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Neuroscience

माउस बाल कूप भाले के आकार अंत में यंत्रवत् प्रेरित अभिवाही आउटपुट और तंत्रिका टर्मिनल लेबलिंग के संयुक्त रिकॉर्डिंग

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

एक उपन्यास विच्छेदन और रिकॉर्डिंग तकनीक निगरानी अभिवाही गोलीबारी माउस पंख में बाल के यांत्रिक विस्थापन द्वारा पैदा करने के लिए वर्णित है। तकनीक बहुत लागत प्रभावी और सामग्री आमतौर पर सबसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगशालाओं में पाया, या आसानी से खरीदी के साथ आसानी से किया जाता है। विच्छेदन मालिकाना सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित एक सामान्य Electroceramic वेफर द्वारा प्रदान की यांत्रिक विस्थापन के साथ, सरल और तेज है। एक ही सॉफ्टवेयर भी रिकॉर्ड और electroneurogram उत्पादन का विश्लेषण करती है। पैदा तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए एक वाणिज्यिक अंतर एम्पलीफायर आग पॉलिश मानक कांच microelectrodes से जुड़ा के माध्यम से है। उपयोगी टिप्स तैयारी, उत्तेजना और रिकॉर्डिंग की स्थिति रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता का अनुकूलन करने की गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए दिया जाता है। प्रणाली बालों के रोम के कटघरा अंत के भाले के आकार टर्मिनलों के electrophysiological और ऑप्टिकल गुण परख करने की क्रिया, के रूप में रूप में अच्छी तरह के लिए उपयुक्त हैउनके औषधीय और / या आनुवंशिक हेरफेर से परिणामों। यांत्रिक उत्तेजना और एक styryl pyridinium महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबलिंग के साथ बिजली की रिकॉर्डिंग के संयोजन का एक उदाहरण दिया जाता है।

Introduction

संवेदी axons की भाले के आकार टर्मिनलों innervating स्तनधारियों में बालों के रोम बाल शाफ्ट उपकला चारों ओर Palisades के रूप में। उनका उद्देश्य बाल वे चारों ओर के यांत्रिक विस्थापन का पता लगाने के लिए है। वे तेजी से और धीरे धीरे अंत है कि मुख्य रूप से बालों के आंदोलन के जवाब में गतिविधि की कमी फटने का उत्पादन ज्यादा अनुकूल ढालने का मिश्रण हैं। गतिविधि बहुत जल्दी खत्म होता है जब आंदोलन, बंद हो जाता है भी जारी रखा विस्थापन की उपस्थिति में। यहाँ हम संरचना के अध्ययन के लिए correlative इस murine पंख मॉडल के विकास का वर्णन है और भाले के आकार टर्मिनलों में कार्य करते हैं। पंख इन अंत के अध्ययन के लिए कई लाभप्रद विशेषताएं है। सबसे पहले, पंख के बीच रोम और टर्मिनलों के लिए उपयोग के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अनिवार्य रूप से त्वचा की दो परतों थोड़ा अन्य ऊतकों के साथ वापस करने के लिए वापस apposed है। त्वचा कठिन संयोजी ऊतक की न्यूनतम मात्रा के कारण बहुत पतली और आसानी से विच्छेदित है। इन्नेर्वतिओन आसानी से सुलभ और पहचाने जाने योग्य है। जबकि बाल folliclतों मौजूद हैं, वे अपेक्षाकृत कम वितरित कर रहे हैं, यंत्रवत् के रोम के व्यक्तिगत या छोटे समूहों की उत्तेजना की सुविधा। पतली अंतर्निहित त्वचीय परत औषधीय दवाओं और रंगों के साथ तंत्रिका टर्मिनलों के लिए अच्छी पहुंच देता है। इससे उन्हें विशेष रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग अध्ययन के लिए आदर्श बनाता है। इमेजिंग या तो हो सकता रहने वाले टर्मिनलों में, या निर्धारण और आगे ऊतकीय प्रसंस्करण के बाद।

Mechanosensory न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाएं innervating बालों के रोम पारंपरिक रूप से 1,2 दृढ़रोम कृंतक में अध्ययन किया गया है और, एक हद तक कम करने, पृथक त्वचा की तैयारी 3,4 में। ये हमारे बाल शाफ्ट के आसपास के तंत्रिका टर्मिनलों में mechanosensory शरीर क्रिया विज्ञान के सामान्य सिद्धांतों के बारे में बहुत कुछ सिखाया है। vibrissal तैयारी एक भी बाल कूप के आंदोलन पर उत्तम नियंत्रण की अनुमति देता है। हालांकि, यह इसकी जटिलता के कारण उत्पादन समझने के लिए vibrissal के रूप में मुश्किल हो सकता हैके रोम anatomically अलग mechanosensory समाप्त होने के 5 में से कम से कम 8 अलग अलग प्रकार के होते हैं और विशिष्ट electrophysiological उत्तर करने के लिए इन रूपात्मक प्रकार के मिलान अभी भी विवाद का विषय है। माउस त्वचा / saphenous तंत्रिका तैयारी सबसे अधिक बार स्पर्श और दर्द प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए अपने depilated राज्य में प्रयोग किया जाता है। इस तरह के एक तैयारी में बालों के रोम के इन्नेर्वतिओन कम जटिल है, लेकिन बालों के रोम के घनत्व, प्लस तीन अलग अलग प्रकार के कूप (गार्ड, सूआ / auchene और वक्र बाल) में इस तरह के करीब निकटता में 6 की उपस्थिति के विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने का मतलब एक भी कूप या समाप्त होने के एक प्रकार फिर से चुनौती दे रहा है। इसके अलावा, इस तैयारी के लिए एक जटिल विच्छेदन शामिल है। अंत में, दोनों vibrissal और अन्य त्वचा की तैयारी में, यह मुश्किल है, जबकि पूर्व vivo शामिल तैयारियों अभी भी जीवित हैं अंत कल्पना करने के लिए है। इस प्रकार, ऊतक सेक्शनिंग GFP व्यक्त माउस लाइनों में भी आवश्यक है। alternatively, यह इस तरह immunofluorescence के लिए निर्धारण और / या एंटीबॉडी ऊष्मायन के रूप में आगे ऊतकीय / प्रतिरक्षात्मक प्रसंस्करण की आवश्यकता है।

इसलिए हम पंख तैयारी विकसित की है और इसे इस्तेमाल बाल कूप afferents के एक प्रतिबंधित आबादी से बिजली रिकॉर्डिंग बनाने के लिए और पता चलता है कि झिल्ली साइकिल चालन इन भाले के आकार अंत, styryl pyridinium रंगों की तेज इसका सबूत में होता है। अंत में, हम पता चला है कि डाई यांत्रिक संवेदनशीलता के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, यह दर्शाता है कि यह mechanotransduction चैनलों ब्लॉक नहीं करता है। सरल उत्तेजना और विश्लेषण प्रोटोकॉल के परिणामों सचित्र हैं।

Protocol

माउस पोस्टमार्टम ऊतक फसल नैतिक तरीकों को मंजूरी दे दी उपयोग करना चाहिए। ब्रिटेन में, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था वयस्क चूहों (ब्रिटेन जानवरों में एक सूचीबद्ध अनुसूची 1 विधि (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम, 1986 और यूरोपीय निर्देशक 2010/63 / ईयू) के लिए एक सरकारी विधि को मंजूरी दी है। यह कानून पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा बोर्ड द्वारा एबरडीन विश्वविद्यालय है जो की समीक्षा की और निम्नलिखित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी पर स्थानीय स्तर पर लागू की जाती है।

नोट: इन विधियों अनुसंधान बैंकों एट अल में रिपोर्ट में इस्तेमाल किया गया 7।

1. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए तैयार कर रहा है कान

  1. विच्छेदन से पहले, इस तरह के Liley के (1956) के रूप में एक मानक शारीरिक खारा, तैयार करने और 90% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ यह तर। 3 NaHCO (12), KCl (4), के.एच. 2 पीओ 4 (1), सोडियम क्लोराइड (138.8), 2 MgCl (1), 2 CaCl (2) और ग्लूकोज: Liley खारा (मिमी) के शामिल है(1 1)।
  2. नम्रता से कान के पास खोपड़ी को नुकसान पहुँचाए बिना एक वयस्क माउस euthanize। यहाँ हम C57 / Bl6J और MF1 चूहों का उपयोग करें, लेकिन किसी भी मानक प्रयोगशाला माउस तनाव में इस्तेमाल किया जा सकता है। आदर्श रूप में, चूहों अगर बिजली की रिकॉर्डिंग, styryl डाई लेबलिंग के साथ जोड़ा जा करने के लिए बड़े चूहों में लेबलिंग के रूप में कम विश्वसनीय है कि 25 ग्राम हैं <उपयोग करते हैं, अक्सर ही प्रतिबंधित घिरा क्षेत्रों में पाया जा रहा है।
  3. बड़ी कैंची या हड्डी कैंची के साथ सिर निकालें।
  4. सिर पृष्ठीय पक्ष (50 सेमी आमतौर पर सुविधाजनक है) एक विस्तृत तली विच्छेदन डिश में मार डाला Liley में ऊपर रखें एक स्टीरियो विच्छेदन खुर्दबीन के मंच पर। नियमित रूप से (~ 10 मिनट) मोरी या मार डाला नमक के साथ सिर डूब।
  5. ध्यान से काटकर अलग कर देना और springbow कैंची और # 3 संदंश के साथ बाहरी कान (पंख) के आधार पर त्वचा को अलग, बाहरी कर्णद्वार (विदेश मंत्री) की उपास्थि उजागर। त्रिपृष्ठी की शाखाओं (जबड़े विभाजन, MDV) और महान auricular तंत्रिकाओं को पहचानें के रूप में वे एफ उभरनेROM उपास्थि आधार के माध्यम से जबड़े संयुक्त और परियोजना की फांक में खोपड़ी अवतल (पूर्वकाल) और उत्तल (पीछे) पंख त्वचा के पहलुओं अंदर आना करने के लिए, क्रमशः।
  6. खोपड़ी के पास, पहचान, जहां जबड़े और कर्णमूल प्रक्रिया के बीच नाली में दो तंत्रिका शाखाओं से बाहर निकलें। धीरे पंख खोपड़ी से दूर खींच कर उनकी लंबाई को अधिकतम और के रूप में संभव के रूप में खोपड़ी के करीब नसों में कटौती।
  7. springbow कैंची से सिर से पंख निकालें, ख्याल रख रही विभाजित नसों के बाहर का स्टंप से बचने के लिए और कान कि निकाल दिया जाता है के आधार पर घने ऊन की राशि कम से कम।
  8. एक लचीला सिलिकॉन रबर (PDMS) -lined मार डाला Liley के तरल पदार्थ से भरा डिश के लिए पंख स्थानांतरण। अपनी सबसेसंकरेमें (पूर्वकाल सबसे) बिंदु पर विभाजित करके विदेश मंत्री खोलें। ध्यान से ~ 6-8 नियमित रूप से स्थान दिया गया है बहुत ही सुन्दर (~ 0.2 मिमी व्यास) कीट पिन के साथ किनारों पर पंख, पूर्वकाल त्वचा (अवतल) PDMS करने के लिए नीचे की ओर है और पिन समतल।
  9. रेमपंख के पीछे पहलू की त्वचा पूरी तरह से ove और आंशिक रूप से # 3 संदंश के साथ कुंद विच्छेदन से पंख उपास्थि को हटाने, यह सुनिश्चित करना पूर्वकाल त्वचा बरकरार रह गया है।
  10. ठीक एक कीट पिन के बिंदु के साथ # 3 संदंश के साथ समझा, धीरे शाखाओं (आमतौर पर 2) MDV की है कि त्वचा और विदेश मंत्री उपास्थि के बीच पीछे उभरने का विस्तार। बेहतरीन संभव कीट पिन के साथ PDMS करने के लिए इन पिन, संयोजी ऊतक उनकी काट समाप्त होता है और न तंत्रिका चड्डी खुद को उससे सटे impaling।
  11. उन्हें आसपास के आसपास संयोजी ऊतक के सबसे निकालें, ध्यान से अतिरिक्त खींच या काटने से होने वाले नुकसान से बचने।

2. Electrophysiological रिकॉर्डिंग सेट अप

  1. किनारों के आसपास ठीक कीट पिन के साथ एक रिकॉर्डिंग कक्ष के PDMS लाइन आधार को पंख त्वचा पिन (~ कान प्रति 6-8), दो सक्शन इलेक्ट्रोड के पास कान के आधार पर साफ नसों रखने - (रिकॉर्डिंग के लिए एक करने के लिए तंत्रिका) और ओ.टी. लेने के लिएउसकी एक प्रति उदासीन इलेक्ट्रोड (एक अंतर एम्पलीफायर के लिए तटस्थ संकेत प्रदान करने के लिए, 7 देखें)।
  2. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए, ध्यान से एपर्चर और दो नसों के संयुक्त मोटाई के लिए खोलने के आंतरिक व्यास मैच, ताकि वे के रूप में आराम से फिट संभव के रूप में और संभव के रूप में के रूप में महान लंबाई के लिए।
  3. एक 2 मिलीलीटर सिलिकॉन रबर टयूबिंग के साथ दूसरे छोर से जुड़ी सिरिंज से कोमल चूषण द्वारा इलेक्ट्रोड में नसों ड्रा। सुनिश्चित करें नसों, सीधे नहीं मुड़ा हुआ या दोगुनी कर रहे हैं।
  4. मजबूत चूषण का उपयोग कर एक प्लग है कि कसकर तंत्रिका आसपास एपर्चर जवानों के लिए फार्म संयोजी ऊतक या एक वसा ऊतकों आकर्षित करने के द्वारा एक उच्च विद्युत प्रतिरोध / प्रतिबाधा फिट का विकास करना।
  5. सक्शन से नमक के साथ अन्य (उदासीन) इलेक्ट्रोड भरें यदि आवश्यक हो तो (यह केशिका क्रिया से भर सकते हैं)।
  6. समान रिकॉर्डिंग तारों (चांदी या प्लेटिनम) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के आंतरिक बोर में जगह खारा और तंत्रिका संपर्क करने के लिए(रिकॉर्डिंग) या संकुचित, आग पॉलिश अंत (उदासीन) इलेक्ट्रोड की। प्रत्येक इलेक्ट्रोड दो-कोर जांच की केबल के विभिन्न कोर करने के लिए व्यक्तिगत रूप से soldered है। स्नान (जमीन) इलेक्ट्रोड (एजी / AgCl गोली) स्नान में रखें, और दो मुख्य रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से जुड़े केबल की स्क्रीन करने के लिए यह जमीन।
  7. एक अंतर एम्पलीफायर, फिल्टर (बैंड पारित 0.2-2 किलोहर्ट्ज़), और दृश्य एक आस्टसीलस्कप स्क्रीन पर के अलग-अलग चैनलों में दो इलेक्ट्रोड से बिजली की गतिविधि फ़ीड। जाँच करें कि चैनल एक (रिकॉर्डिंग) और चैनल बी (उदासीन) बिजली के शोर के स्तर के समान लग रही है। इस स्तर पर यह संभव चैनल ए में सामान्य सहज कार्रवाई क्षमता को देखने के लिए पहले दो इलेक्ट्रोड संतुलित कर रहे हैं नहीं हो सकता।
  8. रिकॉर्डिंग (चैनल ए) या उदासीन (चैनल बी) इलेक्ट्रोड का मुक़ाबला में वृद्धि से इलेक्ट्रोड के बीच पृष्ठभूमि शोर में कोई मतभेद निवारण। areolar (वसा) संयोजी ऊतक या तो इलेक्ट्रोड में आगे चूसने से यह मत करो, और /या 50 मिलीलीटर सिरिंज पर अधिक से अधिक सक्शन ताकत लगाने।
    1. एक बार इस तरह से 'संतुलित', अंतर (एबी) रिकॉर्डिंग और पता लगाने में सहज कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) या जब पंख के मार्जिन पर बाल पथपाकर देखने के लिए वापस स्विच। कोई गतिविधि (spiking) में देखा जाता है, तो फिर से जाँच रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में तंत्रिका की तंग फिट और उदासीन इलेक्ट्रोड में areolar संयोजी ऊतक - आम तौर पर तंग (उच्च प्रतिरोध) मुहर और दो में और अधिक समान प्रतिबाधा इलेक्ट्रोड, बेहतर है। संकेत: शोर अनुपात: अभ्यास के साथ, यह एक अच्छी गुणवत्ता (1> 2) को प्राप्त होगा।
  9. एक प्रयोगशाला इंटरफेस और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक कंप्यूटर पर चल रहे सॉफ्टवेयर के माध्यम से electroneurogram रिकॉर्ड। spiking का एक ऑडियो आउटपुट बहुत उपयोगी है और एक ऑडियो एम्पलीफायर और संबद्ध ऑडियो स्पीकर के माध्यम से neurogram खिलाने से प्राप्त किया जा सकता है। सिर्फ आधारभूत शोर (सफेद-एन के अभाव द्वारा की पहचान से ऊपर होने की दहलीज को समायोजित करेंOise 'फुफकार')।
  10. (चित्रा 1 ए, बी दवा या भाले के आकार अंत करने के लिए फ्लोरोसेंट styryl डाई का उपयोग बढ़ाने के लिए, ध्यान से पंख मार्जिन के पास उप त्वचीय वसा की परत दूर छील, डर्मिस और रोम के आधार उजागर ~ 5 मिमी एक्स 5 मिमी की एक खिड़की खोलने के लिए )।
  11. (, खिड़की सिर्फ उत्पादन के स्तर पर यदि लागू हो) अग्रणी मार्जिन पर वसा को मंजूरी दे दी कान त्वचा की ~ 1 मिमी की एक गुना वापस पिन, apposed त्वचा की परतों के बीच एक स्पष्ट खारा से भरे खाई जा रही है। धीरे स्ट्रोक बाल, एक पिन या जमीन ठीक संदंश के साथ जोड़कर बढ़त के साथ फैला हुआ त्वचा को छूने के बिना, ऑडियो आउटपुट में आस्टसीलस्कप और विशिष्ट पर अधिक से अधिक एपी उत्पादन के क्षेत्र और 'चबूतरे' 'क्लिक' का पता लगाने के लिए।

3. रिकॉर्डिंग प्रोत्साहन पैदा कार्रवाई की क्षमता

  1. स्थिति यांत्रिक उत्तेजना जांच - एक आग पॉलिश 10 सेमी borosilicate microelectrode गिलास एक चीनी मिट्टी से जुड़ीग पीजो इलेक्ट्रिक actuator - तो आंदोलन त्वचा गुना के साथ समानांतर है। टिप गुना रखें त्वचा से 0.5-1 मिमी के बारे में है, तो यह बाल लेकिन त्वचा नहीं छू लेती है। धीरे-धीरे मैन्युअल जांच टिप चलती बाल से ध्यान हटाने और निरीक्षण / spiking को सुनने के लिए प्रभावी द्वारा उत्तेजना की जाँच करें।
  2. 1-3 बाल के यांत्रिक उत्तेजना ड्राइव करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (5 हर्ट्ज sinusoids पर जैसे 3 सेकंड, हर 10 सेकंड। जांच विस्थापन 200-500 माइक्रोन), और नसों में उत्तेजना पैदा की प्रतिक्रियाएं रिकॉर्ड है।
  3. 10 सेकंड के अंतराल पर कई समान यांत्रिक उत्तेजना गाड़ियों दीजिए। Repeatability के लिए जांच की स्थिति का अनुकूलन, तो प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (10 सेकंड के लिए 30 सेकंड से जैसे बूंद दोहराने की दर) के अनुसार उत्तेजना की आवृत्ति कम।
  4. एक साधारण दहलीज उच्च आवृत्ति शोर आयाम और सबसे बड़ा ए पी एस के ~ 25% 2x ~ करने के लिए सेट का उपयोग कर AP-तरह गतिविधि जैसे भेदभाव करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
  5. ए पी एस दहलीज पार करने के रूप में गणना'घटनाओं', आवृत्ति और उत्पादन प्राधिकृत व्यक्ति की विशेषताओं बढ़ाता।

4. रिकॉर्डिंग प्रोत्साहन पैदा फायरिंग एन (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4- (dibutylamino) styryl) Pyridinium Dibromide लेबलिंग के साथ संयुक्त

  1. प्रोत्साहन पैदा अभिवाही गोलीबारी और टर्मिनल लेबलिंग पर styryl रंगों के प्रभाव की जांच करने के लिए, स्नान समाधान करने के लिए, अपनी पसंद की एक styryl डाई की उचित एकाग्रता जोड़ने और बिजली रिकॉर्डिंग के साथ जारी है।
  2. आवश्यक जोखिम समय (आमतौर पर कम से कम 30 मिनट) के बाद, के रोम को देखने के लिए तैयार करने को तैयार है। बनाए रखने की पिन को हटाने के द्वारा त्वचा फ्लैप प्रकट करना, और मंजूरी दे दी त्वचीय क्षेत्र बेनकाब टर्मिनल लेबलिंग प्रकट करते हैं।
  3. डाई मुक्त खारा के साथ बाहरी डाई दूर धोने, खारा के 3 पूरा परिवर्तन कर रही है।
  4. 10-15 मिनट के लिए मार डाला डाई मुक्त खारा के अंतिम परिवर्तन में सेते सबसे लगातार डाई संदूषण से अवगत कराया / बाहरी झिल्ली से नमकीन पानी की अनुमति देने के लिए।
  5. गैर-भाँति डाई एक sequestering एजेंट (sulfobutylated बीटा-cyclodextrin, 1 मिमी, 5 मिनट) खारा में साथ झिल्ली पर शेष निकालें।
  6. एक ईमानदार epifluorescence खुर्दबीन के मंच पर रिकॉर्डिंग कक्ष स्थानांतरण और मंच / स्लाइड आंदोलन तंत्र के साथ चैम्बर संलग्न हैं।
  7. styryl डाई के लिए उत्तेजना प्रकाश उचित साथ तैयारी रोशन। कूप लेबलिंग (चित्रा 1) के निरीक्षण करने के लिए एक 10X या 25X प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी उद्देश्य का उपयोग करें।

Representative Results

Electrophysiological रिकॉर्डिंग व्यवस्था, उप त्वचीय वसा ऊतकों के साथ बालों के रोम को बेनकाब करने के लिए हटा दिया, चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। इस उजागर क्षेत्र के एक हिस्से चित्रा 1 बी में brightfield रोशनी में एक उच्च बढ़ाई दिखाया गया है। पंख मार्जिन और वापस पर ही इस क्षेत्र में तह एपिडर्मल सतह को उजागर करता है। इस क्षैतिज बहर करने के लिए, एक कुंद जांच (नहीं दिखाया गया है)। साथ यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक आदर्श स्थिति में चित्रा 1C से पता चलता है कि डाई जोखिम और फिर सामने आया स्थिति के लिए मार्जिन लौटने के बाद उत्तेजित के रोम गुना की बढ़त पर बाल पदों इस स्थिति में एक styryl pyridinium डाई के साथ चिह्नित किया गया है। तैयारी से Electroneurograms आम तौर पर भी फाइबर ग्लास जांच के लगाए गए आंदोलन, सबसे बड़े आकार के प्राधिकृत व्यक्ति को शामिल करने की अनुपस्थिति (2A चित्रा में चल रहे एपी गतिविधि दिखाने (चित्रा 2Bi III))। यह काफी repeatable है, हालांकि तरंग, जिस पर प्रतिक्रियाओं बंद कर रहे हैं के चरण के आंदोलन में जो बात है, उनकी स्थिति पर निर्भर करता है यानी हिल जांच यह संपर्कों बाल। एक साधारण सीमा का पता लगाने (क्षैतिज में neurogram निशान को पार लाइन (I-III)) इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर कार्यक्षमता अक्सर करने के लिए एक और अधिक परिष्कृत तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता हैकील आकार और आकार की सुविधाओं भेदभाव। यह तो इन विशेषताओं द्वारा विशेष अभिवाही फाइबर की प्रतिक्रियाओं को अलग छद्म एकल इकाई रिकॉर्डिंग विश्लेषण किए जाने की अनुमति देने के लिए कर सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। Electrophysiological रिकॉर्डिंग व्यवस्था और एन (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4- (dibutylamino) styryl) Pyridinium Dibromide बाल कूप अभिवाही भाले के आकार अंत की लेबलिंग (ए) एक पंख तैयारी को एक electrophysiological पंख दिखा प्रयोग के लिए सेट अभिविन्यास, नसों का स्थान, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और वसा ऊतकों को हटाने के बाद कूप तंत्रिका वितरण के उजागर क्षेत्र। (बी) के कई बालों के रोम क्षेत्र डर्मिस करने के लिए नीचे overlying वसा ऊतकों की मंजूरी दे दी में उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी में दिखाई दे रहे हैं। अंधेरा है, आमतौर पर bilobed, आकार वसामय ग्रंथियों रहे हैं। ( 7 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: (ए) उत्तेजना पैदा गतिविधि माउस पिन्ना से दर्ज की गई। (ऐ-III) उदाहरण, 3 अलग प्रयोगों से मानक Liley के नमकीन घोल में pinnae से निरंतर neurograms से गतिविधि का लिया। प्रत्येक रिकॉर्ड में एक 5 सेकंड खंड लगभग 5 के रूप में की sinusoidal विस्थापन का एक 3 सेकंड की अवधि सहित रिकॉर्डिंग की शुरुआत के बाद मिनट, पता चलता हैबाल शाफ्ट के मॉल संख्या। यांत्रिक उत्तेजना सतत रिकॉर्डिंग, जो आम तौर पर 1-2 घंटे के लिए चली भर में हर 30 सेकंड दोहराया गया था। कस्टम स्क्रिप्ट फ़ाइलें अलग-अलग घटनाओं है कि एक सीमा क्षैतिज कर्सर (spikes) द्वारा निर्धारित है, साथ ही प्रत्येक sinusoidal चक्र (अवधि) की शुरुआत के पार चिह्नित। (AIV) sinusoidal विस्थापन के लिए आदेश संकेत। (बी) के विश्लेषण से प्रेरणा पैदा spiking गतिविधि। (द्विपक्षीय iii) 3 ° डिब्बे में साइकिल histograms neurogram नमूने से निर्माण (ऐ-iii) क्रमश: एक गिलास जांच से बाल शाफ्ट के 5 हर्ट्ज sinusoidal विस्थापन से यांत्रिक उत्तेजना माना भाले के आकार अंत की प्रतिक्रियाओं दिखा। नोट चिह्नित चरण-लॉकिंग, चक्र के विभिन्न चरणों में, यांत्रिक जांच की शुरू करने की स्थिति में उनके सापेक्ष स्थिति पर निर्भर करता है। (BIV) सामान्यीकृत जांच विस्थापन sinusoid; वास्तविक आयाम लगभग 100 था1;। एम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम एक अपेक्षाकृत सरल तैयारी है कि तेजी से विच्छेदित किया जा सकता है विकसित किया है, कम बाल कूप घनत्व है और बालों के रोम की एक छोटी संख्या के अपेक्षाकृत चयनात्मक यांत्रिक उत्तेजना के लिए अनुमति देता है। यह electrophysiological रिकॉर्डिंग और प्रतिक्रियाओं यंत्रवत् प्रेरित बालों के रोम, परिभाषित electrophysiological प्रतिक्रियाओं के साथ यानी इमेजिंग के रोम कल्पना करने के लिए आवेदन डाई करने के लिए सहित रहते सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग, के लिए आसानी से सुलभ है। जब तक हम ऐसा नहीं किया है, इस प्रणाली को भी आसानी से एकल इकाई (एकल संवेदी अक्षतंतु) रिकॉर्डिंग के लिए संवेदी तंत्रिका उप-विभाजित और संवेदी टर्मिनल समाप्त होने आकृति विज्ञान visualizing के लिए लक्षित GFP-अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी है।

हम कान त्वचा की तैयारी का इस्तेमाल किया है internalization और फ्लोरोसेंट झिल्ली styryl pridinium रंगों 7 की रिहाई की विशेषताओं की जांच के लिए एक तकनीक मूल रूप से स्थानीय Vesic का अध्ययन करने के लिए विकसितsynaptic टर्मिनलों 8 में ले झिल्ली रीसाइक्लिंग। Synapses में, इमेजिंग भी आसानी से पहचान टर्मिनलों 8,9 में प्रतिक्रियाओं के एक साथ electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त है। यह इन प्रारंभिक अध्ययन है कि हम पहले उल्लेख किया रंजक भी mechanosensory अंत में 10 से भली भाँति थे में था। संस्कृति और कोक्लीअ बालों की कोशिकाओं में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए, styryl pyridinium रंगों से लेबलिंग की ज्यादा रंगों mechanosensory चैनल, जो वे तो 11,12 ब्लॉक के माध्यम से गुजर शामिल करने लगता है। रंगों तो intracellular झिल्ली लेबल, और इस लेबलिंग अपरिवर्तनीय है। हालांकि, बालों की कोशिकाओं में यंत्रवत् 13,14 प्रेरित नहीं कर रहे हैं कि इस तरह के और मांसपेशियों स्पिंडल 15 में आइए अंत के रूप में सीटू पूरी तरह से अलग-अलग प्राथमिक संवेदी तंत्रिका टर्मिनलों, और भाले के आकार अंत यहाँ 7 में, में styryl डाई लेबलिंग झिल्ली endocytosis प्रतिबिंबित करने के लिए लगता है, के बाद से लेबलिंग प्रतिवर्ती है और mechanosensory res ब्लॉक नहीं करता7,15,16 ponses। इन अंत में चैनल पारगमन द्वारा कुछ डाई internalization पूरी तरह से इंकार नहीं किया जा सकता है, यह डाई ऊष्मायन के दौरान जारी गोलीबारी और लेबलिंग के उलटने से स्पष्ट है कि बगल में विभेदित टर्मिनलों में लेबलिंग के महान बहुमत रीसाइक्लिंग पुटिका के साथ internalization के द्वारा होता है झिल्ली। इस प्रकार, इस सरल तकनीक आसानी से पूर्व vivo ऊतकों में mechanosensory टर्मिनल कार्यों की एक श्रृंखला के संयुक्त बिजली और ऑप्टिकल निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है।

सबसे व्यावहारिक तकनीकों के साथ के रूप में, reproducibility पुनरावृत्ति और अभ्यास की आवश्यकता होगी। मुख्य बिंदुओं में से कुछ के लायक विशेष ध्यान अब वर्णित किया जाएगा। विच्छेदन और रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान यह सुनिश्चित करने की तैयारी लगातार खारा पूरी तरह से 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ संतृप्त साथ भरकर रखा जाता है के द्वारा ऊतक व्यवहार्यता और अस्तित्व को अधिकतम। बालों के रोम इस प्रक्रिया के दौरान विस्थापित नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें, कआईसीएच संवेदी समाप्त गोलीबारी को प्रोत्साहित करेंगे। या तो तैयारी से थोड़ी दूरी पर एक सतत, लामिना का प्रवाह छिड़काव प्रणाली, या ध्यान बुलबुला गैस ठीक टयूबिंग के साथ अंग स्नान के माध्यम से उपयोग करें, या ध्यान से समाधान हर 20-30 मिनट ताज़ा, हर समय खारा सतह के नीचे तैयारी रखे हुए हैं। सक्शन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तेज इलेक्ट्रोड borosilicate pipettes सामान्य रूप से intracellular रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया संशोधित करके बनाया जाता है। सबसे पहले, ध्यान से बंद तेज युक्तियाँ # के साथ 3 संदंश तोड़ने बहुत संक्षिप्त (<1 सेकंड) लेम्प बर्नर लौ के लिए जोखिम के नसों और आग पॉलिश फिट करने के लिए उचित आंतरिक व्यास देने के लिए (2.4 और 2.5 देखें)। एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात जब रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, यह है कि विद्युत प्रतिबाधा (प्रतिरोध) इन दो इलेक्ट्रोड में दोनों को बड़ा किया और बराबर है आवश्यक है। दो इलेक्ट्रोड में निम्नलिखित पर ध्यान देकर यह मत करो। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए, यह सुनिश्चित आंतरिक व्यास तंत्रिका के लिए एक सुखद फिट, और पूर्वोत्तर की अधिकतम लंबाई हैRVE रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में तैयार की है। तंत्रिका आसपास संयोजी ऊतक का उपयोग करने के लिए प्रभावी ढंग से इलेक्ट्रोड टिप सील करने के लिए प्रयास करें। वैकल्पिक रूप से, या इसके अतिरिक्त, एक उपयुक्त आकार, वसा ऊतकों का पतला टुकड़ा की संकीर्ण अंत तंत्रिका साथ में आकर्षित। फिर, एक 50 मिलीलीटर ट्यूबिंग से जुड़ी सिरिंज के साथ ~ 1 मिनट के लिए मजबूत चूषण लगाने से इलेक्ट्रोड टिप प्लग। एक अच्छी तरह से सील टिप के लिए, मजबूत चूषण लागू करने के लिए बस प्लग की प्रभावशीलता को मजबूत करेगा और अधिक तरल या तंत्रिका में आकर्षित नहीं होंगे। तंत्रिका क्षति से बचने के लिए, तथापि, यह सुनिश्चित करें कि संयोजी ऊतक आसपास सामग्री और विदेश मंत्री कार्टिलेज पर संपीड़न से तंत्रिका cushioning है। उदासीन इलेक्ट्रोड के रूप में संभव के रूप में बारीकी से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का प्रतिरोध / प्रतिबाधा की नकल करना चाहिए। यह सावधानी से आग चमकाने वास्तव में इसे सील बिना संभव के रूप में छोटे रूप में एक छेद करने के लिए टिप से मदद की है। आगे प्रतिरोध की जरूरत है, तो adipo साथ उदासीन इलेक्ट्रोड के अंत प्लगएसई संयोजी ऊतक, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए ऊपर वर्णित के रूप में।

Electroceramic यांत्रिक विस्थापन के ऊपर उत्तम नियंत्रण, दोनों स्थानिक और अस्थायी देता है। हालांकि, बिजली के कनेक्शन बनाने देखभाल - उच्च तापमान उन्हें नष्ट कर, इतना गर्म मिलाप का उपयोग नहीं करते। धातु भरी हुई epoxy गोंद का प्रयोग करें, या एक विशेषज्ञ धक्का-फिट सॉकेट आपूर्तिकर्ता द्वारा सिफारिश का उपयोग करें। यह दोनों इसे मजबूती से पकड़ और बिजली कनेक्टिविटी स्थापित करेगा। मानक epoxy राल के साथ Electroceramic करने के लिए कांच उत्तेजक जांच संलग्न। आग पॉलिश एक मानक 10 सेमी के अंत x 1.5 मिमी व्यास borosilicate ग्लास केशिका ऊतकों को नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए पैच या तेज इलेक्ट्रोड बनाने के लिए इस्तेमाल ट्यूबिंग। एकल बाल कूप उत्तेजना की आवश्यकता है, आग पॉलिश टिप एक भी बाल फिट है, और एक भी बाल खुले एपर्चर के अंदर के साथ जांच की स्थिति है। यह एक एकल बालों पर उत्तम नियंत्रण देता है। styryl DY के लिएई लेबलिंग, यह छोटे जानवरों से ऊतकों में आम तौर पर अधिक समान है। यह पूरी तरह स्पष्ट क्यों नहीं है, लेकिन इस संभावना कम उम्र के ऊतकों से कम यांत्रिक आघात और अधिक प्रभावी गहरी ऊतक हटाने को दर्शाता है। झागदार परत मिलते-जुलते विस्तार polystyrene बाल कूप ठिकानों overlying को दूर करने में पूरी तरह से। हालांकि, बहुत जोरदार जा रहा से बचने के रूप में इस तंत्रिका जाल परत और संबद्ध भाले के आकार टर्मिनलों को हटाने के जोखिम। अगर वहाँ बाल कूप आंदोलन करने के लिए बहुत कम या कोई बिजली प्रतिक्रिया, और styryl डाई आवेदन पत्र है, वसामय ग्रंथियों (पीला / सफेद) के प्रमुख लेबलिंग के लिए होता है न कि भाले के आकार अंत से बाल शाफ्ट के आधार के अलग autofluorescence (नारंगी / पीले) के साथ, ओवर-उत्साही निकासी के अंतर्निहित ऊतकों क्षतिग्रस्त हो गया है। अंत में, इमेजिंग से पहले एक डाई-chelating एजेंट का उपयोग बहुत छवि के विपरीत और अंतिम छवियों की गुणवत्ता में सुधार।

इस तकनीक को आगे की पढ़ाई की एक श्रृंखला में उपयोगी हो सकता है। ये सहULD उदाहरण के लिए, शामिल हैं, mechanosensory चैनल (एस) खिंचाव पैदा प्रतिक्रियाओं के लिए जिम्मेदार के लिए स्क्रीनिंग, उम्मीदवार चैनलों के लिए चयनात्मक औषधीय ligands के साथ तैयारी incubating या इस तरह के चैनलों आनुवंशिक रूप से नष्ट कर दिया साथ माउस लाइनों स्क्रीनिंग द्वारा। उत्तरार्द्ध माउस लाइनों, Npy2r से जुड़े GFP अभिव्यक्ति 17 के साथ जैसे आनुवंशिक हेरफेर के कारण टर्मिनल आकृति विज्ञान में किसी भी बदलाव के प्रतिदीप्ति आकलन के साथ जोड़ा जा सकता है। एक अंतिम उदाहरण एसएलवी कारोबार का modulators के प्रभाव का परीक्षण करके (SLVs) इन भाले के आकार टर्मिनलों में synaptic-तरह पुटिकाओं की भूमिका की जांच कर 7 हो सकता है (सीए, मिलीग्राम, latrotoxin, ग्लूटामेट रिसेप्टर ligands) खिंचाव पैदा प्रतिक्रियाओं और styryl डाई तेज पर / रिलीज। इस प्रकार, इस नई तकनीक mechansensory तंत्रिका विज्ञान में अनुसंधान के संभावित दिलचस्प रास्ते की एक श्रृंखला को खोलता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

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References

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माउस बाल कूप भाले के आकार अंत में यंत्रवत् प्रेरित अभिवाही आउटपुट और तंत्रिका टर्मिनल लेबलिंग के संयुक्त रिकॉर्डिंग
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Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

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