Abstract
여기서는 모세관 기반 원심 미세 유동 장치를 이용하여 제어 할 수있는 크기, 단 분산, W / 출력 미세 방울의 신속한 제조를위한 간단한 방법을 보여준다. W / O의 미세 방울은 최근 화학 실험 소형화 에이블 강력한 방법에 사용되어왔다. / O 미세 방울 필요 W 따라서, 다목적 현상 방법은 단 분산 얻었다. 우리는 모세관 기반 원심 선대칭 공동 흐르는 미세 유동 장치에 기초하여 / O의 미세 방울 W 단 분산 생성하기위한 방법을 개발 하였다. 우리는 모세관 구멍을 조절함으로써 미세 방울의 크기를 제어하는데 성공했다. 우리의 방법은, 밀봉 용 시료 액의 소량 (0.1 μL)를 필요로 사용하기 쉬운 다른 마이크로 유체 기술을보다 장비를 필요로 초당 W / O의 미세 방울 수백 수천의 수의 생산을 가능하게 . 우리는이 방법이 소중한 생물들 필요 생물학적 연구를 도움이 될 것 기대신속한 정량 분석 생화학 및 생물학적 연구를위한 샘플의 부피를 보존하여 amples.
Introduction
W / O 미세 방울 1-5 단백질 합성 (6), 단백질 결정화 (7), 에멀젼 PCR 8, 9, 세포 캡슐화 (10), 인공 세포와 같은 시스템 5,6의 건설을 포함한 생화학 및 생명 공학의 연구에 많은 중요한 응용 프로그램을 가지고있다. 이러한 응용을위한 W / O의 미세 방울을 생산 중요한 기준은 사이즈 W / O의 미세 방울의 단순 분산도를 제어한다. 미세 유체 장치의 제조 단 분산의 크기가 제어 W / 미세 방울 (11)은 공동 (12, 13)에있어서 흐르는 흐름 포커싱 방법 14,15 및 마이크로에 T 접합 방법 (16)에 기초 이여. 이러한 방법은 매우 단 분산 W / O의 미세 방울을 생성하지만, 미세 처리가 마이크로 채널 제조 복잡한 처리 및 전문 기술을 필요로하고, 또한 시료 용액을 다량 (최소 수백이 필요81; 때문에 마이크로에 시료 용액을 실시 주사기 펌프와 튜브 불가피 데드 볼륨 l). / O 미세 방울가 필요하다 (W) 따라서, 사용하기 쉬운과 낮은 죽은 볼륨 방법은 단 분산 생성합니다.
이 논문은, 실험 절차의 동영상과 함께 / O 미세 방울 (그림 1) W 단 분산 셀 크기의 생성 원심 모세관 기반의 축 대칭 공동 흐르는 미세 유체 장치 (17)에 대해 설명합니다. 이 간단한 방법은 크기의 단 분산 및 크기 제어를 달성 할 수있다. 그냥 탁상 미니 원심 분리기 및 샘플링 마이크로 튜브에 고정 된 모세관 기반의 축 대칭 공동 흐르는 미세 유체 장치가 필요합니다. 우리의 방법은 단지 매우 소량 (0.1 μL)를 필요로하고, 샘플의 상당한 양을 낭비하지 않는다.
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Protocol
모세관 기반 미세 유체 장치 1. 제작
- 홀더의 설정
참고 : 홀더 디자인 그림 2A로 표시됩니다.- 홀더의 네 각 디스크 잘라 (도 2A (Ⅰ) - (IV)) 밀링 머신을 사용하여 2 mm 두께의 플레이트를 폴리 아세탈 수지. (SH) 직경은 1.8 mm 고정 홈 (I)의 디스크 (1)의 직경 8.5 mm, 모세관 구멍 (CH)의 직경 1.3 mm; 홀더 네 디스크 각각에 대해 다음의 기준을 사용 (ⅱ)이 디스크 직경 8.7 mm, CH 직경 2.0 mm, SH 직경 1.8 mm; (ⅲ) 디스크 (3)의 직경 8.7 mm, CH 직경 0.5 mm, SH 직경 1.8 mm; 및 (ⅳ) 4 장 직경 9.1 mm, 지름 1.0 mm CH, SH 직경 1.8 mm.
- M2 (40) 나사 (그림 2B)를 × 사용하여 홀더를 조립합니다. 홀더 (도 2B)의 저부는도 2a (i), (ii) 및 상부 (도 디스크 (1)과 디스크 (2)로 구성홀더 URE의 2B)를 디스크 (3)와도 2a에 4 장 구성 (III), (IV).
- 홀더의 하부를 구성하는 각 디스크 (1)의 세 SH에 나사를 삽입 2. 쓰레드 부의 부분을 협지하여 나사를 짧게. 0.9 cm (상기 홀더의 바닥 부와 동일한 길이)에 나사의 길이를 유지한다.
- 홀더의 상부를 구성하는 각각의 디스크의 3 개의 SH에 나사를 삽입 4. 나사부의 일부를 협지하여 나사를 짧게. 0.7 cm (홀더의 상부와 같은 길이)에 나사의 길이를 유지한다.
- 홀더 조립 긴 나사를 사용하여 홀더의 하부 및 상부에 참여.
참고 : 정확한 홀더의 각 부분의 길이를 유지 : 하단 부분은 0.9 cm입니다; 상부는 0.7 cm (그림 2B)입니다.
- 유리 모세관의 제작
- 내부 유리 모세관 (외경 (OD) / 내경 (ID) : 1.0 / 0.6 mm), 및 외부 유리 모세관 (OD / ID : 2.0 / 1.12 mm) 두 개의 유리 모세관의 형식을 사용합니다.
- 3 등분으로 외부 유리 모세관을 분할하는 유리 절단기를 사용하여 두 개의 동일한 조각으로 내부 유리 모세관을 분할하는 유리 커터를 사용합니다.
- 유리 모세관 풀러 (도 3a)을 사용하여 각각의 분할 된 내측 및 외측 유리 모세관을 선명. 최대의 풀러의 무게를 설정합니다. 외부 유리 모세관 60도, 내부 모세관 70도에서 풀러의 열 레벨을 설정합니다. 조심스럽게 유리 모세관을 선명하게.
- 유리 모세관의 잘록한 부분에서 끝의 길이를 유지 : 내부 모세관은 1.5-1.8 cm이다 외부 모세관은 0.8-1.0 cm (그림 3C)입니다. 이 길이는 기재의 길이보다 짧거나 길면, 풀러 열 조정하여주십시오.
- 에프IX microforge에 내부 또는 외부 유리 모세관 테이프 (그림 3B)를 사용하여 서있다.
- 세 단계 (도 3b)에 microforge를 사용하여 유리 모세관의 끝 부분을 잘라 (ⅰ) 백금선에 유리 비드를 유리 모세관의 끝을 터치 (II) 발 밟아 백금선 가열 1-2 초 동안 스위치, 및 (iii) 1 ~ 2 초 후에, 백금선을 냉각시켜 유리 모세관의 끝 부분을 잘라.
- 각각 내부 (d 개의 i) 및 외부 (D 오) 모세관 구멍의 직경을 조정합니다. 내측 유리 모세관의 오리피스 직경, 10 5, 20 ㎛의 (d에서 I = 5, 10, 20 μm의)과 외부 유리 모세관의 (d 오)이 실험에서 60 μm의 (라 오 = 60 μm의)입니다.
참고 : 유리 모세관은 일회용이다. 유리 capillar의 제조를 반복하여이거 야.
- 각각 내부 (d 개의 i) 및 외부 (D 오) 모세관 구멍의 직경을 조정합니다. 내측 유리 모세관의 오리피스 직경, 10 5, 20 ㎛의 (d에서 I = 5, 10, 20 μm의)과 외부 유리 모세관의 (d 오)이 실험에서 60 μm의 (라 오 = 60 μm의)입니다.
생성 W / O의 미세 방울 2. 절차
- 오일 계면 활성제와 외부 유리 모세관을 입력합니다. 오일 및 계면 활성제의 혼합물은 헥사 (w / w)이 실험 (도 4a)의 소르 비탄 모노 올레 에이트 2 %를 함유한다.
참고 : 오일과 계면 활성제의 많은 조합이있다 (예를 들어, 오일 플루오르 또는 탄산 일 수있다 계면 활성제는 이온 성 비이 온성, 또는 플루오로 할 수있다).- 외부 유리 모세관에 헥사 데칸 포함 소르 비탄 모노 올레 에이트의 10 μl를 소개합니다. 도 4a에서, 외부 유리 모세관 (d 오)의 오리피스 직경은 60 μm의 (d 오 = 60 μm의)이다. 유리 모세관의 구멍을 조정하려면, 단계 1.2.4-1.2.5로 돌아갑니다.
- 홀더 (그림 4B)의 바닥 부분에 외부 모세관을 설정합니다.
- 드라모세관 작용에 의해 내 유리 모세관 (도 4C)으로 수용액 약 0.1 μL w. 도 4c에서, 내부 유리 모세관 (d 개의 I)의 구멍 직경은 10 μm의가 (d는 내가 10 μm의 =)입니다. 유리 모세관의 구멍을 조정하려면, 단계 1.2.4-1.2.5로 돌아갑니다.
- 홀더 (도 4D-a)의 상단부에 내측 모세관을 설정한다. 외부 모세관 (그림 4D-)에 내부 모세관을 삽입합니다. 그림에서와 같이 흰색 도트 원을 보면 4D-는, 외부 모세관 내부의 내부 모세관의 위치 (외부 모세관 (μm의 w) = (130)의 내부 직경) 관찰 (그림 4D-B를 C) 디지털 현미경을 사용하여 . 외측 모세관의 내부 모세관의 위치는 w = 100 ~ 150 ㎛, 설정해야한다.
참고 : 내부의 위치를 변경하려면외부 모세관의 모세관는 홀더의 상부에 나사를 켜십시오. 이것에 의해, 거리 (W)을 정밀하게 제어 할 수있다. - 1.5 ml의 샘플을 마이크로 튜브의 바닥에 헥사 함유 소르 비탄 모노 올 레이트 (w / w 2 %) 100 μl를 소개한다. 샘플의 마이크로 튜브 (도 4E-a)에서, 내측 및 외측 모세관으로 홀더를 설치한다. 공기 - 오일 인터페이스 (그림 4E-B)에서 멀리 유지하기 위해 외부 모세관을 확인하십시오.
- 원심 분리기 (그림 4 층) 미세 방울을 생성하기 위해 1 ~ 2 초 동안 1,600 XG의 중력에 탁상 스윙 아웃 형 미니 원심 분리기를 사용하여 샘플 마이크로 튜브. 실온에서 모든 실험을 수행한다.
참고 : 스윙 아웃 형 원심 분리기를 사용합니다. 액적 샘플 마이크로 튜브의 측벽에 충돌하고, 고정 각도 타입의 원심 분리를 사용할 때 분해된다. - 천천히 피펫 W / O 방울을 작성하고, 유리 (S)에 올려LIDE.
- 미세 방울의 캡처 된 이미지가 디지털 현미경 (배율 200 배)을 이용하여 생성.
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Representative Results
본 연구에서는 모세관 기반 원심 미세 유동 장치 (도 1)를 사용하여 셀 크기 W / O의 미세 방울의 생성을위한 간단한 방법을 제시한다. 미세 유동 장치가 모세관 홀더 (도 2B)로 구성하고, 두 유리 모세관 (도 3c에 내부 및 외부 유리 모세관), 및 계면 활성제를 포함하는 기름을 포함하는 마이크로 튜브. 우리는 내측 유리 모세관에 시료 용액 0.1 μl를 주입하고, 외부 유리 모세관 (도 4d)에 내측 유리 모세관을 두었다. 셀 크기 W / O의 미세 방울은 샘플 용액 (17) (도 1b)의 분사 흐름의 플래 토우 레일리 불안정성에 의해 발생하고, 적어도 2 시간 17 안정 하였다.
W의 크기가 다른 전형적인 예 / O의 미세 방울은 모세관 (BA)에서 생성 된SED 원심 미세 유동 장치는도 5에 도시되어있다.도 5a-F는 W / O의 미세 방울의 디지털 현미경 이미지 크기 분포 히스토그램 (N = 200)을 나타낸다. W의 / O를 미세 방울은 D의 내부 모세관을 사용하여 생성 된 I = 5 (A, B), 10 (C, D), 또는 20 ㎛의 (E, F)의 오리피스 지름 60㎛로에서 개발 O 및 w를 일정하게 유지하면서 각각 115 μm의. 생성 된 W / O의 미세 방울의 크기의 측정은 얻어진 현미경 이미지 분석에 의해 획득 하였다. D를 들어 I = 5, 10, 20 ㎛의 구멍의 미세 방울의 평균 직경은 8.3 ㎛의 (표준 편차 (SD) 0.9 ㎛의, 변동 계수 (CV) 10.8 %), 12.7 μm의 (SD 1.1 μm의, CV 있었다 각각 8.6 %), 17.9 μm의 (SD 1.4 μm의, CV 7.8 %). 이러한 결과는 우리가 성공적으로 단 분산 W / O의 microdrople을 얻을 수 있음을 나타냅니다제안 된 방법에 의해 TS. 또한, W / O microdroplet의 직경이 거의 내 모세 오리피스 (도 5G)과 동일하다. 따라서, W / O의 미세 방울의 평균 크기를 쉽게 마이크로 장치를 사용하여, 일반적으로 5 내지 20 ㎛ 인, 넓은 범위에 걸쳐 동조 될 수있다.
원심 모세관 기반 선대칭 공동 흐르는 미세 유동 장치 및 프로세스 생성 W / O의 미세 방울을 (원심 모세관 기반 선대칭 공동 흐르는 미세 유동 장치와 그 장치를 사용하여 W / O의 미세 방울을 형성한다. (A)의 그림도 1. 개관 수용액 (17)의 분사 흐름의 플래 토우 레일리 불안정성에 의해 발생 / O의 미세 방울 W 원), (B) 내에서, D의 전 내측 유리 모세관의 구멍 직경은, D O외부 모세 혈관의 내경, 제작 된 장치의 (C) 사진이 w 내부 유리 모세관의 구멍 직경이있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모세관 홀더도 2 설치 아세탈 플라스틱 모세관 홀더 (A) 디자인 :. 홀더 직경의 단위는 mm이다. 홀더의 (B) 사진은 상부와 하부로 구성되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
W / O의 미세 방울의 미세 유체 장치 설정 및 생성 그림 4. 플로우 차트. 외부 모세관의 (A) 준비. 외측 모세관 (B) 상기 홀더의 바닥 부에 설정 외부 모세관 내부 모세관의 (C)의 제조에 도입 활성제 기름 : 수성 용액 DR까끄라기 모세관 현상에 의한 모세관 내부에, (D) 내부의 모세관 홀더 (a)의 상단 부분에 설정한다. 내부 모세관 샘플 튜브 (A)에 설치된 내측 및 외측 모세관으로 디지털 현미경 (b, c), (E)를 사용하여 홀더 외측 모세관 있다는 확인. 마지막으로, 샘플 마이크로 튜브는 탁상 스윙 아웃 형 미니 원심 분리기로 원심 분리 (F), 외부 모세관이 떨어져 공기 - 오일 인터페이스에서 유지 것을 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다양한 직경의 모세 혈관을 사용하여 생성 된 미세 방울의 단 분산 셀 크기 W / O의 미세 방울의 그림 5. 형성. 디지털 현미경 이미지와 크기 분포 히스토그램 (N = 200)m, D, I = 5 (A, B), 10 (C, D), 20 ㎛의 (E, F), (G) 유리 모세관의 오리피스 직경 생성 W / O의 미세 방울의 직경의 상관 관계 . 오차 막대가 생성 된 W / O의 미세 방울의 직경의 표준 편차를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 장치를 사용하면, / O W 미세 방울은 단 분산 제트 흐름 (17)의 플래 토우 레일리 불안정성에 의해 발생되었다. 현미경 검사 위성 방울의 존재를 공개하지 않았다. 장치의 제조에있어서, 세 가지 중요한 단계가 성공적으로 단 분산 W / O의 미세 방울을 생성하는 것이 필수적이다. 우선, 오일 및 계면 활성제의 수용액의 직선 유동을 공급하는 네 개의 디스크 모세관 구멍이 동심원 형태로 배열되어야한다. 접촉 상부 홀더 경우 모세관의 선단이 쉽게 분해 때문에 둘째, 내부 모세관 신중 외측 모세관 내로 삽입 하였다. 이 작업은 어려울 수 있습니다, 그래서 우리는 돋보기를 사용하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 수용액 (17)의 분사 유량을 확인하기 위해, 외부 모세관 내부에 모세관의 위치는 w = 100 ~ 150 ㎛, 설정해야한다. 만약 원심 MIC에 의해 생성 된 W / O 용의 미세 방울의 크기 분포rofluidic 단 분산 장치가 아닌 외부 모세관 내부 모세관의 위치를 확인한다. 외측 모세관의 내부 모세관의 위치를 변경하기 위해, 상기 홀더의 상부에 나사를 돌려주십시오. 이것에 의해, 거리 (W)을 정밀하게 제어 할 수있다.
단 분산 W / O의 미세 방울을 만들려면 현재의 제한 사항이 있습니다. 본 연구의 모든 실험은 데스크탑 원심 분리기의 최대 속도로 원심 수행 되었기 때문에 (필요한 경우) 원심 분리 속도를 증가 시키는데 어려움이있다. 또한, 액적 생성 다양한 샘플 용액의 다양한 어렵다 제한 원심 분리 디자인에 의존. 소재와 솔루션 (18)의 다양한 조합에서 캡슐화 된 미세 방울을 제공 할 수있다 내부 모세 혈관으로 모세 혈관을 멀티 질주.
미세 유체 장치는 기존의 마이크로 방법에 비해 두 가지 주요 이점이 있습니다 ⅰ) 전자ASY 견고한 제조 한 시료 용액의 소량 (0.1 μL의 II)의 요건). 우선, 캐 필러 계 원심 선대칭 공동 흐르는 미세 유동 장치의 제작이 간단하고 견고하다. 오직 얇은 모세관 모세관 홀더 및 샘플 마이크로 튜브가 필요하다. 제조 시간은 장치 5-10 분이다. 소자의 제조는 다른 미세 유동 장치의 제작에 비해 시간이 덜 걸린다. 또한, 모세관 홀더 견고하고 재사용 할 수있다. 따라서 유일한 소모품은 다른 마이크로 유체 시스템보다 덜 비싼 만드는 장치에서 유리 모세관 및 샘플 마이크로 튜브입니다. 석유와 수성 흐름이 원심력에 의해 제작 되었기 때문에 마지막으로, 더 낭비 볼륨이 없었다. 1-2 초 동안, 상기 장치는 미세 방울 다수를 생성한다.
미세 방울 샘플 solutio 소량을 포함하는 높은 처리량 실험을 수행하기에 이상적인 후보엔. 이 장치에, 상기 시료 용액 0.1 μL에서 초당 10 ㎛의 크기의 미세 방울 수십만 생성하는 이론적으로 가능하다. 따라서, 장치가 신속 정량 분석에 필요한 시료의 양을 최소화함으로써 귀중한 생물학적 시료 작동 수용한다. 이 장치는 생화학 반응 6-9 및 단일 효소 반응 셀 (10)을 분석하기 위해 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
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