Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

أجنة الدجاج هي أنظمة النموذج المثالي لدراسة التطور الجنيني كما يمكن إجراء التلاعب وظيفة الجين مع السهولة النسبية في البيضة. الأذن الداخلية السمعي الجهاز الحسي هو أمر حاسم لقدرتنا على الاستماع. ويضم ظهارة متخصصة للغاية الحسية التي تتكون من خلايا الشعر transducing والميكانيكية (المراكز الصحية) والمحيطة الدبقية مثل الخلايا الداعمة (المنبوذة). وعلى الرغم من الاختلافات الهيكلية في أجهزة السمع، الآليات الجزيئية التي تنظم تطوير الجهاز السمعي يتم حفظها تطويريا بين الثدييات وأفيس electroporation في البيضة محدودة إلى حد كبير في المراحل المبكرة في E1 - E3. نظرا للتطور في وقت متأخر نسبيا من الجهاز السمعي في E5، التلاعب من الجهاز السمعي بواسطة electroporation في البيضة الماضي E3 صعبة نتيجة لتطور متقدمة من الجنين الدجاج في مراحل لاحقة. الطريقة المعروضة هنا هي طريقة نقل الجينات عابرة لاستهداف الجينات في المصالح فيمرحلة E4 - E4.5 في تطوير السمعية الدجاج الجهاز الحسي عبر في البيضة-Electroporation للالصغرى. هذا الأسلوب ينطبق على gain- والخسارة من وظائف مع البلازميد التقليدية ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي ويمكن الجمع بين في البيضة مقايسة انتشار الخلايا بإضافة ايدو (5 إيثينيل-2'-deoxyuridine) إلى الجنين كله في وقت Electroporation لل. استخدام أخضر أو ​​أحمر بروتين فلوري (GFP أو طلب تقديم العروض) البلازميدات التعبير يسمح للمجرب لتحديد بسرعة ما إذا كان Electroporation للاستهدفت بنجاح الجزء السمعي في الأذن الداخلية النامية. في هذه الورقة الطريقة، يتم توضيح الأمثلة النموذجية على GFP electroporated العينات. وكان حصاد الأجنة 18-96 ساعة بعد Electroporation للواستهداف GFP إلى منطقة موالية للالحسية للجهاز السمعي ما أكده الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين. ويقدم ورقة الأسلوب أيضا على بروتوكول الأمثل لاستخدام الثيميدين التناظرية ايدو لتحليل prolif خليةeration. وتقدم مثالا للمقايسة انتشار الخلايا EDU على أساس أن يجمع المناعية وضع العلامات وانقر EDU الكيمياء.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وعلى الرغم من الاختلافات في الشكل والزخرفة الخلوية بين الثدييات والطيور الجهاز الحسي السمعي، ويعتقد أن العوامل الجزيئية ومسارات المسؤولة عن التنمية HC الحسية يجب الحفاظ تطويريا 1-3. حليمة القاعدي، الذي يضم المراكز الصحية السمعية والمنبوذة المحيطة بها، ويطور باعتبارها تجيب خارجي من الكيسة السمعية في الاذن الداخلية. في وقت مبكر على مجموعة من الأسلاف HC وSC المحدد ضمن اللوحاء أذني / أذني نطاق المختصة كوب العصبية الحسية (إس دي). توفر البيانات مصير رسم خرائط دليل على أن الأنساب العصبية والحسية ترتبط وتنشأ من NSD تقع في منطقة انتيرو بطني من الكأس أذني أو الكيسة السمعية في الفئران والدجاج 4،5. أولا، neuroblasts delaminate من NSD تثير الخلايا العصبية من العقدة-السمعية الدهليزي، الذي انشق في نهاية المطاف إلى العقد السمعي والدهليزي. هذه الخلايا العصبية يعصب المراكز الصحية الحسية في الأذن ونوى الداخلية في الدماغ. الخلايا عشرفي البقاء في مديرية الأمن القومي ويعتقد أن تثير مختلف بقع الحسية، بما في ذلك الجهاز الحسي السمعي، ويتألف من المراكز الصحية الحسية transducing والميكانيكية والمنبوذة المرتبطة بها.

في كل فرخ والفئران، الجهاز السمعي الحسي السلف خروج دورة الخلية وHC التمايز يحدث في معارضة التدرجات. في الفرخ، السلف السمعي-دورة الخلية خروج يبدأ حول ~ E5 وتقدم من القاعدة إلى القمة، ومن المركز إلى المحيط 6. في وقت لاحق يوم واحد، يبدأ HC التمايز في قمة وتقدم إلى قاعدة 7. دراسة تطوير الأذن الداخلية في الدجاج يوفر العديد من المزايا التقنية كما يمكن التحقيق الآليات الوظيفية مع السهولة النسبية في البيضة بدلا من التلاعب الأجنة في الرحم في نظم نموذج أخرى، الأمر الذي يتطلب عملية جراحية معقدة. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم في البيضة Electroporation للالجزئي لاستهداف الجينات في المصالح في باسيلا الظنيص منطقة حليمة الأمامي-البطني في الحويصلة الأذنية على وجه التحديد في E4.

Electroporation للفي البيضة هو الاسلوب الذي راسخة وتستخدم عادة 8-14. ويستند مبدأ أسلوب Electroporation للفي حقيقة أن النيوكليوتيدات (على سبيل المثال، البلازميد، الحمض النووي الاصطناعي، أو الحمض النووي الريبي [أليغنوكليوتيد) واتهم سلبا. يتم حقن الحمض النووي في الأنسجة من الاهتمام. عندما يتم وضع التيار الكهربائي في جميع أنحاء الأنسجة، والتيار يفتح مسام عابرة في جدران الخلايا ويسمح لامتصاص الحمض النووي، كما يتدفق الحمض النووي سالبة الشحنة نحو القطب الموجب (الأنود). للتجارب مكاسب من وظيفة، وsubcloned جينات الفائدة عادة إلى التعبير البلازميدات التي تحتوي على أشرطة التعبير المناسبة للبروتين أخضر فلوري (GFP) أو بروتين أحمر فلوري (RFP). لفقدان وظيفة من التجارب القائمة على البلازميد المهيمنة يبني السلبية كاظمة، أو رني، أو يبني morpholino هم جتستخدم ommonly 15،16. لمنع الرنا الميكروي (ميرنا) وظيفة miRNAs يبني الاسفنج، التي عادة ما تكون البلازميد مقرها، ويمكن استخدامها 17. يسمح الطريقة هنا وصف للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تتحكم في انتشار والتمايز في الجهاز السمعي، كما في البيضة طريقة Electroporation للالصغيرة يمكن الجمع بسهولة مع البيضة في فحص تكاثر الخلايا بإضافة EDU إلى الجنين كله.

يتم تنفيذ Electroporation للوإضافة ايدو في E4 في الحويصلة الأذنية، الذي هو قبل يوم واحد من بداية خروج دورة الخلية في الجهاز السمعي. تحليل الجهاز السمعي هو عادة يؤديها 18-96 ساعة بعد Electroporation للفي E5 (بداية من السلف الحسي خروج دورة الخلية)، E6 (بداية التمايز HC)، وE7 (خلال التمايز HC)؛ وفي وقت لاحق إلى ~ E9 (نهاية التمايز HC). هذه الطريقة Electroporation للنقل الجين هو عابر دائم تقريبا ~ 4 أيام، becau حدحد ذاته جينات الفائدة لا الاندماج في الجينوم، ولكن الأسلوب هو المعمول به للاستخدام مع البلازميد المناسب ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي، التي لا تملك القدرة على الاندماج في الجينوم، مثل نقل الجينات بوساطة Tol2-11. مع هذا الأسلوب GFP قوي أو التعبير طلب تقديم العروض يستمر ~ 4 أيام في القوقعة، وبعد ذلك نشير إشارات تتلاشى، بعد توفير نافذة متسع من الوقت لدراسة تطوير معقدة من الجهاز السمعي. هذا في البيضة طريقة نقل الجينات هي رواية ويسمح خصيصا لاستهداف الجهاز السمعي المفترض في E4، الذي هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على التنمية HC في الجهاز السمعي. بل هو إضافة جيدة إلى الطرق البديلة، التي electroporate في مراحل نمو أصغر من ذلك بكثير 11،12 أو بالمقارنة مع استخدام في المختبر الحليمات القاعدي الثقافات يزدرع 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تتم رعاية البيض والأجنة لم يفقس لومعاملة أخلاقية وإنسانية. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات للاستخدام الجنين لم يفقس من قبل رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في كلية جونز هوبكنز للطب في بالتيمور بولاية ماريلاند.

1. البيض وإعداد التركيبات التعبير

  1. بيض:
    1. احتضان 3-4 عشرات المخصبة بيض الدجاج (جالوس جالوس) الاستلقاء على جنوبهم عند 37 درجة مئوية.
      1. بعد 24 ساعة من الحضانة، وسحب 3 سم مكعب من زلال مع حقنة من النهاية الخلفية وإيابا للبيضة واغلاق فتحة مع الشريط واضح. وهذا يخلق غرفة الهواء بين الجنين وقشر البيض، والسماح لسهولة الوصول إلى الجنين دون الجنين التمسك قذيفة عند قطع نافذة للوصول على أعلى من البيض 19.
      2. في 117 ساعة من وقت الحضانة، مرحلة الأجنة وفقا للهمبرغر وهاميلتون 20 مراحل النموفي E4 (HH24-25) (انظر الشكل 1D).
  2. بنيات التعبير:
    1. إعداد البلازميد باستخدام الكواشف وبروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للإعداد ملف المتاحة تجاريا. في الخطوة الأخيرة من الإعداد، أزل الحمض النووي في 500 ميكرولتر TE (تريس، EDTA) العازلة المنصوص عليها في عدة في أنبوب 1.5 مل.
    2. الايثانول ترسيب الحمض النووي على التركيز من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم و 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب. وضع أنبوب في -20 درجة CO / N.
    3. أنبوب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة في RT. حل بيليه في المخزن TE 15 ميكرولتر، والتي ينبغي أن تسفر عن تركيز ~ 4 ميكروغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: التحكم بنيات التعبير المستخدمة هنا هي pMES-IRES-GFP 10، التي يقودها المروج الدجاج β-الأكتين، أو PCI-H2B-IRES-طلب تقديم العروض CMV.

2. الدجاج في البيضة الصغيرة Electroporation للوفي البيضة تكاثر الخلايا الفحص

  1. في البيضة الصغيرة حقن تعبيد التعبير والصغرى Electroporation لل:
    1. سحب أنابيب زجاجية الشعرية إلى إبر رفيعة باستخدام مجتذب ماصة الجزئي مع المعلمات الأمثل التالية ل2.5 × 2.5 ملم مربع البلاتين التدفئة الشعيرة: الضغط = 500، الحرارة = 600 ° C، سحب = 64، السرعة = 105، والوقت = 150 مللي ثانية (انظر الجدول 1).
    2. إعداد واليسارية ومراحل مناور الصغيرة اليد اليمنى المرافقة المجهر (انظر الشكل 1A). وتتلاعب الدقيقة اليد اليمنى يحمل الزجاج الشعرية الإبرة وتتلاعب الدقيقة أعسر يحمل أقطاب (الشكل 1A).
    3. تحضير الزجاج الشعرية إبرة سحب ناعما لحقن الجزئي عن طريق خفضغيض من الإبرة مع ملقط بينما تعمل تحت المجهر.
    4. شغل الإبرة يدويا باليد باستخدام مناور الصغير مع 2.5 ميكرولتر من البلازميد ملون مع 0.1٪ سريع الخضراء بينما كان يعمل تحت المجهر.
    5. وضع البيض ملقاة على جانبها داخل جهاز العفن / بيضة عقد (انظر الشكل 1A). قطع نافذة مستديرة حول الجزء العلوي من البيضة باستخدام مقص 19 (الشكل 1A).
    6. بينما كان يعمل تحت المجهر، وفتح بعناية الأغشية اثنين تتراكب الجنين باستخدام ملقط.
    7. بينما كان يعمل تحت المجهر، وتقديم ما يقرب من ~ 0.5 ميكرولتر من البلازميد إلى اليمين تجويف الحويصلة الأذنية عن طريق الحقن الصغيرة يدويا باستخدام اليد اليمنى باستخدام تتلاعب الدقيقة وElectroporation للالصغيرة.
      1. للقيام بذلك، والصغرى حقن الأيمن تجويف الحويصلة الأذنية مع الحمض النووي مع اليد اليمنى الدقيقة مناور (الشكل 1B-D) في الوقت نفسه باستخدام على holdin الأيسرالجا forcep لتحقيق استقرار رأس الجنين، لأن رأس الجنين الانخفاضات في مرحلة E4. لا الجزئي حقن-الماضي تجويف الحويصلة الأذنية، لأن هذا سيضر الحويصلة الأذنية.
      2. مباشرة بعد الحقن الصغيرة، بينما كان يعمل تحت المجهر، واستخدام اليسار اليد الصغيرة مناور لوضع إيجابي (الأنود) 2 مم البلاتين القطب الأمامي بطني إلى الحويصلة الأذنية اليمنى والسلبية القطب 2 مم (الكاثود) بالتوازي 1 مم وبصرف النظر (انظر الشكل 1 C). تسليم 4 البقول بنسبة 12 V مع 100 ميللي ثانية مدتها و 200 تباعد مللي ثانية. تخدم الحويصلة الأذنية ترك كعنصر تحكم غير المعالجة الداخلية.
        ملاحظة: تنظيف الأقطاب بين electroporations مع مسحة ذات الرؤوس القطن مغموسة في برنامج تلفزيوني 1X.
  2. في البيضة تكاثر الخلايا الفحص:
    1. مباشرة بعد Electroporation للإضافة 50 ميكرولتر من 0.25 ملغ / مل ايدو في برنامج تلفزيوني 1X بإسقاط EDU حل 50 ميكرولتر يدويا على وجه العمومالجنين في البيضة باستخدام ماصة. ختم البيض مع الشريط والعودة إلى الحاضنة لمدة 18-96 ساعة.
    2. بعناية إزالة الشريط والتحقق من الأجنة لGFP الفلورسنت أو إشارة طلب تقديم العروض داخل الحويصلة الأذنية بعد 18 - 24 ساعة باستخدام المجهر الفلورسنت القياسية (انظر الشكل 1 EE). إذا إشارة الفلورسنت الحالية، في هذه المرحلة حصاد الأجنة للتحليلات أو ختم مع الشريط وإعادته إلى حاضنة للحصاد والتحليلات في مراحل لاحقة (انظر الشكل 1 FP '').
      ملاحظة: التعبير عن إشارة GFP مع بناء pMES-IRES-GFP هو واضح 6-7 ساعة بعد Electroporation لل10.

حصاد 3. الأجنة ومعالجة الأنسجة لRNA في الموقع التهجين والمناعية

  1. حصاد الأجنة باستخدام ملقط. شطف الجنين في 1X PBS الباردة. إزالة رؤوس الأجنة، عن طريق قطع الرأس عنقهباستخدام ملقط، ووضع رؤساء إلى 4٪ امتصاص العرق O / N عند 4 درجات مئوية. ثقب الدماغ باستخدام forcep للسماح للتغلغل في امتصاص العرق 4٪ داخل الرأس.
  2. يذوى رؤساء في 30٪ سكروز (في برنامج تلفزيوني 1X) O / N عند 4 درجات مئوية.
  3. جبل رؤساء في وسط واق من البرد قبل التجميد السريع في الطين من الثلج الجاف وmethylbutane (2-Methylbutane). بدلا من ذلك، سريعة تجميد رؤساء في وسط واق من البرد مع النيتروجين السائل. تخزين رؤساء شنت في -80 درجة مئوية.
  4. Cryosection رؤساء إلى 12 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة وجمع كل أقسام الأنسجة التي تحتوي على الأذن الداخلية على شرائح المجهر الزجاجية superfrosted.
  5. أداء RNA القياسية في الموقع التهجين والمناعية كما هو موضح سابقا 4،21، وتحليل لتكاثر الخلايا ايدو بعد بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمجموعة.
    ملاحظة: يمكن التعرف على خلايا الشعر باستخدام الأرنب بولكلونل α-MyosinVIIa (Myo7a) لtibody (1: 1000، بروتيوس العلوم البيولوجية) والضد الثانوية fluorescently المسمى (1: 250، الماعز المضادة للأرنب AlexaFluor 488؛ إينفيتروجن).

4. التقاط الصور والمعالجة

  1. التقاط صور مع معدات التصوير الرقمية. النتائج صورة المناعية مع المجهر ونتائج في الموقع باستخدام المجهر واسعة المجال القياسية (التي تتراوح بين 5X إلى 40X في التكبير) الفلورسنت القياسية.
  2. معالجة الصور باستخدام برامج معالجة الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا الحمض النووي طريقة رقة البلازميد التي تتكون من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أشرطة التعبير استهدف في الدجاج تطوير حليمة القاعدي (BP) مع المعلمات الأمثل من 12 فولت و 4 البقول مع 100 مدة النبضة ميللي ثانية وفترات من 200 ميللي ثانية، مما أسفر عن ~ 50٪ معدل البقاء على قيد الحياة الجنين والكفاءة البلازميد الحمض النووي تستهدف في BP. وأظهر التصوير فلوري التعبير GFP الأصلي في تطوير الأجنة هذا الأسلوب من Electroporation لليستهدف بشكل تفضيلي الجانب الأمامي-بطني من الكيسة السمعية، التي تؤدي إلى BP (EE الشكل 1 '؛ السهم الأبيض)، ويمكن أن يتبع التعبير GFP خلال دورة الوقت تصل إلى ما يقرب من ~ 4 أيام (الشكل 1 EH). تم استخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين (ISH) لتحديد ما إذا كان Electroporation للاستهدفت بنجاح الجزء السمعي في الأذن الداخلية النامية. لتحديد ما إذا اتخذ GFP بنسبة السمعيةالأسلاف الحسية، وقد أجريت التجارب ISH على المقاطع BP المجاورة. داخل تم تحديد وضع BP الأسلاف الحواس عن طريق التعبير عنها من Sox2 (الشكل 1 K و N) وجماعات متطرفة مجنونة (Lfng) (الشكل 1 J). وتبين هذه التجارب أن الأسلاف الحسية في جميع أنحاء BP النامية، كما هو مبين في قاعدة (الشكل 1 الأول؛ قوس الأسود) وقمة (الشكل 1 لتر، قوس الأسود)، استهدفت بنجاح والتعبير عن GFP بعد 68 ساعة من Electroporation لل(الشكل 1 أنا وL، بين قوسين السوداء). وبالإضافة إلى ذلك، أعرب عن GFP خارج نطاق الحواس في الخلايا الظهارية غير الحسية (الشكل 1 أنا وL، السهام الحمراء) وفي العقدة السمعية (الشكل 1I ولام؛ AG، الأسهم الصفراء) تميزت التعبير Neurod1 (الشكل 1M) . في GFP تجربة نموذجية (الشكل 1 H)؛ وهذا يسمح للمحقق لتحليل النمط المكاني والزماني للسلف الحسي الانسحاب دورة الخلية والتمايز في BP النامية. لتحديد السلوك التكاثري الأسلاف الحسية، تم إضافة EDU الثيميدين التناظرية في وقت Electroporation للفي E4. وبعد أربعة أيام، تم تحليل EDU التأسيس في BP النامية في أقسام الأنسجة باستخدام "فوق" الكيمياء. وقد استخدم المناعية وضع العلامات للبروتين-HC محدد MyosinVIIa (Myo7a) لتحديد المراكز الصحية التفريق في BP النامية. في الجزء القمي من BP Myo7a كانت + المراكز الصحية في كثير من الأحيان ايدو + (الشكل 1 PP؛ P ''، والسهام البيضاء)، في حين أن عدد قليل فقط Myo7a + المراكز الصحية أدرجت في قاعدة ايدو (الشكل 1 OO '؛ O' '، السهام البيضاء)، مما يشير إلى أنه في وقت من إضافة ايدو في E4، الموالية الحسيgenitors في قاعدة بالفعل نشر إلى حد كبير الإنقسامية. هذه النتائج تؤكد الدراسات السابقة في معارضة التدرجات خروج دورة الخلية وHC التمايز في فرخ BP 6،7.

الشكل 1
الشكل 1. في البيضة Electroporation للوفي البيضة خلية انتشار الفحص. (AD) صور Brightfield من طريقة Electroporation لل. وفي البيضة حقن الصغيرة في الحويصلة الصحيحة الأذنية (ب) ووضع أقطاب كهربائية بعد الحقن الصغيرة التي تستهدف المنطقة الأمامي بطني في الحويصلة الأذنية (C). الجنين في مرحلة HH24-25 بعد الحقن الصغيرة و electroporation (دال؛ الحويصلة الأذنية الخضراء، السهم الأسود). (EH) البروتين الفلوري الأخضر (GFP) التعبير بعد Electroporation لل. ( (E ') التعبير GFP في 18 ساعة (الحويصلة الأذنية، السهم الأبيض). وتشير (FH) السهام البيضاء في التعبير GFP في 40 ساعة (F، الحويصلة الأذنية)، 68 ساعة (G، BP)، وفي 88 ساعة (H، BP). (IN) المجاورة قوقعة الأنسجة أقسام BP بحثها عن GFP، النصوص Lfng، Sox2، وNeurod1 من الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين في 68 ساعة. Lfng (J، قوس الأسود) وSox2 (K وN، قوس الأسود) بمناسبة ظهارة حسية وNeurod1 (M) تمثل العقدة السمعية (AG). وأعرب عن GFP داخل الحسية (I و قوس الأسود) والأنسجة غير الحسية (I و السهام الحمراء)، ولالعقدة uditory (I و الأسهم الصفراء). (OP '') الصور فلوري من MyosinVIIa (Myo7a) / ايدو وضع العلامات. (يستهلكون-O '' وP'-P '') تكبير أعلى من O و P. (يا وP ') عن EDU الوسم موجود داخل الظهارة الحسية في قمة (P'، قوس أبيض) من على قاعدة (O '، قوس أبيض). O' 'وP' ') مدموجة الصور الفلورسنت، وتشير السهام البيضاء إلى Myo7a (+) / ايدو (+) خلايا الشعر في قمة (P '') وقاعدة (O ''). المزيد من الخلايا ايدو (+) موجودة ضمن العقدة السمعية في قمة (P، AG) من على قاعدة (O، AG). (الكيس، الكييس في O). (A، الأمامي والخامس، بطني في لوحات B وE). على نطاق ويمنع 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم تحسين طريقة هنا وصف للفي البيضة Electroporation للالصغيرة للنقل الجينات في الجهاز السمعي النامية. وهو متوافق مع البلازميد ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي عادة ما تستخدم للتلاعب وظيفة الجين / التعبير. توقيت Electroporation للفي E4 هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على التنمية HC في الجهاز السمعي. الخطوات الأكثر أهمية والصغيرة عن طريق الحقن، والحمض النووي في تجويف الحويصلة الأذنية دون الذهاب عميقة جدا مع الإبرة وإلحاق أضرار الحويصلة الأذنية (انظر الشكل 1A-D)، واستهداف الحمض النووي في المجال الأمامي بطني من الحويصلة الأذنية من قبل وضع الأقطاب وفقا لذلك (انظر الشكل 1C)، وتقديم المعلمات Electroporation للالأمثل من 4 البقول في 12 V. هذه هي الأمثل المعلمات Electroporation للوالأمثل تركيز الحمض النووي البلازميد (~ 3،5-4 ميكروغرام / ميكرولتر) لتستهدف على وجه التحديد السمعية الظني عضو في E4. في البداية بدأنا سالتحرير إجراء electroporations في 6 V، والتي أسفرت عن أي إشارات الفلورسنت. وقد زادت الجهد تدريجيا باستخدام 8 V و 10 V، مع 12 فولت يكون الأمثل. وبالمثل، فإن عدد النبضات لتقديم وتم الأمثل فترات النبض وتباعد من البقول. في 12 فولت، 4 البقول مع 100 ميللي ثانية مدتها و 200 تباعد مللي ثانية مثالية. هذه المعايير ليست فقط مثالية للحصول على نقل الجينات كفاءة في E4، ولكن هي أيضا مثالية لمعدل البقاء على قيد الحياة الجنين حوالي ~ 50٪. إذا تم الحصول على أي إشارة الفلورسنت خلال 24 ساعة من Electroporation لل، ينبغي النظر في ما يلي: 1.) تأكد من أن تركيز الحمض النووي البلازميد هو لا يقل عن 3.5 ميكروغرام / ميكرولتر. 2.) ضبط المعلمة Electroporation للبنسبة 2 V، على سبيل المثال إلى 10 أو 14 V. والحصول على أجنة E4 HH24-25) المرحلة (ضمن 117 ساعة من فترة حضانة (انظر الشكل 1D)، ودرجة الحرارة حاضنة للبيض يجب أن يكون الأمثل بين 37-39 درجة مئوية مع أكثر أو أقل ساعات من incuالوقت bation حاجة من 117 ساعة تبعا لدرجة الحرارة المستخدمة، لأن هناك اختلافات في عقد وتشغيل درجات الحرارة باستخدام حاضنات مختلفة بين المختبرات المختلفة. النظير ثيميدين مختلفة بما في ذلك BrdU (5-برومو-2'-deoxyuridine) أو EDU يمكن استخدامها لدراسة في تكاثر الخلايا البيضة. ومع ذلك، فإن استخدام إما مركب أن يكون الأمثل لكل مرحلة تنموية كالكثير من مجمع يثبت السامة لبقاء الخلية / جنين والقليل جدا من مجمع يثبت غير فعالة. ويصف هذه الطريقة استخدام الأمثل من ايدو في تركيز 0.25 ملغ / مل تطبيقها إلى 50 ميكرولتر على الجنين كله في البيضة خصيصا لدراسة تكاثر الخلايا والخلية دورة والخروج من E4 فصاعدا.

electroporation في البيضة كوسيلة من وسائل التلاعب الجيني لديه بعض القيود. وثمة حاجة إلى عدد كبير من البيض النسبي لelectroporations في E4 مع بنيات المراقبة المناسبة ولexperimentaشروط لتر. ويرجع ذلك إلى نسبة من البيض، ما يقرب من ~ 27٪، ويجري غير صالحة للاستعمال ل electroporation نتيجة لمزيج من عدم الإخصاب، عيوب التنموية، وفاة الجنين. عامل مهم آخر للنظر هو معدل البقاء على قيد الحياة من الأجنة بعد Electroporation لل. معدل البقاء على قيد الحياة حوالي ~ 50٪. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الأجنة القديمة في E4 لا البقاء على قيد الحياة بشكل جيد بعد أن تلاعب ذلك؛ الأجنة الأصغر سنا أكثر مرونة وتتسامح يجري التلاعب بها أفضل. التعبير عن جينات الفائدة بعد Electroporation للفي E4 هي التنسيق ومحلية في جميع أنحاء القناة قوقعة بأكمله بما في ذلك الأنسجة غير الحسية والحسية، وكذلك العقدة السمعية. والسبب في هذا التعبير أكثر التنسيق والمكان هو لأن الهدف من Electroporation للهو مفترض، متخلفة الجهاز السمعي في E4، قبل أن يبدأ الجهاز السمعي الدجاج للتخلص في E5 ويستطيل في شكله على شكل المنجل المميزة التي كتبها ~ E9 1 . وأخيرا، الطريقة البريد عابرة حيث تبقى إشارات التعبير فقط ل~ 4 أيام، لأن الجينات الفائدة المستخدم هنا لا الاندماج في الجينوم. ومع ذلك، فإن الطريقة يمكن استخدامها مع القائم على البلازميد بنيات التعبير المناسبة التي لا تملك القدرة على الاندماج في الجينوم.

اتقان طريقة Electroporation لليتطلب بعض الممارسة والعينين واليدين المدربين، والخبرة في العمل مع أجنة الدجاج. المراجع المقدمة للتنمية الأذن الداخلية والدجاج الأطالس التنموية بمثابة أدلة جيدة وهي نقطة انطلاق جيدة للمبتدئ. بعد اتقان طريقة مع هذه المعلمات Electroporation للالأمثل، ويمكن استخدام الأسلوب من التلاعب في الحويصلة الأذنية مغلقة من E2 إلى ~ E4.5. على الرغم من أن لelectroporating في E2 و E3، وينبغي أن تستخدم 10 V بدلا من 12 خامسا ل electroporation في E1 التي تستهدف اللوحاء أذني والكأس أذني، أسلاك البلاتين مخصصة مع المعلمات Electroporation للتعديل يمكن استخدامها 8-10. بالإضافة إلى دراسة تطوير الجهاز السمعي يضفي أيضا هذه الطريقة نفسها لدراسة تطوير التعصيب العقدة السمعية. وكشف تحليل التعبير GFP في عينات electroporated التي تستهدف على وجه التحديد الحويصلة الأذنية الأمامي بطني لا يستهدف فقط المجال الحسي داخل المختصة (مديرية الأمن القومي) ظهارة-العصبية الحسية ولكن أيضا يستهدف السكان الخلايا العصبية الموجودة داخل مديرية الأمن القومي. الخلايا العصبية وارد التعصيب الأجهزة الحسية الدهليزي والسمعية هي في المقام الأول من أصل placodal أذني. يحدث تكوين الخلايا العصبية على مدى فترة زمنية طويلة ما يقرب من ~ E1.5 - E4.5 في الفرخ، حيث neuroblasts، تمر تكاثر الخلايا مكثفة delaminate باستمرار من ظهارة NSD من الكأس أذني (~ E1.5) والحويصلة الأذنية (~ E2.5 - E4.5) وملء كما تمييز الخلايا العصبية العقدة-القوقعة الدهليزي (CVG، الثامن العصب القحفي) 8،10،13،22.

وعلاوة على ذلك، مع بعض التعديلات أجهزة الدهليزي يمكن أن تستهدف مع الطريقة المعروضة. على سبيل المثال، عرف الأمامي المفترض أن تكون مستهدفة في E3، التي تقع على الطرف الأمامي الظهري من NSD الأمامي بطني 9. Electroporating في E4 استهداف عوائد الحويصلة الأذنية الأمامية-بطني التنسيق تعبيرات GFP نسخة ولكن قوية داخل الأنسجة الحسية وغير الحسية في كل من أجهزة الدهليزي الحسية، وهي أعراف، وutricluar وبقع الكيسي (لا تظهر البيانات).

وفي الختام، وطريقة البيضة في المقدمة هنا هي محددة لإجراء تحقيق مكاسب وخسائر الوظائف ابتداء من الساعة E4 ولدراسة انتشار والتمايز في تطوير الدجاج الجهاز السمعي. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن تكييفها بسهولة لدراسة الآخر فينير الأذن الظواهر التنموية، بما في ذلك الخلايا العصبية في الاذن الداخلية، وتطوير أجهزة الدهليزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الدكتور دوريس ك وو لالبلازميدات التعبير وفي تحقيقات الموقع، ومركز جامعة جونز هوبكنز للمنشأة الأحياء التصوير الحسي ومركز السمع والتوازن. وأيد هذا العمل من قبل NIDCD غرانت T32 DC000023 جنيه

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى Electroporation لل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter