لالتحفيز الميكانيكي مع التحقيق الذي تجريه حادة (لا يظهر). الشكل 1C يظهر أنه بعد التعرض صبغ وإعادة الهامش إلى المركز تكشفت مرة أخرى، وبصيلات حفز في هذا الموقف تم المسمى مع صبغة styryl البيريدينيوم. Electroneurograms من الاستعدادات وعادة ما تظهر النشاط AP مستمر حتى في غياب الحركة التي تفرضها لجنة التحقيق من الألياف الزجاجية، بما في ذلك نقاط وصول أكبر حجم (الشكل 2A
الشكل 1: الكهربية ترتيب تسجيل وN- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد وصفها من الشعر المسام النهايات وارد سناني الشكل (A) والصيوان إعداد أنشئت لتجربة الكهربية تبين الصيوان التوجه، وموقع للأعصاب، والأقطاب تسجيل والمنطقة المكشوفة من تعصيب المسام بعد إزالة الأنسجة الدهنية. (ب) عدة بصيلات الشعر واضحة في الإضاءة الحقل مشرقة في المنطقة التي تم تطهيرها من الأنسجة الدهنية الفوقية وصولا الى الأدمة. الظلام، والفص عادة، الأشكال هي الغدد الدهنية. (
الشكل 2: (أ) أثار التحفيز آخر المسجلة من بينا ماوس. (منظمة العفو الدولية والثاني والثالث) أمثلة، والتي اتخذت من 3 تجارب مختلفة، من النشاط من neurograms مستمرة من pinnae في محلول ملحي القياسية Liley ل. يظهر كل سجل قسم 5 ثانية تقريبا 5 دقائق بعد بدء التسجيل، بما في ذلك فترة 3 ثانية من النزوح الجيبية من حيثعدد مراكز التسوق في مهاوي الشعر. وتكررت التحفيز الميكانيكي كل 30 ثانية في جميع أنحاء تسجيل مستمر، والتي استمرت عادة لمدة 1-2 ساعة. تميزت ملفات البرامج النصية المخصصة الأحداث الفردية التي عبرت عتبة التي وضعتها المؤشر الأفقي (المسامير)، وكذلك بداية كل دورة الجيبية (فترة). (AIV) إشارة القيادة للنزوح الجيبية. (ب) تحليل التحفيز-أثار التشويك آخر. (بي-ج) رسوم بيانية دورة في 3 ° صناديق شيدت من العينات مخطط عصبي (منظمة العفو الدولية والثاني والثالث) على التوالي، والتي تبين ردود النهايات سناني الشكل يفترض أن التحفيز الميكانيكي بنسبة 5 هرتز النزوح الجيبية من اعمدة الشعر عن طريق تحقيق الزجاج. لاحظ تميزت مرحلة قفل، في مراحل مختلفة من دورة، تبعا لموقعها بالنسبة الى نقطة الانطلاق لجنة التحقيق الميكانيكية. (BIV) تحقيق تطبيع النزوح السيني. كانت السعة الفعلية ما يقرب من 1001؛ م الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا، قمنا بتطوير إعداد بسيط نسبيا التي يمكن تشريح بسرعة، لديها منخفض الكثافة بصيلات الشعر وتسمح التحفيز الميكانيكي انتقائية نسبيا من عدد قليل من بصيلات الشعر. ويمكن الوصول إليها بسهولة لتسجيل الكهربية والخلية الحية التصوير الفلورسنت، بما في ذلك الاستجابة لصبغ تطبيق لتصور بصيلات الشعر حفز ميكانيكيا، أي بصيلات التصوير مع ردود الكهربية محددة. في حين أننا لم نفعل ذلك، كما يبدو أن هذا النظام قابلة بسهولة لشبه-تقسيم العصب الحسي من أجل وحدة واحدة (واحد عصبي حسي) تسجيل واستخدام المستهدفة GFP في التعبير عن تصور الحسي محطة إنهاء التشكل.
وقد استخدمنا إعداد الجلد الأذن للتحقيق في خصائص استيعاب والافراج عن فلوري غشاء styryl الأصباغ pridinium 7، وهي تقنية طورت في الأصل لدراسة vesic المحليةلو تدوير الغشاء في محطات متشابك 8. في نقاط الاشتباك العصبي، وكذلك الجمع بين التصوير بسهولة مع تسجيل الكهربية في وقت واحد من الردود في المحطات التي تم تحديدها 8،9. وكان في هذه الدراسات المبكرة التي لاحظنا أولا الأصباغ والمنضوية أيضا النهايات ميكانيكية حسية 10. لالخلايا العصبية الحسية في الثقافة وفي خلايا الشعر القوقعة، فإن الكثير من العلامات التي الأصباغ styryl البيريدينيوم يبدو لإشراك الأصباغ التي تمر عبر قنوات ميكانيكية حسية، والتي ثم منع 11،12. ثم تسمية الأصباغ أغشية الخلايا، وهذه العلامات لا رجعة فيه. ومع ذلك، في خلايا الشعر التي لا تحفز ميكانيكيا 13،14 وفي محطات متباينة تماما الأولية الحسية العصبية في الموقع، مثل النهايات الأول (أ) في مغزل العضلات 15، والنهايات سناني الشكل هنا 7، styryl صبغ العلامات يبدو أن تعكس غشاء الإلتقام، منذ الوسم هو عكسها ولا يمنع الدقة ميكانيكية حسيةponses 7،15،16. في حين أن بعض استيعاب صبغ من قبل تخلل قناة في هذه النهايات لا يمكن استبعاده تماما، فمن الواضح من استمرار إطلاق خلال حضانة صبغ والعودة إلى الوراء من وضع العلامات على أن الغالبية العظمى من وضع العلامات في محطات متباينة في الموقع هي من خلال استيعاب مع حويصلة إعادة التدوير غشاء. وبالتالي، يتم استخدام هذه التقنية بسيطة بسهولة لرصد الكهربائية والبصرية المشترك لمجموعة من الوظائف محطة ميكانيكية حسية في أنسجة خارج الحي.
كما هو الحال مع معظم التقنيات العملية، واستنساخ تتطلب التكرار والممارسة. والآن وصفها بعض النقاط الرئيسية اهتماما خاصا يستحق. طوال الدورة تشريح والتسجيل، وتعظيم الجدوى الأنسجة والبقاء على قيد الحياة من خلال ضمان إعداد وperfused باستمرار مع المياه المالحة مشبعة تماما مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. ضمان الشعر لا نزوح بصيلات خلال هذه العملية، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي سوف تحفز اطلاق إنهاء الحسي. إما استخدام، وتدفق الصفحي نظام مستمر نضح، أو بعناية الغاز فقاعة من خلال حمام الجهاز مع أنابيب غرامة على مسافة من إعداد أو تحديث بعناية حلول كل 20-30 دقيقة، والحفاظ على إعداد تحت سطح المياه المالحة في جميع الأوقات. مصنوعة أقطاب تسجيل الشفط عن طريق تعديل الحادة ماصات القطب البورسليكات تستخدم عادة لتسجيل داخل الخلايا. أولا، كسر بعناية من النصائح حادة مع # 3 ملقط لإعطاء القطر الداخلي المناسب لتناسب الأعصاب والنار البولندية من قبل وجيزة جدا (<1 ثانية) التعرض لبنسن لهب الموقد (انظر 2.4 و 2.5). للحصول على جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند التسجيل، فمن الضروري أن معاوقة (المقاومة) في هذه القطبين إلى أقصى حد ممكن وعلى قدم المساواة على حد سواء. القيام بذلك عن طريق الالتفات الى ما يلي في القطبين. لالقطب تسجيل، وضمان قطرها الداخلي هو نوبة دافئ للعصب، والحد الأقصى لطول شمال شرقويوجه RVE في القطب تسجيل. محاولة استخدام الأنسجة الضامة المحيطة العصب لختم فعال طرف القطب. بدلا من ذلك، أو بالإضافة إلى ذلك، رسم نهاية الضيقة ل، قطعة مدبب الحجم مناسب من الأنسجة الدهنية في جنبا إلى جنب مع العصب. ثم قم بتوصيل الطرف الكهربائي من خلال تطبيق شفط قوي ل~ 1 دقيقة مع حقنة 50 مل تعلق على الأنابيب. لمعلومات سرية مختومة جيدا، وتطبيق شفط قوي بكل بساطة تعزيز فعالية التوصيل ولن جذب أكثر سيولة أو العصبية. لتجنب تلف الأعصاب، ومع ذلك، تأكد من أن النسيج الضام ويخفف حدة العصبية من الضغط على المواد المحيطة بها وزير الشئون الخارجية الغضروف. القطب غير مبال يجب أن تحاكي المقاومة / مقاومة من القطب تسجيل بأكبر قدر ممكن. ويساعد على ذلك بعناية النار تلميع طرف إلى صغيرة فتحة ممكن من دون ختم فعلا. اذا كانت هناك حاجة مزيد من المقاومة، ثم قم بتوصيل نهاية القطب غير مبال مع adipoحد ذاته النسيج الضام، كما هو موضح أعلاه لالقطب تسجيل.
وelectroceramic يعطي السيطرة رائعة مطلة على النزوح الميكانيكية، مكانيا وزمانيا. ومع ذلك، ورعاية إجراء التوصيلات الكهربائية - ارتفاع درجات الحرارة تدميرها، حتى لا تستخدم لحام الساخن. استخدام محملة المعادن الايبوكسي الغراء، أو استخدام مأخذ توافق بالضغط متخصص الموصى بها من قبل المورد. وهذا على حد سواء لأنه عقد بحزم وإقامة الربط الكهربائي. إرفاق التحقيق الزجاج محفزة للelectroceramic مع راتنجات الايبوكسي القياسية. النار تلميع نهاية القياسية 10 سم × 1.5 مم البورسليكات أنابيب الزجاج الشعرية التي تستخدم في صنع التصحيح أو الأقطاب حادة لتسجيل الكهربية للحد من خطر تلف الأنسجة. إذا كنت بحاجة تحفيز بصيلات الشعر واحد، والحرائق تلميع طرف لتناسب شعرة واحدة، وموقف التحقيق مع شعرة واحدة داخل الفتحة مفتوحة. هذا يعطي السيطرة رائعة مطلة على شعرة واحدة. لدى styrylه وضع العلامات، هو أكثر عموما موحدة في الأنسجة من الحيوانات الأصغر سنا. وليس من الواضح تماما لماذا، ولكن هذا من المرجح يعكس جروحا أقل الميكانيكية وإزالة أكثر فعالية الأنسجة العميقة من الأنسجة الأصغر سنا. كن دقيقا في إزالة طبقة رغوي تشبه إلى البوليسترين الموسع تغمر قواعد بصيلات الشعر. ومع ذلك، تجنب قوية جدا، وهذا يهدد إزالة طبقة الضفيرة العصبية ومحطات سناني الشكل المرتبطة بها. إذا كان هناك القليل أو أي رد الكهربائية لحركة بصيلات الشعر، وتطبيق styryl صبغ يؤدي إلى وضع العلامات الغالب من الغدد الدهنية (أصفر / أبيض)، مع تألق ذاتي واضح في قاعدة عمود الشعر بدلا من النهايات سناني الشكل (برتقالي / أصفر)، إزالة الإفراط في الحماس وتلف الأنسجة الكامنة. وأخيرا، وذلك باستخدام وكيل صبغ مخلبية قبل التصوير يحسن إلى حد كبير على النقيض من الصورة وجودة الصور النهائية.
هذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة في مجموعة واسعة من إجراء المزيد من الدراسات. هذه المشاركتشمل يونيتبول، على سبيل المثال، وفحص للقناة ميكانيكية حسية (ق) المسؤولة عن الاستجابات أثار تمتد، التي يحتضنها إعداد مع بروابط الدوائية انتقائية للقنوات مرشح أو فحص خطوط الفأر مع هذه القنوات المحذوفة وراثيا. وهذه الأخيرة يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع تقييم مضان من أي تغييرات في التشكل المحطة بسبب التلاعب الجيني في خطوط الماوس، على سبيل المثال مع مرتبطة Npy2r التعبير GFP 17. قد يكون هناك مثال أخير التحقيق في دور الحويصلات مثل متشابك (يتعامل هؤلاء الموردون) 7 في هذه المحطات سناني الشكل من خلال دراسة تأثير جهري من دوران السلفادور (الكالسيوم، والمغنيسيوم، latrotoxin، بروابط مستقبلات الغلوتامات) على استجابات أثار تمدد الجلد وامتصاص styryl صبغ /إطلاق سراح. وهكذا، هذه التقنية الجديدة تفتح مجموعة من السبل المحتملة للاهتمام من الأبحاث في علم الأعصاب mechansensory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).
- Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
- Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).
- Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).
- Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).
- Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3 (1), 1 (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
