Abstract
Ici, nous démontrons une méthode simple pour la production rapide de,, W microgouttelettes / S monodisperses taille contrôlable à l'aide d'un dispositif microfluidique centrifuge basé capillaire. microgouttelettes W / S ont été récemment utilisé dans des méthodes puissantes qui permettent miniaturisés expériences chimiques. Par conséquent, le développement d'une méthode polyvalente pour obtenir monodisperse W / O microgouttelettes est nécessaire. Nous avons développé un procédé pour produire des micro-gouttelettes monodispersées W / O en fonction d'un dispositif de co centrifuge à écoulement capillaire à base de révolution microfluidique. Nous avons réussi à contrôler la taille des micro-gouttelettes en ajustant l'orifice capillaire. Notre méthode nécessite un équipement qui est plus facile à utiliser que d'autres techniques microfluidiques, nécessite seulement un petit volume (0,1-1 pi) de la solution de l'échantillon pour l'encapsulation, et permet la production de centaines de milliers nombre de W microgouttelettes d'E / S par seconde . Nous prévoyons que cette méthode aidera études biologiques qui nécessitent s biologique précieuxDes exemples de conservation du volume des échantillons pour l'analyse biochimique rapide et quantitative des études biologiques.
Introduction
W / O microgouttelettes 1-5 avoir de nombreuses applications importantes pour l'étude de la biochimie et de la bioingénierie, y compris la synthèse des protéines 6, la cristallisation des protéines 7, émulsion PCR 8,9, encapsulation de cellules 10, et la construction de systèmes analogues à des cellules artificielles 5,6. Pour produire des microgouttelettes W / S pour ces applications, les critères importants sont le contrôle de la taille et monodispersibility des microgouttelettes W / O. Dispositifs microfluidiques pour faire monodisperse, taille-réglable W / O microgouttelettes 11 sont basées sur la méthode de co-écoulement 12,13, méthode des flux de focalisation 14,15, et la méthode T-jonction 16 dans des microcanaux. Bien que ces méthodes produisent des microgouttelettes E / H très monodisperses, le processus de microfabrication nécessite une manipulation compliquée et techniques spécialisées pour la préparation de microcanaux, et nécessite aussi une grande quantité de la solution échantillon (au moins plusieurs centaines de81; l) en raison du volume mort inévitable dans les pompes à seringues et des tubes qui conduisent la solution d'échantillon à microcanaux. Ainsi, une méthode facile à utiliser et à faible volume mort de générer monodisperse W / O microgouttelettes est nécessaire.
Ce document, ainsi que des vidéos de procédures expérimentales, décrit une révolution dispositif centrifuge basé capillaire co écoulement microfluidique 17 pour générer des cellules de taille, monodisperse W / O microgouttelettes (figure 1). Cette méthode simple permet d'obtenir monodispersité de taille et de taille contrôlabilité. Il faut juste une table mini-centrifugeuse et une révolution dispositif microfluidique de co-circulant base capillaire fixe dans un microtube d'échantillonnage. Notre méthode n'a besoin que d'un très petit volume (0,1 pi), et ne perd pas une quantité importante de l'échantillon.
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Protocol
1. Fabrication d'un dispositif microfluidique à base capillaire-
- Mettre en place des titulaires
Remarque: La conception du support est présenté sur la figure 2A.- Découper chacun des quatre disques des supports (Figure 2A (i) - (iv)) à partir de plaque en matière plastique polyacétal 2 mm d'épaisseur en utilisant une machine de broyage. Utiliser les dimensions suivantes pour chacun des quatre disques du titulaire: (i) une disque de diamètre 8,5 mm, le trou capillaire (CH) de diamètre 1,3 mm, le trou de vis (SH) de diamètre 1,8 mm; (Ii) deux disques de diamètre 8,7 mm, diamètre 2,0 mm, CH, SH diamètre de 1,8 mm; (Iii) trois disques de diamètre 8,7 mm, diamètre 0,5 mm, CH, SH diamètre de 1,8 mm; et (iv) un disque 4 de diamètre 9,1 mm, CH diamètre 1,0 mm, diamètre de 1,8 mm SH.
- Assembler les supports utilisant M2 × 40 vis (figure 2B). Une partie inférieure de la porte (figure 2B) est constitué par le disque 1 et le disque 2 sur la figure 2A (i), (ii) et une partie supérieure (Figure 2B) du support est constitué du disque 3 et le disque 4 sur la figure 2A (iii), (iv).
- Pour construire la partie inférieure du support, insérez la vis dans trois SH de chaque disque 1 et 2. Raccourcir les vis en pinçant un morceau de la partie filetée. Gardez la longueur de la vis à 0,9 cm (la même longueur que la partie inférieure du support).
- Pour construire la partie supérieure de la porte, insérer les vis dans les deux SH de chaque disque 3 et 4. Raccourcir les vis en pinçant un morceau de la partie filetée. Gardez la longueur de la vis à 0.7 cm (la même longueur que la partie supérieure de la porte).
- Pour monter le support, joindre les parties inférieures et supérieures du support en utilisant une vis longue.
Remarque: Conservez la longueur de la chaque partie du support exacte: la partie inférieure est de 0,9 cm; la partie supérieure est de 0,7 cm (figure 2B).
- La fabrication des tubes capillaires en verre
- Utiliser deux types de capillaires en verre: un capillaire de verre intérieure (diamètre extérieur (OD) / Diamètre intérieur (ID): 1,0 / 0,6 mm), et un capillaire de verre extérieure (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
- Utilisez un coupe-verre de diviser le capillaire de verre extérieure en trois parties égales, puis utiliser le coupe-verre de diviser le capillaire de verre intérieure en deux parties égales.
- Aiguiser chacune des capillaires en verre intérieure et extérieure séparées à l'aide d'un extracteur capillaire en verre (figure 3A). Réglez le poids de l'extracteur au max. Réglez le niveau de l'extracteur de chaleur à 60 degrés pour le capillaire de verre extérieure et 70 degrés pour le capillaire intérieure. aiguiser soigneusement le capillaire en verre.
- Gardez la longueur de la pointe dans la partie rétrécie du capillaire en verre: le capillaire intérieur est 1,5-1,8 cm; le capillaire externe est 0,8-1,0 cm (Figure 3C). Si cette longueur est plus courte ou plus longue que la longueur décrit, s'il vous plaît ajuster le niveau de l'extracteur de chaleur.
- Fix capillaires intérieurs ou extérieurs en verre à l'aide d'un ruban microforge debout (figure 3B).
- Couper le bout du capillaire de verre en utilisant l'microforge en trois étapes (figure 3B): (i) toucher la pointe du capillaire de verre pour les perles de verre sur un fil de platine, (ii) chauffer le fil de platine en marchant sur un pied passer pendant 1-2 sec, et (iii) après 1-2 sec, couper la pointe du capillaire de verre par le refroidissement du fil de platine.
- Ajuster les diamètres de l'intérieur (d i) et extérieure (d o) des orifices capillaires, respectivement. Le diamètre de l'orifice du capillaire de verre intérieure est de 5, 10 et 20 pm (d i = 5,10, 20 pm) et le capillaire de verre extérieure (d o) est de 60 pm (d o = 60 pm) dans cette expérience.
Remarque: Le tube capillaire en verre est jetable. Répéter la fabrication du capillaire en verres.
- Ajuster les diamètres de l'intérieur (d i) et extérieure (d o) des orifices capillaires, respectivement. Le diamètre de l'orifice du capillaire de verre intérieure est de 5, 10 et 20 pm (d i = 5,10, 20 pm) et le capillaire de verre extérieure (d o) est de 60 pm (d o = 60 pm) dans cette expérience.
2. Procédure de production W microgouttelettes / S
- Remplir un capillaire de verre extérieure avec de l'huile contenant un agent tensioactif. Le mélange d'huile et d'agent tensio-actif est l'hexadécane contenant 2% (p / p) du monooléate de sorbitan dans cette expérience (Figure 4A).
Note: Il existe de nombreuses combinaisons d'huiles et de tensioactifs (par exemple, les huiles peuvent être fluoré ou gazeuse; tensioactifs peuvent être ioniques, non ioniques, ou fluoré).- Introduire 10 pi de hexadécane contenant le monooléate dans un capillaire de verre extérieure. Sur la figure 4A, le diamètre de l'orifice du capillaire de verre extérieure (d o) est de 60 pm (d o = 60 pm). Pour régler l'orifice du capillaire en verre, revenir aux étapes 1.2.4-1.2.5.
- Fixer le capillaire externe dans la partie inférieure du support (figure 4B).
- Draw d'environ 0,1 ul d'une solution aqueuse dans un capillaire en verre intérieur (Figure 4C) par action capillaire. Sur la figure 4C, le diamètre de l'orifice du capillaire en verre intérieur (d i) est de 10 pm (d i = 10 pm). Pour régler l'orifice du capillaire de verre, revenir aux étapes 1.2.4-1.2.5.
- Fixer le capillaire interne dans la partie supérieure du support (Figure 4D-a). Insérer le tube capillaire interne dans le capillaire externe (Figure 4D-a). En regardant le point cercle blanc comme sur la figure 4D-a, observer la position du tube capillaire interne à l'intérieur du capillaire extérieur (diamètre interne du capillaire extérieur (w) = 130 um) (Figure 4D-b, c) en utilisant un microscope numérique . La position du capillaire interne au sein du capillaire externe doit être mis à w = 100 à 150 um.
Remarque: Pour changer la position de l'intérieurcapillaire dans le capillaire extérieur, s'il vous plaît tourner la vis dans la partie supérieure de la porte. Ainsi, la distance w peut être contrôlée avec précision. - Introduire 100 ul de l'hexadécane contenant du monooléate de sorbitan (2% p / p) dans le fond d'un microtube de 1,5 ml d'échantillon. Installer le support, avec des capillaires internes et externes, dans l'échantillon microtube (figure 4E-a). Soyez sûr de vérifier le capillaire extérieur pour le tenir éloigné de l'interface air-huile (Figure 4E-b).
- Centrifugeuse le microtube de l'échantillon en utilisant un type sur oscillant table mini-centrifugeuse à une gravité de 1.600 g pendant 1-2 sec pour générer des microgouttelettes (figure 4F). Effectuer toutes les expériences à température ambiante.
Remarque: Utilisez une centrifugeuse de type à balancement. Une goutte peut entrer en collision avec une paroi latérale de l'échantillon microtube et à se désintégrer lorsqu'une force de centrifugation en forme d'équerre fixe est utilisée. - tirer doucement le W / O gouttelettes à la pipette, puis, les mettre sur un verre slide.
- Capturez des images des microgouttelettes générés en utilisant un microscope numérique (grossissement 200X).
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Representative Results
Dans cette étude, nous présentons une méthode simple pour la génération de micro-gouttelettes de cellules de taille W / O en utilisant un dispositif microfluidique centrifuge basé capillaire (Figure 1). Le dispositif microfluidique est composé d'un support de capillaire (figure 2B), deux capillaires en verre creux (capillaires en verre interne et externe de la figure 3C), et un microtube contenant une huile dont tensioactif. On injecte 0,1 ul de solution d'échantillon dans le capillaire de verre intérieure et placé le capillaire de verre intérieure dans le capillaire de verre extérieure (figure 4D). Microgouttelettes cellulaires taille W / O ont été générés par Plateau-Rayleigh instabilité d'un jet d'écoulement de la solution échantillon 17 (figure 1B) et étaient stables pendant au moins 2 h 17.
Des exemples typiques des différentes tailles d'E / S générées microgouttelettes du capillaire-based dispositif microfluidique centrifuge sont présentés dans la figure 5. Figure 5A-F montre les images de microscopie numérique et des histogrammes de distribution de taille (n = 200) des microgouttelettes W / O. Les micro-gouttelettes W / O ont été générés en utilisant un capillaire interne avec un d i = 5 (A, B), 10 (C, D), ou de 20 pm (E, F) le diamètre de l'orifice tout en maintenant d o et w constante à 60 um et 115 pm, respectivement. Les mesures de la taille des micro-gouttelettes E / H générés ont été acquis par l'analyse de l'image obtenue au microscope. Pour la d i = 5, 10 et 20 um orifices, le diamètre moyen des micro-gouttelettes étaient de 8,3 um (écart-type (SD) de 0,9 pm, le coefficient de variation (CV) de 10,8%), 12,7 um (SD 1,1 um, CV 8,6%), et 17,9 um (SD 1,4 pm, 7,8% CV), respectivement. Ces résultats indiquent que nous avons obtenu avec succès monodisperse W / O microdroplets par la méthode proposée. En outre, le diamètre des microgouttelettes W / O sont pratiquement les mêmes que l'orifice capillaire interne (figure 5G). Ainsi, la taille moyenne des micro-gouttelettes W / O peut facilement être ajustée sur une large plage, généralement de 5 à 20 um, en utilisant le micro-dispositif.
Figure 1. Vue d'ensemble de centrifuge en fonction capillaire révolution co-circulant dispositif microfluidique et la formation de W microgouttelettes d'E / S à l'aide de l'appareil. (A) Illustration de la base capillaire centrifuge axisymétrique co-circulant dispositif microfluidique et le processus de génération W / microgouttelettes O ( dans le cercle), (B) W microgouttelettes d'E / S générées par Plateau-Rayleigh instabilité d'un flux de jet d'une solution aqueuse 17, d i est diamètre de l'orifice du capillaire de verre intérieure, d oest diamètre de l'orifice du capillaire de verre intérieure, w est le diamètre interne du capillaire externe, (C) Photographie de dispositif fabriqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Installation de support d'élément capillaire (A) de conception du support de capillaire en matière synthétique polyacétal. L'unité de diamètres dans le support est mm. (B) Les photographies de la porte sont constitués d'une partie supérieure et une partie inférieure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Diagramme du dispositif microfluidique set-up et la génération de W microgouttelettes d'E / S. (A) Préparation du capillaire externe. L'huile avec des tensioactifs introduits dans le capillaire externe, (B) capillaire Outer mis dans la partie inférieure du support, (C) Préparation du capillaire intérieure: Solution aqueuse drarête dans un capillaire intérieur par capillarité, capillaire (D) Inner fixé dans la partie supérieure du support (a). Vérifier que le capillaire intérieur est dans le capillaire externe en utilisant un microscope numérique (B, C), (E) Titulaire avec des capillaires intérieurs et extérieurs installés dans le tube d'échantillon (a). Vérifier que le capillaire externe a été tenu à l'écart de l'interface air-huile, (F) Enfin, l'échantillon microtube a été centrifugée par un-type sur oscillant table mini-centrifugeuse. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Formation de microgouttelettes W / O cellulaires taille monodisperses. Images de microscope numérique et de distribution de la taille des histogrammes (n = 200) de micro-gouttelettes produites en utilisant des capillaires de différents diam, d i = 5 (A, B), 10 (C, D) et 20 um (E, F), (G) Corrélation entre le diamètre de l'orifice du capillaire en verre et le diamètre des micro-gouttelettes généré W / O . Les barres d'erreur représentent les écarts-types du diamètre des microgouttelettes W / S générées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En utilisant ce dispositif, l'monodisperse W / O microgouttelettes ont été générés par l'instabilité de Rayleigh-Plateau d'un jet-débit 17. L'examen microscopique n'a pas révélé la présence de gouttelettes satellites. Dans la fabrication de l'appareil, trois étapes critiques sont essentiels pour générer avec succès microgouttelettes E / H monodisperses. Tout d'abord, de fournir un flux linéaire de l'huile contenant un agent tensioactif et une solution aqueuse, les trous capillaires de quatre disques doivent être organisées de façon concentrique. En second lieu, le capillaire a été soigneusement interne inséré dans le capillaire externe, car la pointe du capillaire se casse facilement en cas de contact du support supérieur. Cette opération peut être difficile, donc nous vous recommandons d'utiliser une loupe. Enfin, dans le but de faire un jet d'écoulement de la solution aqueuse 17, la position du capillaire interne dans le capillaire externe doit être mis à w = 100 à 150 um. Si la distribution de la taille des micro-gouttelettes W / S générée par micro centrifugeDispositif rofluidic est pas monodisperse, vérifier la position du capillaire intérieure dans le capillaire externe. Pour changer la position du capillaire interne au sein du capillaire externe, s'il vous plaît tourner la vis dans la partie supérieure du support. Ainsi, la distance w peut être contrôlée avec précision.
Pour faire microgouttelettes E / H monodisperses, il y a des limites actuelles. Il est difficile de l'augmentation du taux centrifuge (si nécessaire) parce que toutes les expériences de l'étude ont été effectuées à la vitesse centrifuge maximale de la centrifugeuse de bureau. En outre, la production de gouttelettes est difficile à partir d'une variété de solutions d'échantillonnage différentes, la limitation étant fonction de la conception de la centrifugeuse. Capillaires Multi-canon que le capillaire intérieure peut fournir les micro-gouttelettes encapsulées de diverses combinaisons de matériaux et solutions 18.
Le dispositif microfluidique a deux principaux avantages par rapport aux méthodes classiques de microcanaux: i) easy et la fabrication robuste, et ii) l'exigence de seulement un petit volume (0,1 pi) de la solution d'échantillon. Tout d'abord, la fabrication de la centrifuge dispositif de co-circulant révolution basée capillaire microfluidique est simple et robuste. Seulement capillaires minces, un support d'élément capillaire, et un échantillon microtube sont nécessaires. Le temps de fabrication est de 5-10 min pour le périphérique. La fabrication du dispositif prend moins de temps par rapport à la fabrication de tout autre dispositif microfluidique. Par ailleurs, le support d'élément capillaire est robuste et peut être réutilisé. Par conséquent, les consommables sont les capillaires en verre et l'échantillon microtube dans le dispositif, ce qui le rend moins cher que les autres systèmes microfluidiques. Enfin, étant donné que les débits d'huile et aqueuse ont été produites par la force centrifuge, il n'y avait pas de volume gaspillé. Pour 1-2 sec, le dispositif génère un grand nombre de micro-gouttelettes.
Microgouttelettes sont des candidats idéaux pour mener à bien des expériences à haut débit impliquant de petites quantités d'échantillons solution. Avec ce dispositif, il est théoriquement possible de générer des centaines de milliers de micro-gouttelettes 10 um de taille par seconde à partir de 0,1 pi de la solution d'échantillon. Ainsi, le dispositif accueille travailler avec des échantillons biologiques précieux en réduisant au minimum le volume des échantillons nécessaires à l'analyse quantitative rapide. Ce dispositif peut être utilisé pour analyser les réactions biochimiques 6-9 et unicellulaires réactions enzymatiques 10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
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