Abstract
Her udviser vi en simpel metode til hurtig produktion af størrelse kan styres, monodisperse, W / O mikrodråber under anvendelse af en kapillær-baserede centrifugal mikrofluidapparatet. W / O mikrodråber er for nylig blevet anvendt i kraftfulde metoder, der muliggør miniaturiserede kemiske eksperimenter. Derfor udvikle en alsidig metode til opnåelse monodisperse W / O mikrodråber er nødvendig. Vi har udviklet en fremgangsmåde til frembringelse monodisperse W / O mikrodråber baseret på en kapillær-baserede centrifugal aksesymmetrisk co-strømmende mikrofluidapparatet. Det lykkedes at styre størrelsen af mikrodråber ved at justere den kapillære åbning. Vores fremgangsmåde kræver udstyr, der er lettere at bruge end med andre mikrofluide teknikker, kræver kun et lille volumen (0,1-1 pi) af prøveopløsningen til indkapsling, og muliggør fremstillingen af hundreder af tusinder antal af W / O mikrodråber i sekundet . Vi forventer, at denne metode vil hjælpe biologiske undersøgelser, der kræver dyrebare biologiske spler ved at bevare mængden af prøverne for hurtig kvantitativ analyse biokemiske og biologiske undersøgelser.
Introduction
W / O mikrodråber 1-5 har mange vigtige applikationer til studiet af biokemi og bioteknologi, herunder proteinsyntese 6, protein krystallisering 7, emulsion PCR 8,9, celle indkapsling 10, og konstruktion af kunstige celle-lignende systemer 5,6. At producere W / O mikrodråber til disse applikationer, vigtige kriterier er kontrollen med størrelse og monodispersibility af W / O mikrodråber. Mikrofluidenheder for at gøre monodisperse, størrelse-kontrollerbar W / O mikrodråber 11 er baseret på co-strømmende metode 12,13, flow-fokusering metode 14,15, og T-krydset metode 16 i mikrokanaler. Selv om disse metoder producere meget monodisperse W / O mikrodråber, den mikrofabrikation kræver kompliceret håndtering og specialiserede teknikker til fremstilling af mikrokanaler, og kræver også en stor mængde af prøveopløsningen (mindst flere hundrede81; l) på grund af den uundgåelige døde volumen i sprøjten pumper og rør, der udfører prøveopløsningen til mikrokanalerne. Således en nem at bruge og lave rest-volumen metode generere monodisperse W / O mikrodråber er nødvendig.
Dette papir, sammen med videoer af eksperimentelle fremgangsmåder, beskriver en centrifugal kapillær-baserede aksesymmetrisk co-strømmende mikrofluidanordning 17 til frembringelse celle-sized, monodisperse W / O mikrodråber (figur 1). Denne simple metode opnår størrelse monodispersitet og størrelse styrbarhed. Det kræver blot en bordplade mini-centrifuge og en kapillær-baserede aksesymmetrisk co-strømmende mikrofluidanordning fastgjort i en prøveudtagning mikrorør. Vores metode behøver kun et meget lille volumen (0,1 pi), og spilder ikke nogen væsentlig volumen af prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af en Kapillær-baserede mikrofluidapparat
- Opsætning af indehaverne
Bemærk: Holderen design er præsenteret i figur 2A.- Skåret ud hver af de fire skiver af holderne (Figur 2A (i) - (iv)) ud fra 2 mm tyk polyacetal plastplade under anvendelse af en fræsemaskine. Brug følgende dimensioner for hver af de fire skiver af indehaveren: (i) skive en diameter på 8,5 mm, kapillær hul (CH) diameter 1.3 mm, skrue hul (SH) i diameter 1,8 mm; (Ii) skive 2 diameter 8,7 mm, CH diameter 2,0 mm, SH diameter 1,8 mm; (Iii) skive 3 diameter 8,7 mm, CH diameter 0,5 mm, SH diameter 1,8 mm; og (iv) skive 4 diameter 9,1 mm, CH diameter 1,0 mm, SH diameter 1,8 mm.
- Saml indehaverne bruger M2 × 40 skruer (Figur 2B). En nederste del af holderen (figur 2B) består af skiven 1, og skiven 2 i figur 2A (i), (ii) og en øvre del (figure 2B) af holderen består af skiven 3 og skiven 4 i figur 2A (iii), (iv).
- For at konstruere den nederste del af holderen, før skruen i tre SH af hver skive en og 2. Afkort skruerne ved nipper off et stykke af tråden del. Holde længden af skruen ved 0,9 cm (samme længde som den nederste del af holderen).
- For at konstruere den øverste del af holderen, indsætte skruer ind i de to SH af hver skive 3 og 4. Afkort skruerne ved nipper off et stykke af tråden del. Holde længden af skruen ved 0,7 cm (samme længde som den øvre del af holderen).
- For at samle holderen, slutte sig til de nederste og øverste dele af indehaverens ved hjælp af en lang skrue.
Bemærk: Hold længden af den enkelte del af holderen eksakt: den nederste del er 0,9 cm; den øverste del er 0,7 cm (figur 2B).
- Fremstilling af glas kapillærer
- Brug to typer glaskapillarer: en indre glaskapillær (Udvendig diameter (OD) / Indvendig diameter (ID): 1,0 / 0,6 mm) og en ydre glaskapillær (OD / ID: 2.0 / 1.12 mm).
- Brug et glas cutter at opdele det ydre glas kapillar i tre lige store dele, og derefter bruge glas cutter til at opdele det indre glas kapillar i to lige store stykker.
- Skærpe hver opdelt indre og ydre glaskapillarer bruger glaskapillar aftrækker (figur 3A). Indstil vægten af aftrækker ved max. Sæt varmen niveau aftrækker ved 60 grader for den ydre glas kapillarrør og 70 grader for den indre kapillær. skærpe forsigtigt glasset kapillar.
- Holde længden af spidsen i den indsnævrede del af glaskapillar: den indre kapillar er 1,5-1,8 cm; den ydre kapillar er 0,8-1,0 cm (figur 3C). Hvis denne længde er kortere eller længere end den beskrevne længde, skal du justere varmen niveau aftrækker.
- Fix den indre eller ydre glaskapillarer til microforge stå under anvendelse tape (figur 3B).
- Afbrød spidsen af glaskapillar ved brug af microforge i tre trin (figur 3B): (i) rører spidsen af glaskapillar til glasperlerne på en platintråd, (ii) opvarme platintråden ved at træde på en fod skifte i 1-2 sek, og (iii) efter 1-2 sek, afbrød spidsen af glaskapillar ved afkøling af platin wire.
- Juster diametrene af den indre (d i) og ydre (d o) kapillaråbninger, henholdsvis. Diameteren åbning af den indre glaskapillar er 5, 10, og 20 um (d i = 5,10, 20 um) og den ydre glaskapillar (d o) er 60 um (d o = 60 um) i dette eksperiment.
Bemærk: Glasset kapillar er til engangsbrug. Gentag fremstillingen af glasset kapillarerne.
- Juster diametrene af den indre (d i) og ydre (d o) kapillaråbninger, henholdsvis. Diameteren åbning af den indre glaskapillar er 5, 10, og 20 um (d i = 5,10, 20 um) og den ydre glaskapillar (d o) er 60 um (d o = 60 um) i dette eksperiment.
2. Procedure til generering W / O Mikrodråber
- Fyld en ydre glas kapillarrør med olie indeholdende overfladeaktivt middel. Blandingen af olie og overfladeaktivt middel er hexadecan indeholdende 2% (vægt / vægt) sorbitanmonooleat i dette eksperiment (figur 4A).
Bemærk: Der er mange kombinationer af olier og overfladeaktive midler (f.eks kan olier være fluoreret eller kulsyreholdige; overfladeaktive midler kan være ioniske, ikke-ioniske eller fluorkemisk).- Der udtages 10 pi hexadecan indeholdende sorbitanmonooleat i et ydre glas kapillarrør. I figur 4A er diameteren åbning af den ydre glaskapillar (d o) er 60 um (d o = 60 um). For at justere åbningen af glas kapillar, vende tilbage til trin 1.2.4-1.2.5.
- Indstil den ydre kapillar i bunddelen af holderen (figur 4B).
- Draw ca. 0,1 pi af en vandig opløsning i et indre glaskapillær (figur 4C) ved kapillærvirkning. I figur 4C er diameteren åbning af indre glaskapillar (d i) er 10 um (d i = 10 um). For at justere åbningen af glasset kapillar, vende tilbage til trin 1.2.4-1.2.5.
- Indstil den indre kapillar i den øverste del af holderen (figur 4D-a). Indsæt den indre kapillar ind i den ydre kapillar (figur 4D-a). Ser man på den hvide prik cirkel som i figur 4D-a, observere positionen af den indre kapillar inden i det ydre kapillar (indre diameter af den ydre kapillar (w) = 130 um) (figur 4D-b, c) med et digitalt mikroskop . Positionen af den indre kapillar i den ydre kapillar skal indstilles til w = 100-150 um.
Bemærk: For at ændre placeringen af den indrekapillær i den ydre kapillar, så dreje skruen i den øverste del af holderen. Derved kan afstanden w styres præcist. - Indføre 100 pi hexadecan indeholdende sorbitanmonooleat (2% vægt / vægt) i bunden af en 1,5 ml prøve mikrorør. Installation af holderen med de indre og ydre kapillærer i prøven mikrorør (Figur 4E-a). Sørg for at tjekke den ydre kapillar at holde det væk fra luft-olie-interface (Figur 4E-b).
- Centrifuger prøven mikrorør anvendelse af en bordplade svingende-out-typen mini-centrifuge ved en massefylde på 1.600 xg i 1-2 sek at generere mikrodråber (Figur 4F). Udfør alle forsøg på RT.
Bemærk: Brug en svingende-out-typen centrifuge. En lille dråbe kan kollidere med en sidevæg af prøven mikrorør og desintegrere, når der anvendes en fast vinkel-centrifuge. - Træk langsomt op W / O dråber med pipette, og derefter, læg dem på et glas sLiDE.
- Tag billeder af mikrodråberne dannes ved anvendelse af en digital mikroskop (forstørrelse, 200X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse præsenteres en simpel metode til generering af celle- størrelse W / O mikrodråber under anvendelse af en kapillær-baserede centrifugal mikrofluidanordning (figur 1). Den mikro indretning var sammensat af et kapillært holder (figur 2B), to glaskapillarer (indre og ydre glaskapillarer i figur 3C) og en mikrorør indeholdende en olie, herunder overfladeaktivt middel. Vi injicerede 0,1 pi prøveopløsning i den indre glaskapillar og placeret den indre glaskapillar ind i det ydre glaskapillar (figur 4D). Celle-sized W / O mikrodråber blev genereret ved Plateau-Rayleigh ustabilitet af en jetting-strømning af prøveopløsning 17 (figur 1B) og var stabil i mindst 2 timer 17.
Typiske eksempler på de forskellige størrelser af W / O mikrodråber genereret fra kapillarrøret-based centrifugal mikrofluidanordning er vist i figur 5. Figur 5A-F viser de digitale mikroskopi billeder og størrelsesfordeling histogrammer (n = 200) af W / O mikrodråber. Vand / olie mikrodråber blev dannet ved anvendelse en indre kapillar med en d i = 5 (A, B), 10 (C, D), eller 20 um (E, F) diameter åbning samtidig holde d o og w konstant ved 60 pm og 115 um, henholdsvis. Målingerne af størrelsen af de genererede W / O mikrodråber blev erhvervet ved analyse af mikroskopet opnåede billede. For d i = 5, 10 og 20 um åbninger, de gennemsnitlige diametre af mikrodråberne var 8,3 um (standardafvigelse (SD) 0,9 um, variationskoefficient (CV) 10,8%), 12,7 um (SD 1.1 um, CV 8,6%), og 17,9 um (SD 1.4 um, CV 7,8%), henholdsvis. Disse resultater viser, at vi med succes opnået monodispers W / O microdroplets ved den foreslåede metode. Endvidere W / O mikrodråber diametre var næsten den samme som den indre kapillar åbning (figur 5G). Således kan den gennemsnitlige størrelse af W / O mikrodråber let indstilles over et bredt område, typisk 5 til 20 um, med micro enhed.
Figur 1. Oversigt over centrifugal kapillær-baserede aksesymmetrisk co-strømmende mikrofluid anordning og dannelse af W / O mikrodråber bruger enheden. (A) Illustration af centrifugalkraften kapillær-baserede aksesymmetrisk co-strømmende mikrofluidanordning og proces genererer W / O mikrodråber ( indenfor cirkel), (B) W / O mikrodråber genereret af Plateau-Rayleigh ustabilitet af et jetting strøm af vandig opløsning 17, d i er åbningsdiameter af indre glas kapillarrør, d oer diameter åbning af indre glas kapillar, w er indvendig diameter af den ydre kapillar, (C) Fotografi af fabrikeret enhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Opsætning af kapillær holder (A) Design af kapillære indehaver lavet af polyacetal plast:. Enheden for diametre i holderen er mm. (B) Fotografier af indehaveren består af en øvre del og en nedre del. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. rutediagram for mikrofluidapparatet opsætning og generering af W / O mikrodråber. (A) Fremstilling af ydre kapillar. Olie med overfladeaktive indført i det ydre kapillar, (B) Udvendig kapillar sat i den nederste del af holderen, (C) Fremstilling af den indre kapillar: Vandig opløsning drAWN i en indre kapillar ved kapillaritet, (D) Indre kapillar sat ind i den øvre del af holderen (a). Kontrollere, at den indre kapillar var i den ydre kapillar med et digitalt mikroskop (b, c), (E) Holder med indre og ydre kapillærer installeret i prøverøret (a). Kontrol, at den ydre kapillar blev holdt væk fra luft-olie-interface, (F) Endelig blev prøven mikrorør centrifugeres ved en bordplade svingende-out-typen mini-centrifuge. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Dannelse af monodisperse celle størrelse W / O mikrodråber. Digital mikroskop billeder og størrelsesfordeling histogrammer (n = 200) af genererede mikrodråber hjælp kapillærer af forskellige diameter, d i = 5 (A, B), 10 (C, D), og 20 um (E, F), (G) Korrelation mellem diameteren åbning af glasset kapillar og diameteren af de genererede W / O mikrodråber . Fejl søjler viser standardafvigelser af diameteren af de genererede W / O mikrodråber. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af denne enhed, den monodisperse W / O mikrodråber blev genereret af Plateau-Rayleigh ustabilitet af en jet-flow 17. Mikroskopisk undersøgelse afslørede ikke tilstedeværelsen af satellit dråber. Ved fremstilling af indretningen, tre kritiske trin er afgørende for en vellykket generere monodisperse W / O mikrodråber. Første, at levere en lige strøm af olie indeholdende overfladeaktivt middel og vandig opløsning, skal de kapillære huller af fire diske være anbragt i et koncentrisk mønster. For det andet blev den indre kapillar forsigtigt indsat i den ydre kapillar fordi spidsen af kapillaret knækker let, hvis den kommer i kontakt den øvre holder. Denne operation kan være svært, så vi anbefaler at bruge en lup. Endelig er det for at gøre en jetting-strøm af vandig opløsning 17, positionen af den indre kapillar ind i den ydre kapillar skal indstilles til w = 100-150 um. Hvis størrelsesfordelingen af W / O mikrodråber dannes ved centrifugal microfluidic enhed ikke monodispers, kontrollere placeringen af den indre kapillar i den ydre kapillar. At ændre placeringen af den indre kapillar i den ydre kapillar, så dreje skruen i den øverste del af holderen. Derved kan afstanden w styres præcist.
For at gøre monodisperse W / O mikrodråber, der er nuværende begrænsninger. Der er vanskeligheder i at øge centrifugal sats (om nødvendigt), fordi alle Forsøgene i undersøgelsen blev udført ved den maksimale centrifugal sats af skrivebordet centrifuge. Derudover droplet generation er vanskelig fra en række forskellige prøveopløsninger, begrænsningen er afhængig af centrifuge design. Multi riflede kapillærer som den indre kapillar kan give de indkapslede mikrodråber fra forskellige kombinationer af materialer og løsninger 18.
Den mikrofluid Enheden har to primære fordele i forhold til konventionelle mikrokanalplader metoder: i) easy og robust fabrikation, og ii) kravet i kun et lille volumen (0,1 pi) af prøveopløsningen. Først fremstillingen af kapillær-baserede centrifugal aksesymmetrisk co-strømmende mikrofluidanordning er enkel og robust. Kun tynde kapillærer, et kapillært holderen, og en prøve mikrorør er nødvendige. Fremstillingen tid er 5-10 min for enheden. Fabrikation af indretningen tager mindre tid i forhold til fremstillingen af andre mikrofluidapparatet. Desuden holder kapillarrøret er robust og kan genbruges. Derfor er de eneste forbrugsstoffer er glas kapillærer og prøve mikrorør i enheden, hvilket gør det billigere end andre mikrofluide systemer. Endelig da olie- og vandige strømme blev produceret ved centrifugalkraft, der var ingen spildt volumen. I 1-2 sek, indretningen genererer et stort antal mikrodråber.
Mikrodråber er ideelle kandidater til at udføre high-throughput forsøg med små mængder af prøven opklaringn. Med denne indretning er det teoretisk muligt at generere hundredtusindvis af 10-um-størrelse mikrodråber i sekundet fra 0,1 pi af prøveopløsningen. Således indretningen rumme arbejde med ædle biologiske prøver ved at minimere volumenet af de fornødne prøver til hurtig kvantitativ analyse. Denne enhed kan bruges til at analysere biokemiske reaktioner 6-9 og encellede enzymatiske reaktioner 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
- Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
- Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
- Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
- Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
- Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
- Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
- Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
- He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
- Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502 (2007).
- Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
- Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
- Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
- Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).
