Abstract
Här visar vi en enkel metod för snabb produktion av storleks kontrollerbar, monodispersa, W / O mikrodroppar med hjälp av en kapillär baserad centrifugal mikroflödessystem enhet. W / O-mikrodroppar har nyligen använts i kraftfulla metoder som möjliggör miniatyriserade kemiska experiment. Därför att utveckla en mångsidig metod ger monodispersa W / O mikrodroppar behövs. Vi har utvecklat en metod för att generera monodispers W / O mikrodroppar som bygger på en kapillär baserad centrifugal axelsymmetrisk co strömmande mikroflödessystem enhet. Vi lyckats kontrollera storleken på mikrodroppar genom att justera kapillär öppning. Vår metod kräver utrustning som är lättare att använda än andra mikroflödesteknik, kräver endast en liten volym (0,1-1 ul) av provlösning för inkapsling, och möjliggör produktion av hundratusentals antal W / O-mikrodroppar per sekund . Vi förväntar oss att denna metod kommer att hjälpa biologiska studier som kräver dyrbar biologiska spel genom att bevara volymen av proverna för snabb kvantitativ analys biokemiska och biologiska studier.
Introduction
W / O mikrodroppar 1-5 har många viktiga applikationer för studier av biokemi och bioteknik, inklusive proteinsyntes 6, proteinkristallisering 7, emulsion PCR 8,9, cell inkapsling 10, och konstruktion av artificiella cell liknande system 5,6. För att framställa W / O-mikrodroppar för dessa applikationer, viktiga kriterier är kontroll av storlek och monodispersibility av W / O-mikrodroppar. Mikroflödessystem enheter för att göra monodispersa, storleks kontrollerbar W / O mikrodroppar 11 är baserade på co-strömmande metod 12,13, flödesfokuseringsmetod 14,15, och T-korsning metod 16 i mikro. Även om dessa metoder producera mycket monodispergerade W / O-mikrodroppar kräver mikroprocessen komplicerad hantering och specialiserade tekniker för framställning av mikro, och kräver också en stor mängd av provlösningen (åtminstone flera hundra81; l) på grund av den oundvikliga död volym i sprutan pumpar och rör som bedriver provlösningen till mikro. Således, för att en enkel att använda och låg-död-volym-metoden genererar monodispersa W / O-mikrodroppar behövs.
Detta dokument, tillsammans med videor av experimentella procedurer, beskriver en centrifugal kapillär-baserade axelsymmetrisk co-flödande mikroflödessystem enhet 17 för generering av cellstorlek, monodispers W / O mikrodroppar (Figur 1). Denna enkla metod uppnår storlek monodispersitet och storlek styrbarhet. Det krävs bara en bordsskiva mini-centrifug och en kapillär-baserade axelsymmetrisk co-flödande mikroflödessystem enhet fast i en provtagnings mikrorör. Vår metod behöver bara en mycket liten volym (0,1 l), och inte slösa någon betydande volym av provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av en kapillär-baserade mikroflödessystem enhet
- Inrättas för innehavare
Obs: Innehavaren utformning presenteras i figur 2A.- Klippa ut var och en av de fyra skivor av hållarna (figur 2A (i) - (iv)) från 2-mm-tjock polyacetal plastplatta med användning av en fräsmaskin. Använd följande dimensioner för var och en av de fyra skivorna i hållaren: (i) skiva en diameter 8,5 mm, kapillär hål (CH) diameter 1,3 mm, skruvhål (SH) diameter 1,8 mm; (Ii) skiva 2 diameter 8,7 mm, CH diameter 2,0 mm, SH diameter 1,8 mm; (Iii) skiva 3 diameter 8,7 mm, CH diameter 0,5 mm, SH diameter 1,8 mm; och (iv) skiva 4 diameter 9,1 mm, CH diameter 1,0 mm, SH diameter 1,8 mm.
- Montera hållarna med hjälp av M2 × 40 skruvar (Figur 2B). En nedre delen av hållaren (Figur 2B) består av skivan 1 och skivan 2 i figur 2A (i), (ii) och en överdel (figure 2B) hos hållaren består av skivan 3 och skivan 4 i figur 2A (iii), (iv).
- För att konstruera den nedre delen av hållaren, in skruven i tre SH av varje skiva en och 2. Korta skruvarna genom löste av en bit av det gängade partiet. Hålla längden på skruven på 0.9 cm (samma längd som den nedre delen av hållaren).
- För att konstruera den övre delen av hållaren, sätta skruvar i två SH av varje skiva 3 och 4. Korta skruvarna genom löste av en bit av det gängade partiet. Hålla längden på skruven på 0.7 cm (samma längd som den övre delen av hållaren).
- För att montera hållaren, gå botten och övre delarna av innehavaren med hjälp av en lång skruv.
Obs: Håll längden på varje del av hållaren exakt: den nedre delen är 0,9 cm; den övre delen är 0,7 cm (Figur 2B).
- Tillverkningen av glaskapillärer
- Använda två typer av glaskapillärer: en inre glaskapillär (Ytterdiameter (OD) / Inre diameter (ID): 1,0 / 0,6 mm) och en yttre glaskapillär (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
- Använda en glaskniv att dela den yttre glaskapillär i tre lika delar, och sedan använda glas fräs för att dela upp det inre glaskapillär i två lika stora bitar.
- Vässa vardera uppdelade inre och yttre glaskapillärer med hjälp av en glaskapillär-avdragare (figur 3A). Ställa in vikten på avdragare vid max. Ställa in värmenivån hos dragdonet på 60 grader för det yttre glaskapillär och 70 grader för den inre kapillären. Noggrant skärpa glaskapillär.
- Hålla längden av spetsen inom den förträngda delen av glaskapillär: den inre kapillären är 1,5-1,8 cm; den yttre kapillär är 0,8-1,0 cm (Figur 3C). Om denna längd är kortare eller längre än den beskrivna längden, justera värmenivån hos avdragare.
- Fix de inre eller yttre glas kapillärerna till microforge stå med tejp (Figur 3B).
- Skära av spetsen på glaskapillär med hjälp av microforge i tre steg (fig 3B): (i) rör vid spetsen av glaskapillären till glaspärlor på en platinatråd, (ii) värma platinatråd genom att trampa på en fot växla till 2/1 sekund, och (iii) efter 1-2 sek, avskurna spetsen av glaskapillären genom kylning av platinatråd.
- Justera diametrarna hos de inre (d i) och yttre (d o) kapillära öppningar, respektive. Öppningsdiametern hos den inre glaskapillär är 5, 10, och 20 ^ m (d i = 5,10, 20 | j, m) och den yttre glaskapillär (d o) är 60 ^ m (d o = 60 ^ m) i detta experiment.
Obs: glaskapillär är av engångstyp. Upprepa tillverkning av glas capillartalet.
- Justera diametrarna hos de inre (d i) och yttre (d o) kapillära öppningar, respektive. Öppningsdiametern hos den inre glaskapillär är 5, 10, och 20 ^ m (d i = 5,10, 20 | j, m) och den yttre glaskapillär (d o) är 60 ^ m (d o = 60 ^ m) i detta experiment.
2. Förfarande för att generera W / O-mikrodroppar
- Fyll en yttre glaskapillär med olja innehållande ytaktivt medel. Blandningen av olja och ytaktivt medel är hexadekan innehållande 2% (vikt / vikt) sorbitanmonooleat i detta experiment (figur 4A).
Obs: Det finns många kombinationer av oljor och ytaktiva ämnen (t ex kan oljor vara fluorerade eller kolsyrat, tensider kan vara joniska, icke-joniska eller fluorkemikalie).- Inför 10 pl hexadekan innehåller sorbitanmonooleat i en yttre glaskapillär. I figur 4A, är öppningsdiametern hos den yttre glaskapillär (d o) 60 ^ m (d o = 60 ^ m). För att justera öppningen av glas kapillär, återgå till steg 1.2.4-1.2.5.
- Ställ den yttre kapillären i bottendelen av hållaren (Figur 4B).
- DRAw ca 0,1 | il av en vattenlösning i en inre glaskapillär (Figur 4C) genom kapillärverkan. I figur 4C, är den öppningsdiameter av inre glaskapillär (d i) 10 ^ m (d i = 10 ^ m). För att justera öppningen av glas kapillär, återgå till steg 1.2.4-1.2.5.
- Ställ den inre kapillär i den övre delen av hållaren (Figur 4D-a). Sätt den inre kapillär i den yttre kapillär (Figur 4D-a). Om man tittar på den vita punkten cirkel såsom i figur 4D-a, observera positionen för den inre kapillären inuti den yttre kapillär (inre diameter hos den yttre kapillär (w) = 130 ^ m) (Figur 4D-b, c) med användning av en digital mikroskop . Läget för den inre kapillär i den yttre kapillär måste ställas in på w = 100-150 nm.
Obs: Om du vill ändra läget för inrekapillär i den yttre kapillär, vänd skruven i den övre delen av hållaren. Därigenom kan avståndet w styras exakt. - Introducera 100 pl av hexadekan innehållande sorbitanmonooleat (2% vikt / vikt) i botten av ett 1,5 ml prov mikrorör. Montera hållaren med de inre och yttre kapillärer, i provet mikrorör (Figur 4E-a). Var noga med att kontrollera den yttre kapillär att hålla den borta från luftoljegränssnitt (Figur 4E-b).
- Centrifugera provet mikrorör med hjälp av en bordsskiva swinging-out-typ mini-centrifug vid en vikt av 1600 xg i 1-2 sekunder för att generera mikrodroppar (Figur 4F). Utföra alla experiment vid RT.
Obs: Använd en swinging-out-typ centrifug. En droppe kan kollidera med en sidovägg av provet mikrorör och faller sönder när en fast vinkel-typ centrifug används. - Sakta upprätta W / O-droppar med pipett och sedan lägga dem på en glas slide.
- Fånga bilder av mikrodroppar genereras med hjälp av en digital mikroskop (förstoring 200X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie presenterar vi en enkel metod för generering av cellstor W / O-mikrodroppar genom användning av en kapillär-baserad centrifugal mikrofluidanordning (figur 1). Mikrofluidanordningen var sammansatt av en kapillär hållare (figur 2B), två glaskapillärer (inre och yttre glas kapillärer i fig 3C), och ett mikrorör innehållande en olja innefattande tensid. Vi injicerade 0,1 pl provlösning in i det inre glaskapillär och placerade inre glaskapillär i den yttre glas kapillär (Figur 4D). Cellstora W / O-mikrodroppar genererades genom Plateau-Rayleigh instabilitet av en sprutan-flöde av provlösningen 17 (figur 1 B) och var stabil under minst 2 h 17.
Typiska exempel på de olika storlekarna på W / O-mikrodroppar genereras från kapillären-baSED centrifugal mikrofluidikanordning visas i figur 5. Figur 5A-F visar de digitala mikroskopiska bilder och storleksfördelning histogram (n = 200) av de W / O-mikrodroppar. V / o mikrodroppar genererades med användning av en inre kapillär med en d i = 5 (A, B), 10 (C, D), eller 20 | j, m (E, F) öppningsdiameter och samtidigt hålla d o och w konstant vid 60 | j, m och 115 | j, m, respektive. Mätningarna av storleken på de genererade W / O-mikrodroppar förvärvades genom analys av mikroskopbild erhålls. För dj = 5, 10, och 20 | j, m öppningar, de genomsnittliga diametrarna hos mikrodropparna var 8,3 ^ m (standardavvikelse (SD) 0,9 | j, m, variationskoefficient (CV) 10,8%), 12,7 | j, m (SD 1,1 | im, CV 8,6%), och 17,9 ^ m (SD 1,4 | im, CV 7,8%), respektive. Dessa resultat indikerar att vi framgångsrikt erhållits monodispers W / O microdroplets av den föreslagna metoden. Vidare är de W / O-mikrodroppe diametrar var nästan densamma som den inre kapillären öppning (fig 5G). Sålunda kan den genomsnittliga storleken hos de W / O-mikrodroppar lätt avstämmas över ett brett intervall, typiskt 5 till 20 pm, med användning av mikro-enheten.
Figur 1. Översikt av centrifugal kapillär-baserade axelsymmetrisk co-flödande mikroflödessystem enheten och bildning av W / O-mikrodroppar med hjälp av enheten. (A) Illustration av centrifugal kapillär baserade axelsymmetrisk co-flödande mikroflödessystem enheten och process som genererar W / O mikrodroppar ( inom cirkeln), (B) w / o mikrodroppar genereras av Plateau-Rayleigh instabilitet av en sprutan flöde av vattenlösning 17, d i är öppningsdiameter av inre glaskapillär, d oär öppningsdiameter av inre glaskapillär, w är innerdiameter yttre kapillär, (C) Fotografera av fabricerade enhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Inställning av kapillär hållaren (A) Design av kapillär hållare tillverkad av polyacetal plast. Enheten diametrar i hållaren är mm. (B) Fotografier av innehavaren består av en övre del och en nedre del. Klicka på god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Flödesschema för mikroflödessystem enhet set-up och generering av W / O-mikrodroppar. (A) Framställning av yttre kapillär. Olja med tensider som införs i den yttre kapillär, (B) Ytter kapillär in i den nedre delen av hållaren (C) Framställning av inre kapillär: Vattenlösning drawn i en inre kapillär genom kapillaritet, (D) Inre kapillär ställa in i den övre delen av hållaren (a). Kontrollera att den inre kapillären var i det yttre kapillären med användning av en digital mikroskop (b, c), (E) Hållare med inre och yttre kapillärer installerade i provröret (a). Kontrollera att yttre kapillär hölls borta från luftolje gränssnitt (F) Slutligen prov mikrorör centrifuger av en bordsskiva sväng out-typ mini-centrifug. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Bildande av monodispersa cellstorlek W / O-mikrodroppar. Digitala mikroskop bilder och storleksfördelning histogram (n = 200) av genererade mikrodroppar med användning av kapillärer av olika diameter, d i = 5 (A, B), 10 (C, D), och 20 | j, m (E, F), (G) Korrelation mellan öppningsdiameter av glaskapillären och diametern av de genererade W / O-mikrodroppar . Felstaplar visar standardavvikelserna för diameter de genererade W / O-mikrodroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av denna enhet, monodispersa W / O mikrodroppar genererades av Plateau-Rayleigh instabilitet av en jet-flöde 17. Mikroskopisk undersökning avslöjade inte närvaron av satellitdroppar. I tillverkningen av anordningen, tre kritiska stegen är avgörande för att framgångsrikt alstra monodispersa W / O-mikrodroppar. Först, för att tillhandahålla ett rakt flöde av olja innehållande ytaktivt medel och vattenlösning, måste de kapillära hål av fyra skivor anordnas i ett koncentriskt mönster. För det andra var det inre kapillären noga insatt i den yttre kapillären, eftersom spetsen på kapillären går lätt sönder om den kommer i kontakt den övre hållaren. Denna operation kan vara svårt, så vi rekommenderar att du använder ett förstoringsglas. Slutligen, för att göra en sprutan-flöde av vattenlösning 17, positionen för den inre kapillären in i den yttre kapillären måste ställas in på w = 100-150 | im. Om storleksfördelningen av W / O-mikrodroppar genereras av centrifugal microfluidic enheten inte monodispers, kontrollera läget för den inre kapillär i den yttre kapillär. Att ändra placeringen av den inre kapillär i den yttre kapillär, vänd skruven i den övre delen av hållaren. Därigenom kan avståndet w styras exakt.
För att monodispersa W / O-mikrodroppar, finns nuvarande begränsningar. Det är svårt att öka centrifugalkraften hastigheten (vid behov), eftersom alla de experiment i studien utfördes vid den maximala centrifugal hastigheten av skrivbordet centrifugen. Dessutom är det svårt att från en mängd olika provlösningar dropp generation, begränsningen är beroende av centrifug design. Multi-pipa kapillärer som den inre kapillär kan ge de inkapslade mikrodroppar från olika kombinationer av material och lösningar 18.
Mikroflödessystem enhet har två primära fördelar jämfört med konventionella mikrokanal metoder: i) easy och robust tillverkning, och ii) kravet på endast en liten volym (0,1 | j, l) av provlösningen. För det första är tillverkningen av kapillären baserade centrifugal axelsymmetrisk sam-flödande mikrofluidikanordning enkel och robust. Endast tunna kapillärer, en kapillär hållare och ett prov mikrorör krävs. Tillverkning Tiden är 5-10 min för anordningen. Tillverkningen av anordningen tar mindre tid jämfört med tillverkningen av andra mikrofluidanordning. Dessutom är det kapillära innehavaren robust och kan återanvändas. Därför är det enda förbruknings är glas kapillärerna och prov mikrorör i enheten, vilket gör det billigare än andra mikroflödessystem. Slutligen, eftersom de olje- och vattenhaltiga flöden producerades av centrifugalkraften, det fanns ingen bortkastad volym. För 2/1 sekund, alstrar anordningen ett stort antal mikrodroppar.
Mikrodroppar är perfekta kandidater för att utföra hög genomströmning experiment med små mängder av prov Solution. Med den här enheten, är det teoretiskt möjligt att generera hundratusentals 10-um stora mikrodroppar per sekund från 0,1 ul av provlösningen. Sålunda inrymmer anordningen arbeta med dyrbara biologiska prov genom att minimera volymen av de prover som krävs för snabb kvantitativ analys. Den här enheten kan användas för att analysera biokemiska reaktioner 6-9 och encelliga enzymatiska reaktioner 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
- Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
- Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
- Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
- Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
- Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
- Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
- Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
- He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
- Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502 (2007).
- Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
- Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
- Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
- Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).
