Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Kombineret Registrering af mekanisk stimuleret Afferent Output og Nerve Terminal Mærkning i Mus hårsækken lancetformede Endings

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

En hidtil ukendt dissektion og optagelse teknik er beskrevet til overvågning afferente fyring fremkaldt ved mekanisk forskydning af hår i muse pinna. Teknikken er meget omkostningseffektiv og let foretages med materialer, som oftest findes i de fleste elektrofysiologi laboratorier, eller let købt. Dissektion er enkel og hurtig, med den mekaniske forskydning leveres af en generisk elektrokeramiske wafer styret af proprietær software. Den samme software også registrerer og analyserer electroneurogram udgang. Registreringen af ​​det fremkaldte nerveaktivitet er gennem en kommerciel differential forstærker forbundet til brand-poleret standard glas mikroelektroder. Nyttige tips er givet for at forbedre kvaliteten af ​​forberedelsen, stimulering og optageforholdene at optimere optagekvalitet. Systemet er velegnet til analyse af de elektrofysiologiske og optiske egenskaber af lancetformede terminaler palisade endelser hårsækkene, samtresultater af deres farmakologiske og / eller genetisk manipulation. Et eksempel på at kombinere elektrisk optagelse med mekanisk stimulering og mærkning med et styryl pyridinium vitalfarvestof er givet.

Introduction

De lancetformede terminaler sensoriske axoner innerverer hårsækkene i pattedyr danner palisader omkring håret-akslen epitel. Deres formål er at afsløre mekanisk forskydning af hårene de omgiver. De er en blanding af hurtigt og langsomt tilpasse endelser, der overvejende producerer korte byger af aktivitet som reaktion på håret bevægelse. Aktivitet ophører meget hurtigt, når bevægelsen standser, selv i nærvær af en fortsat forskydning. Her beskriver vi udviklingen af ​​denne murine pinna model for korrelative studier af struktur og funktion i lancetformede terminaler. Den ydre øre har mange fordelagtige funktioner til at studere disse endelser. Først, pinna er væsentlige to lag af huden apposed back-to-back, med lidt andre væv mellem at forstyrre adgangen til folliklerne og terminaler. Huden er meget tynd og let dissekeret grund af minimale mængder af hård bindevæv. Den innervation er let tilgængelig og kan identificeres. Mens hår follicles er til stede, er de relativt tyndt fordelt, lette stimulering af individuelle eller små grupper af hårsække mekanisk. Den tynde underliggende hudlag giver god tilgængelighed til de nerveender med farmakologiske stoffer og farvestoffer. Dette gør dem særligt egnet til den billeddannende undersøgelser under anvendelse af fluorescensmikroskopi. Billedtromlen kan enten være i levende terminaler, eller efter fiksering og yderligere histologisk bearbejdning.

Svarene fra mechanosensory neuroner innerverer hårsækkene er traditionelt blevet undersøgt i gnaver vibrissae 1,2 og, i mindre grad, i isolerede hud præparater 3,4. Disse har lært os meget om de generelle principper for mechanosensory fysiologi i nerveender omkring hårstrået. Den vibrissal forberedelse giver udsøgt kontrol over bevægelsen af ​​en enkelt hårsæk. Imidlertid kan det være vanskeligt at dechifrere output på grund af sin kompleksitet, som vibrissalhårsække indeholder mindst 8 forskellige typer anatomisk distinkt mechanosensory slutning 5 og matchning af disse morfologiske typer til specifikke elektrofysiologiske svar er stadig genstand for tvist. Musen hud / vena nerve præparat er oftest bruges i sin afhåret tilstand at undersøge røre og smerte svar. Den innervation af hårsækkene i et sådant præparat er mindre kompleks, men tætheden af hårsækkene, plus tilstedeværelsen af tre forskellige follicle typer (vagt, Syl / auchene og zigzag hår) i en sådan nærhed 6, betyder at studere de konkrete svar på en enkelt follikel eller enkelt type slutning igen udfordrende. Desuden dette præparat indebærer en kompleks dissektion. Endelig i både vibrissal og andre hudpræparater, er det vanskeligt at visualisere endelser involveret mens ex vivo præparater er stadig i live. Således er vævssektionering kræves selv i GFP-udtrykkende muse linjer. Alternatiholdsvis, den ønsker yderligere histologisk / immunologisk bearbejdning, såsom fiksering og / eller antistof inkubering i immunfluorescens.

Derfor har vi udviklet pinna forberedelse og brugte det til at lave elektriske optagelser fra et begrænset population af hårsækken afferente og viser, at membranen cykling forekommer i disse lancetformede slutninger, fremgår af optagelse af styryl pyridinium farvestoffer. Endelig viste vi, at farvestoffet ikke interfererer med mekanisk følsomhed, hvilket indikerer, at det ikke blokerer mechanotransduction kanaler. Resultaterne af simple stimulering og analyse protokoller er illustreret.

Protocol

Mus post mortem væv høst skal der bruges godkendt etiske metoder. I Storbritannien, cervikal dislokation er en regering godkendt metode til voksne mus (en fredet Skema 1 metode i Storbritannien Dyr (Scientific Procedures) Act, 1986 og europæisk direktiv 2010/63 / EU). Denne lovgivning håndhæves lokalt på University of Aberdeen i dyrevelfærd og Etisk Review Board, som revideret og godkendt alle procedurer, der anvendes i den følgende protokol.

Bemærk: Disse fremgangsmåder blev anvendt i forskning rapporteret i Banks et al 7.

1. Forberedelse Ører til Elektrofysiologi

  1. Før dissektion fremstilles en standard fysiologisk saltopløsning, såsom Liley s (1956) og mætte den med 90% O2 / 5% CO2. Liley s saltopløsning (mM) består af: NaHCO3 (12), KCI (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCI2 (1), CaCl2 (2) og glucose(11).
  2. Humant aflive en voksen mus uden at beskadige kraniet nær ørerne. Her bruger vi C57 / BL6J og MF1 mus, men enhver standard laboratorie musestamme kan anvendes. Ideelt bruge mus, der er <25 g, hvis elektrisk optagelse skal kombineres med mærkning styrylfarvestof, som mærkning i større mus er mindre pålidelige, ofte bliver kun findes i begrænsede afgrænsede områder.
  3. Tag hovedet med store saks eller knogle saks.
  4. Placer hovedet dorsale side op i gasset Liley s i en bred bund dissektion fad (50 cm er normalt praktisk) på scenen af ​​en stereo dissektion mikroskop. Regelmæssigt (~ 10 min) sluse eller nedsænkes hovedet med gasset saltvand.
  5. incise og adskille huden ved basis af det ydre øre (pinna) med springbow saks og # 3 pincet, udsætter brusk fra den ydre øregang (EAM) omhyggeligt. Identificere grene af trigeminus (mandibular division, MDV) og store auricular nerver, da de opstår from kraniet i kløften af ​​mandibulær led og projektet gennem brusken base for at innerverer den konkave (forreste) og konveks (posterior) aspekter af ydre øre hud, hhv.
  6. I nærheden af ​​kraniet, identificere, hvor de to nerve grene exit i rillen mellem kæben og mastoid proces. Maksimere deres længde ved forsigtigt at trække pinna væk fra kraniet og skære nerverne så tæt på kraniet som muligt.
  7. Fjern pinna fra hovedet med springbow saks, idet man undgår de distale stubbe af de opdelte nerver og minimere mængden af ​​tæt pelage ved basis af øret, der er fjernet.
  8. Overfør pinna til en fleksibel silikonegummi (PDMS) -lined fad fyldt med gasset Liley s væske. Åbn EAM ved at dividere det smallest (anterior-mest) punkt. Glat ydre øre, forreste hud (konkave) nedad og pin til PDMS nøje på kanterne med ~ 6-8 regelmæssigt fordelte meget fine (~ 0,2 mm diameter) insekt ben.
  9. Remove huden på den bageste del af det ydre øre fuldstændigt og delvist fjerne pinna brusk ved stump dissektion med # 3 pincet, sikrer den forreste huden efterlades intakt.
  10. Med spidsen af ​​en fin insekt pin greb med # 3 pincet, forsigtigt udvide grenene (normalt 2) af MDV der opstår posteriort mellem huden og EAM brusk. Pin disse til PDMS med de fineste mulige insekt ben, spidde bindevævet tilstødende deres afskårne ender og ikke nerve trunke selv.
  11. Fjern det meste af det omgivende bindevæv omkring dem, omhyggeligt undgår skader fra overskydende trække eller skæring.

2. Elektrofysioloqisk Optagelse Opsætning

  1. Pin pinna huden til PDMS-foret base af en optagelse kammer med fine insekt stifter omkring kanterne (~ 6-8 pr øre), placere de rensede nerver ved basis af øret nær to sugeelektroder - én til optagelse (til tage nerven) og othende en neutral elektrode (for at tilvejebringe den neutrale signal til en differential forstærker, se 7).
  2. Til optagelsen elektrode, omhyggeligt passer åbningen og indre diameter af åbningen til den kombinerede tykkelse af de to nerver, så de passer så stramt som muligt, og så stor en længde som muligt.
  3. Tegn nerverne ind i elektroden ved forsigtig sugning fra en 2 ml sprøjte fastgjort til den anden ende med siliconegummirør. Sørg nerverne er lige, ikke foldes eller fordoblet op.
  4. Udvikle en høj elektrisk modstand / impedans fit ved at bruge stærkere sug til at trække bindevæv eller fedtvæv at danne en prop, der stramt forsegler åbningen omkring nerven.
  5. Fyld anden (ligegyldige) elektrode med saltvand ved sugning om nødvendigt (det kan fylde ved kapillarvirkning).
  6. Placer identiske optagelse ledninger (sølv eller platin) i det indre boring af optagelsen elektroder til at kontakte saltvand og nerve(Optagelse) eller indsnævret, flammepoleret ende (ligegyldige) af elektroden. Hver elektrode er loddet individuelt til forskellige kerner af to-leder skærmet kabel. Placer bad (jorden) elektrode (Ag / AgCl pellet) i badet og malede den til skærmen på to leder kabel forbundet til optagelsen elektroder.
  7. Feed den elektriske aktivitet fra de to elektroder i de separate kanaler af en differential forstærker, filter (band-bestået 0,2-2 kHz), og visning på et oscilloskop skærm. Kontroller at kanal A (optagelse) og kanal B (ligegyldige) elektriske støjniveauer ligner. På dette trin kan det ikke være muligt at se de normale spontane aktionspotentialer i kanal A, før de to elektroder er i balance.
  8. Rette op eventuelle forskelle i baggrundsstøj mellem elektroder ved at øge impedans optagelsen (kanal A) eller ligegyldige (kanal B) elektroder. Gør dette ved at suge areolar (fedt) bindevæv længere ind enten elektrode, og /eller anvende større suge kraft på 50 ml sprøjte.
    1. Når "afbalanceret" på denne måde, skal du skifte tilbage til differential (AB) optagelse og se efter spontane aktionspotentialer (APS) i spor, eller når strøg hår på margin pinna. Hvis nogen aktivitet (spiking) ses, re-check den stramme pasform af nerven i optagelsen elektrode og areolar bindevæv i den indifferente elektrode - normalt strammere (højere modstand) forseglingen og den mere lige impedans i to elektroder, jo bedre. Med praksis vil dette opnå en god kvalitet (> 2: 1) signal: støj-forhold.
  9. Optag electroneurogram via en lab-interface og elektrofysiologi software, der kører på en computer. Et audioudgangssignal af spiking er meget nyttig og kan opnås ved at føde neurogram ved audio- forstærker og tilhørende audio højttaler. Justér tærsklen til at være lige over baseline støj (identificeret ved fraværet af hvide-nOise 'hvæse').
  10. For at øge lægemiddel eller fluorescerende styrylfarvestof adgang til lancetformede endelser, forsigtigt skræl væk sub-dermal fedt lag nær pinna margin, åbne et vindue på ~ 5 mm x 5 mm udsætte dermis og bunden af folliklerne (figur 1A, B ).
  11. Pin tilbage en fold på ~ 1 mm af fedt-ryddet øre huden på den førende margin (på niveau af vinduet bare produceres, hvis relevant), efterlader et klart saltvand fyldt kløften mellem de apposed hudlag. Forsigtigt slagtilfælde hårene fremspringende langs den foldede kant med en nål eller jordede fin pincet, uden at røre huden, for at finde det område af maksimal AP udgang på oscilloskopet og den karakteristiske "klik" og "popper" i lyden.

3. Optagelse Stimulus-fremkaldte aktionspotentialer

  1. Placer mekanisk stimulering sonde - en flammepoleret 10 cm borsilicat mikroelektrode glas fastgjort til en Ceramic piezoelektrisk aktuator - så bevægelse er parallel med folden hud. Placér spidsen ca. 0,5-1 mm fra hudfold, så det rører hår, men ikke huden. Kontroller effektiv stimulering ved langsomt at bevæge sondespidsen manuelt at aflede hårene og observere / lytte til spiking.
  2. Brug softwaren til at køre mekanisk stimulering af 1-3 hår (f.eks 3 sek ved 5 Hz sinuskurver, hver 10 sek. Probe forskydning 200-500 um), og registrere stimulation-fremkaldte reaktioner i nerverne.
  3. Giv flere identiske mekanisk stimulering tog ved 10 sek intervaller. Optimer sonden position for repeterbarhed, derefter reducere hyppigheden af stimulation i henhold til forsøgsprotokol (f.eks drop gentagelse sats fra 10 sek til 30 sek).
  4. Bruge softwaren til at diskriminere AP-lignende aktivitet f.eks hjælp af en simpel tærskelværdi sat til ~ 2x den højfrekvente støj amplitude og ~ 25% af de største AP'er.
  5. Tæl APs krydser grænsen som»begivenheder«, kvantificerer hyppigheden og karakteristika af APs producerede.

4. Optagelse Stimulus-fremkaldte Firing Kombineret med N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide Mærkning

  1. For at undersøge effekten af ​​styrylfarvestoffer på stimulus-fremkaldte afferent fyring og terminal mærkning, tilsæt passende koncentration af en styrylfarvestof af valg, til badning løsning og fortsætte med det elektriske optagelse.
  2. Efter den krævede behandlingstid (sædvanligvis mindst 30 min), forberede forberedelse til visning folliklerne. Fold huden flap ved at fjerne låsestifterne, og udsætte det ryddet dermal området for at afsløre den terminal mærkning.
  3. Vask væk ekstern farvestof med farvestof-fri saltvand, gør 3 komplette ændringer i saltvand.
  4. Der inkuberes i sidste ændring af gasset farvestof-fri saltvand i 10-15 minutter for at tillade den mest vedholdende farvestof forurening udvaskes fra udsatte / eksterne membraner.
  5. Fjerne ikke-internaliseres farvestof forbliver på membraner med et sekvestreringsmiddel (sulfobutylated beta-cyclodextrin, 1 mM, 5 min) i saltvand.
  6. Overfør optagelsen kammer på scenen af ​​en opretstående epifluorescensmikroskop og engagere kammeret med scenen / slide bevægelse mekanisme.
  7. Belyse fremstillingen med excitationslys passende til styrylfarvestof. Brug en 10X eller 25X fluorescens mikroskop mål at observere hårsækken mærkning (figur 1).

Representative Results

Den elektrofysiologiske optagelse arrangement med subkutane fedtvæv fjernet for at blotlægge hårsækkene, er vist i figur 1A. En portion af denne eksponerede areal er vist ved en større forstørrelse i lysfelt belysning i figur 1B. Folding pinna margin op og tilbage på sig selv i dette område udsætter den epidermale overflade. Dette placerer hårene på kanten af folden til at rage horisontalt, i en ideel situation for mekanisk stimulation med en stump sonde (ikke vist). Figur 1C viser, at efter farve eksponering og returnere margenen til den udfoldede position igen, den stimulerede follikler på denne position er mærket med et styryl pyridinium farvestof. Electroneurograms fra præparater viser typisk igangværende AP aktivitet selv i fravær af pålagte bevægelse af glasfiber probe, herunder APs af største størrelse (figur 2A (Figur 2Bi-iii)). Dette er ganske gentagelig, selvom fasen af kurveformen ved hvilken reaktionerne er låst afhænger af deres position, dvs. på hvilket tidspunkt i bevægelsen de vibrerende sonde det kontakter hår. En simpel detektionsgrænsen (vandret linje passerer de neurogram spor i A (i-iii)) er blevet anvendt til denne analyse. Dog kan optagelse software funktionalitet ofte blive anvendt i en mere sofistikeret måde atdiskriminere træk spike størrelse og form. Dette kan så isolere svarene fra bestemte afferente fibre ved disse egenskaber til at tillade pseudo-single-enhed optagelse analyse, der skal gennemføres.

figur 1
Figur 1:. Elektrofysiologiske Recording Arrangement og N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) Pyridinium dibromid Mærkning af hårsækken Afferent lancetformede endelser (A) En ydre øre forberedelse oprettes for en elektrofysiologisk eksperiment viser ydre øre orientering, placeringen af ​​nerverne, registreringselektroderne og den belyste flade på follikel innervation efter fedtvæv fjernelse. (B) Flere hårsækkene er synlige i lyse felt belysning i området ryddet for overliggende fedtvæv ned til dermis. Den mørke, som regel bilobed, figurer er talgkirtler. ( 7, med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: (A) Stimulus-fremkaldt Aktivitet Optaget fra Mouse Pinna. (Ai-iii) Eksempler, taget fra 3 forskellige eksperimenter, af aktivitet fra kontinuerlige neurograms fra pinnae i standard Liley s saltvandsopløsning. Hver post viser en 5 sek sektion ca. 5 min efter starten af ​​optagelsen, herunder en 3 sek periode med sinusformet forskydning af sommall antal hår skakter. Den mekaniske stimulering blev gentaget hvert 30. sek hele kontinuerlig optagelse, som normalt varede i 1-2 timer. Brugerdefinerede script filer markeret enkelte begivenheder, der krydsede en tærskel, som de horisontale cursor (pigge), samt starten af ​​hver sinusformet cyklus (periode). (AIV) Det styresignal for sinusformet forskydning. (B) Analyse af Stimulus-fremkaldte Spiking aktivitet. (Bi-iii) Cycle histogrammer i 3 ° bins konstrueret ud fra neurogram prøver henholdsvis (Ai-iii), viser svarene fra formodede lancetformede endelser til mekanisk stimulering med 5 Hz sinusformet forskydning af hår skakter af et glas probe. Bemærk den markante fase-låsning, i forskellige faser af cyklussen, afhængig af deres position i forhold til udgangspositionen af ​​den mekaniske probe. (Biv) Normalized sonde forskydning sinusoid; den faktiske amplitude var ca. 1001,. M Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her, har vi udviklet et relativt simple metoder, der hurtigt kan dissekeres, har lav hårsækken tæthed og tillader relativt selektiv mekanisk stimulering af et lille antal hårsække. Det er let tilgængelige for elektrofysiologisk optagelse og live-cell fluorescerende billeddannelse, herunder svarene at farve program til at visualisere mekanisk stimuleret hårsækkene, dvs. imaging hårsække med definerede elektrofysiologiske svar. Mens vi ikke har gjort det, dette system synes også let modtagelige for sub-dividere sensoriske nerve til én enhed (enkelt sensorisk Axon) optagelse og brug af målrettet GFP-udtryk til visualisering sensoriske terminal slutter morfologi.

Vi har anvendt præparat ørehuden at undersøge egenskaberne ved internalisering og frigivelse af de fluorescerende membran styryl pridinium farvestoffer 7, en teknik oprindeligt udviklet til at studere lokaliseret vesicle membran genbrug i synaptiske terminaler 8. I synapser, er imaging også let kombineres med samtidig elektrofysiologiske optagelse af svarene på identificerede terminaler 8,9. Det var i disse tidlige undersøgelser, vi først bemærkede de farvestoffer blev også internaliseret af mechanosensory endelser 10. For sensoriske neuroner i kultur og i cochlea hårceller, meget af mærkningen ved styryl pyridinium farvestoffer synes at involvere farvestoffer passerer gennem mechanosensory kanaler, som de derefter blokerer 11,12. Farvestofferne derefter mærke intracellulære membraner, og dette mærkning er irreversibel. Men i hårceller, der ikke er mekanisk stimuleret 13,14 og i fuldt differentierede primære sensoriske nerveender i situ, såsom Ia slutninger i muskel spindler 15 og i de lancetformede slutninger her 7, mærkning styrylfarvestof synes at afspejle membran endocytose, da mærkning er reversibel og ikke blokere mechanosensory responses 7,15,16. Mens nogle farvestof internalisering af kanal gennemsivning i disse endelser ikke kan udelukkes helt ud, er det klart af den fortsatte affyring under farvestof inkubation og reversibilitet mærkningen, at det store flertal af mærkningen i differentierede terminaler i stedet er ved internalisering med genbrug vesikel membran. Således er denne simple teknik let anvendes til kombineret elektrisk og optisk overvågning af en række mechanosensory terminalfunktioner i ex vivo væv.

Som med de fleste praktiske teknikker, vil reproducerbarhed kræve gentagelser og praksis. vil nu blive beskrevet nogle af de centrale punkter værd særlig opmærksomhed. Hele dissektion og indspilningen, maksimere vævslevedygtighed og overlevelse ved at sikre fremstillingen konstant perfunderet med saltvand helt mættet med 95% O2 / 5% CO2. Sørg håret hårsække er ikke fortrængt under denne proces, which vil stimulere sensorisk slutning fyring. Enten bruge en kontinuerlig, laminar flow perfusion system eller forsigtigt boble gas gennem organbadet med fine rør i en afstand fra præparatet, eller forsigtigt opdatere løsninger hver 20-30 min, holde præparatet under saltopløsning overflade på alle tidspunkter. Suge registreringselektroder fremstilles ved at modificere skarpe elektrode borsilicat pipetter normalt anvendes til intracellulær optagelse. Først forsigtigt afbryde de skarpe tips med # 3 pincet til at give en passende indvendig diameter til at passe nerverne og brand-polish med meget kort (<1 sek) udsættelse for bunsenbrænder flamme (se 2.4 og 2.5). At få et godt signal-støj-forhold under optagelse, er det vigtigt, at den elektriske impedans (modstand) i disse to elektroder begge er maksimeret og lige. Gør dette ved at være opmærksom på følgende i de to elektroder. Til optagelsen elektrode, sikre den indvendige diameter er en stram pasning for nerve, og den maksimale længde af neRVE trækkes ind i optagelsen elektrode. Forsøger at bruge bindevævet omkring nerven til effektivt forsegle elektrodespidsen. Alternativt eller derudover, trækker den smalle ende af et passende dimensioneret, tilspidsede stykke fedtvæv i siden af ​​nerve. Derefter sætte elektroden spids ved at anvende en stærk sugning for ~ 1 min med en 50 ml sprøjte knyttet til slangen. For en godt forseglet spids, anvender stærk sugning vil simpelthen styrke effektiviteten af ​​stikket og vil ikke trække i mere flydende eller nerve. For at undgå nerveskader, dog sikre, at bindevævet er afbøde nerven fra kompression på det omgivende materiale og EAM brusk. Den indifferente elektrode skal efterligne modstand / impedans af optagelsen elektroden så tæt som muligt. Dette er hjulpet af omhyggeligt brand-polering spidsen til så lille en blænde som muligt, uden faktisk at forsegle den. Hvis der er behov for yderligere modstand, og sæt enden af ​​indifferente elektrode med adipoSE bindevæv, som beskrevet ovenfor for optagelsen elektrode.

Den elektrokeramiske giver udsøgt kontrol over mekanisk forskydning, både rumligt og tidsligt. Men passe gør elektriske forbindelser - høje temperaturer ødelægge dem, så du skal ikke bruge varmt loddetin. Brug metal-loaded epoxy lim, eller brug en specialist push-fit socket anbefalet af leverandøren. Dette vil både holde den fast og etablere elektrisk forbindelse. Fastgør glas stimulerende proben til elektrokeramiske med standard epoxyharpiks. Fire-polsk enden af ​​en standard 10 cm x 1,5 mm borsilikat diameter glas kapillar rør anvendes til fremstilling plaster eller skarpe elektroder til elektrofysiologiske optagelse for at minimere risikoen for vævsskader. Hvis enkelt hårsæk stimulation er nødvendig, for at brand-polere spidsen passe en enkelt hår, og placere sonden med en enkelt hår i det åbne blænde. Dette giver udsøgt kontrol over et enkelt hår. For styryl dye mærkning, er det generelt mere ensartet i væv fra yngre dyr. Det er ikke helt klart, hvorfor, men dette afspejler sandsynligvis mindre mekanisk traume og mere effektiv fjernelse dybe væv fra de yngre væv. Vær grundig i at fjerne skummende lag der ligner den ekspanderet polystyren overliggende hårsækken baser. Men undgå at blive for kraftig, da det risikerer at fjerne nerve plexus lag og tilhørende lancetformede terminaler. Hvis der er ringe eller ingen elektrisk respons på hårsækken bevægelse, og styrylfarvestof ansøgning fører til fremherskende mærkning af talgkirtler (gul / hvid), med tydelig autofluorescens af bunden af ​​hårskaftet snarere end lancetformede endelser (orange / gul), over-entusiastisk clearance har skadet de underliggende væv. Endelig giver et farvestof-chelateringsmiddel før billeddannelse forbedrer billedkontrasten og kvaliteten af ​​de endelige billeder.

Denne teknik kan være nyttig i en række yderligere undersøgelser. disse could indbefatter for eksempel screening for mechanosensory kanal (er) er ansvarlig for stræk-fremkaldte responser, ved at inkubere præparatet med farmakologiske ligander der er selektive for kandidat- kanaler eller screening muselinjer med sådanne kanaler genetisk slettet. Sidstnævnte kunne kombineres med fluorescens vurdering af eventuelle ændringer i terminal morfologi på grund af genmanipulation i muse linjer, fx med Npy2r-linked GFP udtryk 17. Et sidste eksempel kan være at undersøge betydningen af synaptiske-lignende vesikler (Slvs) 7 i disse lancetformede terminaler ved at undersøge virkningen af modulatorer af SLV omsætning (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat receptor ligander) i elastiske fremkaldte reaktioner og styrylfarvestofoptagelse /frigøre. Således er denne nye teknik åbner op for en række potentielt interessante muligheder for forskning i mechansensory neurovidenskab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14, (4), 300-309 (2009).
  2. Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
  3. Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407, (6807), 1007-1011 (2000).
  4. Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516, (7529), 121-125 (2014).
  5. Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449, (2), 103-119 (2002).
  6. Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
  7. Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591, (10), 2523-2540 (2013).
  8. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, (5041), 200-203 (1992).
  9. Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
  11. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  12. Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (1), 1 (2007).
  13. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  14. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20, (1), 41-50 (2004).
  15. Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562, (2), 381-394 (2005).
  16. Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21, (PC22), (2010).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, (7), 1615-1627 (2011).
Kombineret Registrering af mekanisk stimuleret Afferent Output og Nerve Terminal Mærkning i Mus hårsækken lancetformede Endings
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter