Abstract
鸡胚胎是研究胚胎发育为基因功能的操作可以与卵内相对容易地进行理想模型系统。内耳听觉感觉器官是我们听到的能力至关重要。这房子是由机械力转导毛细胞（HCS）一个高度专业化的感觉上皮和周围神经胶质样支持细胞（SCS）。尽管在听觉器官的结构差异，调节听觉器官的发展的分子机制的哺乳动物和禽类动物之间是进化保守的。在卵内电穿孔在很大程度上限制为E1的早期阶段- E3。由于在E5听觉器官的相对发展较晚， 在OVO电过去E3听觉器官的操作由于鸡胚在稍后阶段先进的开发都很难。这里介绍的方法是一种用于在靶向的目的基因瞬时基因转移方法阶段E4 -通过卵内的微电E4.5在显影鸡听觉感官。这种方法适用于GAIN-和失功能与常规质粒基于DNA的表达载体，可与卵细胞增殖试验通过在加入的EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）的全胚胎被组合电的时间。使用绿色或红色荧光蛋白（GFP或RFP）表达质粒可以让实验者快速确定是否电针对成功发展内耳听觉部分。在该方法中纸张，GFP电穿孔样品的代表性实例示出;胚胎收获18 -电后96小时和听觉器官的亲感觉区GFP的目标是通过RNA原位杂交证实。该方法本文还提供了使用胸苷的优化协议模拟的EdU分析细胞prolif关合作;提供结合免疫标记，然后点击的EdU化学基于的EdU细胞增殖试验的一个例子。
Introduction
尽管在形态和哺乳动物和鸟类听觉感觉器官之间的差异的蜂窝图案，分子因素和负责感官HC发展途径被认为是进化上保守的1-3。基底乳头，里面听觉碳氢化合物及其周围旺，发展为内耳听囊的outpocketing。早期HC和SC祖细胞的池耳placode /耳杯的神经感官能力的域（NSD）内指定。命运映射数据提供证据表明，神经元和感官谱系被链接，并从设在耳杯的前-腹侧区域或在小鼠和鸡4,5-听囊的NSD出现。首先，成神经细胞从NSD脱层到产生听觉前庭神经节，最终分裂成听觉和前庭神经节的神经元。这些神经元支配内耳和原子核在脑干的感觉碳氢化合物。细胞届在保持在NSD被认为会引起各种感觉补丁，包括听觉感觉器官，由机械性传感感官碳氢化合物及其相关的SC的。
在鸡和鼠两个，听觉器官感觉祖细胞周期退出和HC分化发生在相反的梯度。在小鸡，听觉祖细胞周期出口开始围绕〜E5和从基部到顶点的进行，并且从中心到周边6。一天后，HC分化开始在顶点和前进到基座7。在鸡研究内耳的发展提供了许多技术优点的功能机制可以在相对 于在子宫内的其他模型系统，这需要复杂的手术操纵胚卵内相对容易进行调查。这里所描述的方法使用在卵内的微电靶向感兴趣的基因中的推定basila- [R乳头区前，在腹侧在专门的E4耳泡。
电穿孔卵内是很好地建立和常用8-14的技术。电穿孔技术的原理是基于这样的事实，核苷酸（ 例如，质粒DNA，合成DNA或RNA寡核苷酸）被带负电荷。将DNA注射到感兴趣的组织。当电流被置于穿过组织，目前在细胞壁打开瞬态孔，并允许该DNA的摄取，因为带负电荷的DNA的朝正电极（阳极）流动。对于增益的功能的实验中，感兴趣的基因通常亚克隆到包含绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）适当的表达盒的表达质粒。对于失功能实验基于质粒的显性负阻抑构建体，或RNAi，或吗啉代构建体是Commonly使用15,16。以抑制微小RNA（miRNA）的函数的miRNA海绵结构，这是典型的质粒基于，可以使用17。在这里描述的方法允许调查控制细胞增殖和分化的听觉器官的分子机制，因为卵内的微电穿孔法可以很容易地与卵内细胞增殖试验加入的EdU整个胚胎相结合。
在电穿孔和另外埃杜是在E4在耳泡，这是细胞周期退出的听觉器官发病的前一天进行。听觉器官通常进行18分析 - （HC分化过程中）96小时电穿孔后在E5（感官祖细胞周期出口的发病），E6（HC分化的开始），和E7;后来高达〜E9（HC分化的终点）。这种基因转移的电穿孔法是短暂持续大约〜4天，becau本身的兴趣的基因不整合到基因组中，但该方法适用于具有适当的质粒DNA为基础的表达载体，其是有整合到基因组中，如TOL2介导的基因转移11的能力使用。用这种方法强大的GFP或RFP表达持续〜4个天耳蜗，在此之后的信号褪色，但提供了充足的时间来研究听觉器官的复杂发展。这在卵基因转移方法新颖，允许专门针对在E4假定的听觉器官，这是最佳的，专注于HC发展的听觉器官调查。这是一个很好的补充替代方法，这在电穿孔更加年轻的发育阶段的11,12或相比，使用体外基底乳头外植体培养18。
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Protocol
鸡蛋和未孵化的胚胎关心和道德和人道待遇。对于未孵化的胚胎使用的所有协议是由动物护理和使用委员会在医药，马里兰州巴尔的摩的约翰霍普金斯大学医学院的批准。
1.鸡蛋和表达结构的制备
- 蛋：
- 孵育3 - 4打受精鸡蛋（ 鸡内金 ）趴在其两侧平在37℃。
- 后培养24小时，拉3立方厘米蛋白与来自蛋的圆形后端的注射器和密封用透明胶带的孔中。这产生胚胎和蛋壳之间的空气室，从而允许易于接近胚胎无胚胎切割的窗口上的蛋19的顶部检修时粘到外壳的。
- 在孵化时间117小时，按照汉堡和汉密尔顿20发育阶段阶段胚胎在E4（HH24-25）（参见图1D）。
- 孵育3 - 4打受精鸡蛋（ 鸡内金 ）趴在其两侧平在37℃。
- 表达构造：
- 准备使用试剂的质粒DNA并用市售制剂试剂盒的制造商提供的协议。在制备的最后步骤，洗脱DNA进500微升TE液（Tris-EDTA）缓冲设置在试剂盒中到1.5毫升管。
- 乙醇沉淀通过加入3M乙酸钠的50微升和1ml 100％乙醇的到管集中它的DNA。放置管在-20℃CO / N。
- 离心反应管30分钟，在4℃下14,000rpm下。除去上清液并空气干燥沉淀在室温10分钟。溶解在15微升TE缓冲液将沉淀，这应该产生〜4微克/微升的浓度。
注：此处使用的对照表达构建体是机动设备-IRES-GFP的 10，它是由一个鸡β肌动蛋白启动子驱动，或PCI-H2B-IRES-RFP
2.鸡卵类微型电穿孔和在卵细胞增殖试验
- 在表达构建和微电的大毛微注射：
- 使用微吸管拉出器与一个2.5×2.5 2mm的盒铂加热灯丝下面优化参数拉玻璃毛细管成细针状：压力= 500，分组= 600℃，拉= 64，速度= 105，和时间= 150毫秒（ 见表1）。
- 成立了左和右手微操纵阶段侧翼显微镜（参见图1A）。右手微型机器人拥有玻璃毛细管针和左手微机器人保持电极（ 图1A）。
- 准备拉细玻璃毛细管针显微注射切割而在显微镜下工作的针用钳子的前端。
- 使用微机械手与质粒DNA 2.5微升含0.1％固绿着色显微镜下工作时用手手动填充针。
- 放置蛋一个模具/蛋保持装置内侧躺着（ 见图1A）。切使用剪刀19（ 图1A）的鸡蛋顶端圆窗。
- 而在显微镜下工作，小心地打开两个膜覆盖使用镊子胚胎。
- 而在显微镜下工作时，通过微注射递送约〜0.5微升质粒DNA到右侧耳泡腔用右手通过使用显微操作和通过微电手动。
- 这样做，而在同一时间使用左手牵着与用右手的微操纵器（ 图1B-D）的DNA微注射右耳泡腔GA钳子稳住胚胎的头，因为胚胎的头逢低在舞台E4。不要微以往注入耳泡腔，因为这会损害耳泡。
- 微注射后立即，同时在显微镜下工作，可以使用左手的微机械手放置的正极（阳极）2毫米的铂金电极前腹向右耳泡和并联负2毫米电极（阴极）相距1毫米（ 见图1 C）。提供4个脉冲在12 V与100毫秒的持续时间和200毫秒间隔。左耳泡用作内部未处理的对照。
注：在1X PBS蘸棉签电穿孔的清洁电极。
- OVO中的细胞增殖试验：
- 立即电穿孔后加入50微升的0.25毫克/毫升的EdU在1×PBS中由50微升的EdU溶液手动放置到全胚胎卵内使用移液管。密封该鸡蛋用胶带，并返回到培养箱中18 - 96小时。
- 小心地取下胶带并检查后，18耳囊中荧光GFP或RFP信号胚胎-使用标准的荧光显微镜24小时（ 见图1 EE'）。如果荧光信号存在 ，在这一点上收获胚胎分析或用胶带重新密封，并将其返回到培养箱中收获和在稍后阶段分析（ 见图1 FP''）。
注： -电10 7小时后GFP信号与机动设备-IRES-GFP表达构造6是显而易见的。
3.胚胎收获和组织处理的RNA原位杂交和免疫组化
- 收获使用镊子的胚胎。冲洗冷1X PBS胚胎。取出胚胎的头，通过它的脖子割头使用镊子，然后将头到4％多聚甲醛O / N在4℃。使用钳子以允许头部内的4％多聚甲醛的渗透穿刺大脑。
- 脱水30％蔗糖的头（在1X PBS）O / N在4℃。
- 通过快速冷冻在干冰和甲基丁烷（2-甲基丁烷）的浆料在安装中冷冻保护头。另外，快速冻结元首在用液态氮冷冻保护网上平台。在-80℃保存安装头。
- 冷冻切片头到12微米厚的组织切片，并收集所有的内部含有耳组织切片上superfrosted显微镜载玻片上。
- 执行原位杂交和免疫组织化学标准RNA如前所述4,21，和分析的EdU细胞增殖以下由该试剂盒的生产商提供的协议。
注：毛细胞可以用多克隆鉴定α-MyosinVIIa（MYO7A）的tibody（1：1000，变形杆菌Biosciences公司）和荧光标记的第二抗体（1：250，山羊抗兔AlexaFluor 488; Invitrogen）中。
4.图像捕捉和处理
- 采取与数字影像设备的图像。图像免疫结果与标准荧光显微镜和使用标准宽视场显微镜（从5倍到40倍的放大倍率） 的原位的结果。
- 处理使用图像处理软件的图像。
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Representative Results
在这个自由绿色荧光蛋白的方法纸张质粒DNA（GFP）的表达盒被定位到显影鸡基底乳头（BP）与与100毫秒脉冲持续时间12 V和4个脉冲和200毫秒的间隔进行优化参数，产生〜 50％的胚胎成活率和质粒DNA靶向到BP的效率。在胚胎发育天然GFP表达的荧光成像显示电穿孔的此方法优选地定位到听囊的前腹方面中，产生该BP（ 图1 EE';白色箭头）和GFP表达可以遵循以上的时间过程高达约〜4天（ 图1 EH）。 原位杂交（ISH）的RNA用于确定电穿孔是否成功地定位在显影内耳的听觉部。以确定的GFP是否由听觉溶于感官祖细胞，ISH实验在相邻的血压切片上进行。内显影的BP感官祖细胞可以通过Sox2的 （ 图1 K和N）和极端分子 （Lfng）（ 图1 j）的表达鉴定。这些实验表明，在整个显影BP感官祖细胞，如图所示为基座（ 图1我 ;黑色托架）和顶点（ 图1 升 ;黑色托架），成功地靶向和后68小时电穿孔的（ 图1我表达GFP 和L;黑色的支架）。另外， 绿色荧光蛋白在非感觉上皮细胞中表达的感官域之外（ 图1的I和L，红色箭头），并在听觉神经节（ 图1I和L; AG，黄色箭头）通过NEUROD1表达标记（ 图1M） 。在典型的实验中的GFP 图1H）;这使得研究者分析感官祖细胞周期撤出和分化的空间和时间模式在显影血压。为了确定感觉祖细胞的增殖的行为，在电穿孔在E4时加入胸苷类似物的EdU。四天后，在发展中BP掺入的EdU在组织切片使用“点击”化学分析。免疫标记的特异性HC-蛋白MyosinVIIa（MYO7A）被用来确定在显影BP区分碳氢化合物。在BP MYO7A的顶端部+碳氢化合物是频繁的EdU +（ 图1 PP'，P'，白色箭头），而在基础只有少数MYO7A +碳氢化合物已将的EdU（ 图1的OO'; O''，白色箭头），这表明在的EdU除了在E4的时间，感官亲在基础genitors已经在很大程度上有丝分裂后。这些结果证实在小鸡BP 6,7反对细胞周期的退出和HC分化梯度以往的研究。
图1 卵内 电穿孔及 卵内 细胞增殖测定。（AD）的电穿孔法的明视图像。 在卵内微注射入右耳泡（B）和放置的电极微注射后定位于前腹区耳囊（C）。在胚胎阶段HH24-25显微注射和电（D;绿耳泡，黑色箭头）之后。电穿孔后（EH）绿色荧光蛋白（GFP）表达。 （
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Discussion
的卵内的微电穿孔的这里描述的方法是用于基因转移到显影听觉器官优化。它与典型地用于操纵基因功能/表达质粒DNA为基础的表达载体相容。电在E4的时机是最佳的，专注于HC发展的听觉器官调查。最关键的步骤是微型喷射的DNA导入耳泡腔不打算与针太深并损坏耳泡（参照图1A-D）中 ，靶向DNA插入通过耳囊的前腹域相应地放置电极（参照图1C），并在12 V.这些优化电穿孔参数和优化的质粒DNA的浓度递送的4个脉冲的优化电穿孔参数-用于特异性靶向推定听觉（〜3.5 4微克/微升）在器官E4。最初，我们开始ØUT在6 V，它没有产生荧光信号进行电穿孔。的电压逐渐增加，通过使用8 V和10为V，12伏为最佳。类似地，脉冲的数量提供，脉冲持续时间和脉冲间隔进行了优化。在12 V，4脉冲，100毫秒持续时间和200毫秒的间隔是理想的。这些参数不仅是理想的用于获得E4有效的基因转移，但也是理想的约〜50％的胚胎成活率。如果电的24小时内获得无荧光信号时，应考虑以下因素：1）确保质粒DNA浓度至少为3.5微克/微升。 2.）通过2 V调节电穿孔参数，例如10或14V。至于培养时间117小时内获得E4（HH24-25）阶段的胚胎（参照图1D），为对卵孵化温度应更多或更少的时间INCU的39°C - 37之间进行优化bation所需的时间比117小时根据所使用的温度，因为在持用不同实验室中是不同的孵化器运行的温度变化。各种胸苷类似物，包括的BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）OR EDU可用于卵内的细胞增殖研究。然而，使用任一化合物的具有用于每个发育阶段进行优化为太多的化合物的证明毒性细胞/胚胎的生存能力和太少的化合物的证明是无效的。此方法描述在0.25毫克/毫升50微升卵内施于整个胚胎专门为从E4研究细胞增殖和细胞周期出口向前浓度的优化使用的EdU的。
卵内电穿孔作为基因操作的方法具有一定的局限性。需要在E4适当的控制结构和电穿孔的experimenta的相对大量的鸡蛋l一般情况。这是由于蛋的比例，约〜27％，即不能用于电穿孔由于缺乏受精，发育缺陷，和胚胎死亡的组合。要考虑的另一个重要因素是电穿孔后的胚胎存活率。存活率是约〜50％。这是由于这样的事实，即旧的胚胎在E4被操纵后不能存活良好;年轻的胚胎是更具弹性，并且可以承受被操纵好。在E4电穿孔后感兴趣的基因的表达是焦距和在整个蜗管包括非感官和感官组织以及听觉神经节本地化。究其原因，更多的焦点和本地化的表达是因为电的目标是在E4假定的，未开发的听觉器官，鸡听觉器官开始前E5长出来，并〜E9 1拉长成特有的镰刀形形式。最后，日E法是短暂的，其中表达信号只仍然〜4天，因为这里使用的目的基因不整合到基因组中。然而，该方法可以与那些具有整合到基因组中的能力适当基于质粒的表达构建中使用。
掌握电穿孔法需要一定的练习，训练的眼睛和手，和专业知识与鸡胚工作。提供了内耳发育和鸡肉的发展地图集的参考文献作为很好的指导和好的起点是新手。掌握这些优化电穿孔参数的方法后，可以使用该方法在从E2封闭耳泡操纵到〜E4.5。虽然在E2和E3电穿孔，10伏而应使用12 V.对于电穿孔在E1靶向耳placode和耳杯，改良电穿孔参数定制铂电极可以使用
此外，有一些修改前庭器官可以与提出的方法的目标。例如，推定前嵴可以在E3，其位于所述前腹NSD 9的背侧前尖进行定位。在E4电穿孔定位前腹耳泡收率局灶性感官和非感官组织内而稳定的绿色荧光蛋白转录表达的所有感官前庭器官，即嵴和utricluar和囊状斑疹的（数据未显示）。
总之，这里介绍的卵内的方法是特定用于进行增益和损失的开始E4功能和在显影鸡听觉器官研究增殖和分化。此外，该方法可以容易地适应用于研究其他NER耳发育现象，包括内耳神经和前庭器官的发育。
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Acknowledgments
我们感谢多丽丝·K.吴博士为表达质粒和原位探测，约翰·霍普金斯大学中心的感官生物成像设备和中心的听力和平衡。这项工作是由NIDCD格兰特T32 DC000023到LE支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 | |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G | |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 | |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 | |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | ||
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 | |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L | |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 | |
| Metal Steel Base Plate 12x24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 | |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 | |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | ||
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 | |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT | |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 | |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand | |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 | |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 | |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 | |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | ||
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 | |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Sterile filter tips |
References
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