Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Kippenembryo's zijn ideaal modelsystemen voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling manipulaties genfunctie kan worden uitgevoerd met relatief gemak in ovo. Het binnenoor auditieve zintuig is van cruciaal belang voor ons vermogen om te horen. Het herbergt een zeer gespecialiseerde sensorische epitheel, dat bestaat uit-mechanisch transduceren haarcellen (HC) en de omliggende glia-achtige ondersteunende cellen (SCS). Ondanks structurele verschillen in de auditieve organen worden moleculaire mechanismen reguleren van de ontwikkeling van het auditieve orgaan evolutionair geconserveerd tussen zoogdieren en Aves In ovo elektroporatie grotendeels beperkt tot beginfase E1 -. E3. Door de relatieve late ontwikkeling van het auditieve orgaan E5, manipulaties van het auditieve orgaan van in ovo elektroporatie verleden E3 moeilijk vanwege de gevorderde ontwikkeling van het kippenembryo in latere stadia. De hier gepresenteerde methode is een voorbijgaande genoverdracht methode voor het richten van genen van belang bijstadium E4 - E4.5 in de ontwikkelingslanden kip auditieve zintuig via in ovo micro-elektroporatie. Deze methode is toepasbaar voor gain en verlies-van-functie met conventionele plasmide-DNA-expressievectoren en kan worden gecombineerd met in ovo celproliferatie assay door toevoeging EDU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) om het hele embryo in de tijdstip van elektroporatie. De toepassing van groen of rood fluorescerend eiwit (GFP of RFP) expressieplasmiden kan de experimentator om snel te bepalen of de elektroporatie succes het auditieve gedeelte van het binnenoor ontwikkeling gericht. Bij deze werkwijze document, zijn representatieve voorbeelden van GFP geëlektroporeerd specimens geïllustreerd; embryo's werden geoogst 18-96 uur na elektroporatie en targeting van GFP aan de pro-sensorische gebied van het auditieve orgaan werd bevestigd door RNA in situ hybridisatie. De werkwijze papier verschaft ook een geoptimaliseerd protocol voor het gebruik van de thymidine analoog EDE cel Prolif analyserenking; Een voorbeeld van een EDU gebaseerd celproliferatie assay die immuno-labeling combineert en klik EDU chemie verschaft.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ondanks verschillen in morfologie en cellulaire patroonvorming tussen de zoogdieren en vogels auditieve zintuig, worden de moleculaire factoren en routes die verantwoordelijk zijn voor de sensorische HC ontwikkeling gedacht evolutionair geconserveerd 1-3. De basilaire papilla, die de auditieve HK's en hun omgeving SC huizen, ontwikkelt zich als een outpocketing van het binnenoor otocyst. Vroeg op een pool van HC en SC voorlopers wordt opgegeven binnen de otic placode / otic cup neurale-zintuiglijke bevoegde domein (NSD). Fate-kaartgegevens leveren het bewijs dat de neuronale en sensorische lijnen zijn met elkaar verbonden en komen voort uit de NSD in de antero-ventrale regio van de otic beker of otocyst bij muizen en kippen 4,5. Eerst, neuroblasts delamineren van de NSD invloed kunnen uitoefenen neuronen van de auditieve-vestibulaire ganglion, die uiteindelijk verdeeld auditieve en vestibulaire ganglia geven. Deze neuronen innerveren sensorische HC van het binnenoor en kernen in de hersenstam. De cellen thten blijven in de NSD wordt gedacht dat ze ontstaan ​​verschillende sensorische patches, waaronder de auditieve zintuig geven, bestaande uit de in mechanisch sensorische transductie HK's en de bijbehorende SC.

In zowel het kuiken en muizen, gehoororgaan sensorisch voorlopercellen celcyclus exit en HC differentiatie komen in tegengestelde gradiënten. In kuiken, auditieve progenitor celcyclus exit begint rond ~ E5 en vordert van de basis naar de top en van het centrum naar de periferie 6. Eén dag later, HC differentiatie begint de apex en zich ontwikkelt tot de basis 7. Het bestuderen van de ontwikkeling van het binnenoor van kip heeft vele technische voordelen als functionele mechanismen kunnen worden onderzocht met relatief gemak in ovo tegenover manipuleren van embryo's in de baarmoeder in andere modelsystemen die complexe operaties vereist. De hier beschreven methode gebruikt in ovo micro-elektroporatie genen van belang richten in de vermoedelijke basilar papilla gebied anterior-ventraal in de otic blaasje specifiek op E4.

Elektroporatie in ovo is een techniek die goed ingeburgerd en veelgebruikte 8-14. Het principe van de electroporatie techniek is gebaseerd op het feit dat nucleotiden (bijvoorbeeld plasmide-DNA, synthetisch DNA of RNA oligonucleotiden) negatief geladen zijn. Het DNA wordt geïnjecteerd in het weefsel van belang. Wanneer een elektrische stroom wordt geplaatst in het weefsel, de huidige opent tijdelijke poriën in de celwanden en maakt de opname van het DNA, als negatief geladen DNA stroomt naar de positieve elektrode (anode). Voor gain-of-function experimenten worden genen van belang gewoonlijk gekloneerd in expressieplasmiden die geschikt expressiecassettes voor groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP) bevatten. Voor loss-of-function experimenten plasmide gebaseerde dominant negatief repressor constructen, of RNAi, of morfolino constructen commonly gebruikt 15,16. Om microRNA (miRNA) functie miRNAs spons constructen, die typisch gebaseerd plasmide remmen, kan worden gebruikt 17. De hier beschreven werkwijze maakt het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de proliferatie en differentiatie regelen in het auditieve orgaan, zoals de in ovo micro-elektroporatiewerkwijze gemakkelijk met in ovo celproliferatie assay kan worden gecombineerd door toevoeging EDE het hele embryo.

De elektroporatie en toevoeging van EDU wordt uitgevoerd bij E4 in het otische vesikel, één dag voor het begin van celcyclus exit in het auditieve orgaan. Analyse van het gehoororgaan is meestal uitgevoerd 18-96 uur na elektroporatie bij E5 (aanvang van zintuiglijke voorlopercellen celcyclus exit), E6 (begin van de HC differentiatie), en E7 (bij HC differentiatie); en later tot ~ E9 (einde van HC differentiatie). Dit elektroporatie methode van genoverdracht is van voorbijgaande aard blijvende ongeveer ~ 4 dagen, because de genen van belang niet integreren in het genoom, maar de methode is toepasbaar voor gebruik met geschikte plasmide-DNA-expressievectoren, die wel de mogelijkheid om te integreren in het genoom, zoals Tol2 gemedieerde genoverdracht 11. Met deze methode robuuste GFP of RFP expressie duurt ~ 4 dagen in het slakkenhuis, waarna wijzen de signalen vervagen, maar toch zorgen voor een ruime tijd venster naar de ingewikkelde ontwikkeling van het gehoororgaan te bestuderen. Dit in ovo genoverdracht werkwijze is nieuw en maakt specifiek te richten de vermoedelijke gehoororgaan in E4, die optimaal is voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. Het is een goede aanvulling op alternatieve werkwijzen die elektroporatie bij veel jongere ontwikkelingsstadia 11,12 of vergelijking met het gebruik van in vitro basilaire papillae explantkweken 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De eieren en unhatched embryo's worden verzorgd en ethisch en humaan behandeld. Alle protocollen voor unhatched embryo gebruik werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland.

1. Eieren en Voorbereiding van de expressieconstructen

  1. eieren:
    1. Incubeer 3-4 dozijn bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) plat op hun zij bij 37 ° C.
      1. Na 24 uur incubatie, trekken 3 cc eiwit met een spuit uit de ronde achterkant van het ei en het boorgat afdicht met doorzichtige tape. Hierdoor ontstaat een luchtkamer tussen de embryo en de eierschaal, waardoor gemakkelijke toegang tot de embryo zonder embryo kleven aan de schaal bij het ​​snijden van het venster om toegang bovenop het ei 19.
      2. Bij 117 uur van de incubatietijd, stadium de embryo volgens Hamburger en Hamilton 20 ontwikkelingsstadiabij E4 (HH24-25) (zie figuur 1D).
  2. Expressieconstructen:
    1. Bereid het plasmide DNA met behulp van reagentia en het protocol van de fabrikant van een commercieel verkrijgbare kit preparaat. Bij de laatste stap van de bereiding, elueren de DNA in 500 ui TE (Tris-EDTA) buffer die in de kit in een 1,5 ml buis.
    2. Ethanol precipiteren van het DNA te concentreren door toevoeging van 50 pl 3 M natriumacetaat en 1 ml 100% ethanol aan de buis. Plaats de buis bij -20 ° CO / N.
    3. Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 14.000 rpm bij 4 ° C. De bovenstaande vloeistof en lucht-droog de pellet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Los het pellet in 15 ui TE-buffer, waarbij een concentratie van ~ 4 ug / ul moet opleveren.
      Noot: De expressieconstructen hier gebruikte PME-IRES-GFP 10, die wordt aangedreven door een kip β-actine promoter of pCI-H2B-IRES-RFP CMV promoter.

2. Kip In Ovo Micro-elektroporatie en In Ovo Cell Proliferation Assay

  1. In Ovo Micro-injectie van Expression Construct en Micro-elektroporatie:
    1. Trek de glazen capillaire buizen in fijne naalden met behulp van een micro-pipet trekker met de volgende geoptimaliseerde parameters voor een 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Verwarming Filament: Druk = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, en Time = 150 msec (zie tabel 1).
    2. Stel de linker- en rechter-handed micro-manipulator stadia aan weerszijden van de microscoop (zie figuur 1A). The Right-handed micro-manipulator houdt het glas capillaire naald en de linkshandige micro-manipulator houdt de elektroden (Figuur 1A).
    3. Bereid de fijn getrokken glazen capillaire naald voor micro-injectie door te snijdende punt van de naald met een tang tijdens het werken onder de microscoop.
    4. handmatig vullen van de naald met de hand met het micro-manipulator met 2,5 pi plasmide-DNA gekleurd met 0,1% Fast Green tijdens het werken onder de microscoop.
    5. Leg het ei liggend op zijn kant in een mal / ei vasthoudinrichting (zie figuur 1A). Snijd een rond venster bovenop het ei met een schaar 19 (Figuur 1A).
    6. Tijdens het werken onder de microscoop, voorzichtig openen de twee membranen overlappen het embryo met behulp van een tang.
    7. Tijdens het werken onder de microscoop, levert ongeveer ~ 0,5 pi plasmide-DNA naar rechts otische vesikel lumen door micro-injectie handmatig met de rechterhand met de micro-manipulator en door micro-elektroporatie.
      1. Hiertoe, micro-injecteren rechts otic vesicle lumen met het DNA met de rechterhand micro-manipulator (Figuur 1B-D), terwijl tegelijkertijd met de linkerhand holdinga pincet aan het hoofd van het embryo te stabiliseren, omdat het hoofd van het embryo dips in fase E4. Niet micro-injecteren langs de otic blaasje lumen, omdat dit de otic blaasje zal beschadigen.
      2. Onmiddellijk na micro-injectie, terwijl het werken onder de microscoop, gebruik dan de linkerhand micro-manipulator met de positieve (anode) 2 mm platina-elektrode anterior-ventrale naar rechts otic blaasje en de negatieve 2 mm elektrode (kathode) in parallel te plaatsen 1 mm van elkaar (zie Figuur 1 C). Lever 4 pulsen op 12 V met 100 msec duur en 200 msec afstand. De linker otische vesikel dient als interne onbehandelde controle.
        LET OP: Maak de elektroden tussen electroporations met een wattenstaafje gedoopt in 1x PBS.
  2. In Ovo Cell Proliferation Assay:
    1. Onmiddellijk na elektroporatie voeg 50 ul van 0,25 mg / ml Edu in 1x PBS door de 50 ul EDE oplossing handmatig laten vallen op de heleembryo in ovo met een pipet. Verzegel de eieren met tape en terug naar de incubator gedurende 18-96 uur.
    2. Verwijder voorzichtig de tape en controleer de embryo's voor fluorescentie GFP of RFP signaal binnen de otic blaasje na 18-24 uur met behulp van een standaard fluorescentie microscoop (zie figuur 1 EE '). Als fluorescent signaal aanwezig is, op dit moment de oogst van de embryo's voor analyses en verzegelt met tape en terug te sturen naar de incubator voor het oogsten en analyses in een later stadium (zie figuur 1 FP '').
      OPMERKING: Expressie van GFP signaal met het PME-IRES-GFP-construct blijkt 6-7 uur na elektroporatie 10.

3. Embryo Oogsten en Tissue Processing voor RNA in situ hybridisatie en immunohistochemie

  1. Oogst de embryo behulp van een tang. Spoel de embryo in koude 1x PBS. Verwijder de hoofden van de embryo's, door te snijden het hoofd van zijn nekbehulp van een tang en plaats de koppen in 4% paraformaldehyde O / N bij 4 ° C. Doorboord hersenen met behulp van een tang om de penetratie van de 4% paraformaldehyde in het hoofd toe.
  2. Dehydrateer de koppen in 30% sucrose (in 1x PBS) O / N bij 4 ° C.
  3. Monteer de hoofden in cryobeschermende medium door snel invriezen in een suspensie van droog ijs en methylbutaan (2-methylbutaan). U kunt ook een snelle bevriezing van de hoofden in cryobeschermende medium met vloeibare stikstof. Bewaar de gemonteerde koppen bij -80 ° C.
  4. Cryosectie de koppen in 12 pm dikke coupes en het verzamelen van alle innerlijke-ear die weefsel secties op superfrosted microscoop glasplaatjes.
  5. Voeren standaard RNA in situ hybridisatie en immunohistochemie zoals hierboven beschreven 4,21 en analyseren EDU celproliferatie volgens het protocol van de fabrikant van de kit.
    LET OP: Haar cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van konijnen polyklonaal α-MyosinVIIa (Myo7a) eentibody (1: 1000, Proteus Biosciences) en fluorescentie-gemerkt secundair antilichaam (1: 250, geit anti-konijn AlexaFluor 488, Invitrogen).

4. Fotolader en Verwerking

  1. Neem beelden met digitale imaging apparatuur. Afbeelding immunohistochemie resultaten met een standaard fluorescentiemicroscoop en de resultaten van de in situ met een standaard wide-field microscoop (van 5x tot 40x in vergroting).
  2. Verwerk de beelden met behulp van software voor beeldverwerking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bij deze werkwijze paper plasmide-DNA bestaat uit groene fluorescent eiwit (GFP) expressiecassettes werd gericht in de ontwikkelende kippenembryo basilaire papilla (BP) met geoptimaliseerde parameters van 12 V en 4 pulsen van 100 msec pulsduur en intervallen van 200 msec, hetgeen een ~ 50% embryo overleving en de efficiëntie van plasmide-DNA te richten in het BP. Fluorescente beeldvorming van natief GFP expressie in ontwikkelende embryo's vertoonden deze wijze van elektroporatie voorkeur richt de anterior-ventrale aspect van de otocyst, die aanleiding geeft tot de BP (figuur 1 EE; witte pijl) en GFP expressie kan worden gevolgd gedurende een tijdsverloop tot ongeveer ~ 4 dagen (Figuur 1 EH). RNA in situ hybridisatie (ISH) werd gebruikt om te bepalen of de elektroporatie succes het auditieve gedeelte van het binnenoor ontwikkeling gericht. Om te bepalen of GFP werd opgenomen door auditievesensorische voorlopers werden ISH experimenten uitgevoerd op aangrenzende secties BP. Binnen de ontwikkeling van BP sensorische voorlopers werden geïdentificeerd door hun expressie van Sox2 (figuur 1 K en N) en Lunatic Fringe (Lfng) (figuur 1 J). Deze experimenten tonen aan dat sensorische progenitors in ontwikkelingslanden over BP, zoals de basis (figuur 1 I, zwarte houder) en top (figuur 1 L, zwart beugel), met succes gericht en express GFP na 68 h elektroporatie (figuur 1 I en L; zwarte haakjes). Bovendien werd GFP buiten de zintuiglijke domein expressie in niet-sensorische epitheelcellen (figuur 1 I en L, rode pijlen) en in de auditieve ganglion (Figuur 1I en L, ag, geel pijlen) gekenmerkt door Neurod1 expressie (Figuur 1M) . In een typisch experiment GFP (Figuur 1 H); Hierdoor kan de onderzoeker om de ruimtelijke en temporele patroon van zintuiglijke voorlopercellen celcyclus terugtrekking en differentiatie te analyseren in het ontwikkelen van BP. De proliferatieve gedrag van sensorische voorlopercellen te bepalen werd de thymidine analoge EDU bij de elektroporatie op E4 toegevoegd. Vier dagen later, edu opname in ontwikkelingslanden BP werd geanalyseerd in weefselsecties met "click" chemie. Immuno-etikettering van de HC-specifiek eiwit MyosinVIIa (Myo7a) werd gebruikt om onderscheid HC identificeren ontwikkelingslanden BP. In het apicale deel van de BP Myo7a + HC's werden vaak EDU + (figuur 1 PP '; P' ', witte pijlen), terwijl in de basis slechts enkele Myo7a + HC had Edu (figuur 1 OO opgenomen'; O '', witte pijlen), wat suggereert dat bij de eDU toevoeging aan E4, sensorische proGenitors in de basis zijn al grotendeels mitotische posten. Deze resultaten bevestigen eerdere studies van tegengestelde gradiënten van celcyclus exit en HC differentiatie in het kuiken BP 6,7.

Figuur 1
Figuur 1. In ovo Elektroporatie en in ovo Cell Proliferation Assay. (AD) Helderveld afbeeldingen elektroporatiewerkwijze. In ovo micro-injectie in de juiste otische vesikel (B) en plaatsing van de elektroden na micro-injectie gericht op de anterior-ventrale gebied het otische blaasje (C). Embryo in fase HH24-25 na micro-injectie en elektroporatie (D; groene Otic blaasje, zwarte pijl). (EH) Green fluorescent protein (GFP) expressie na elektroporatie. ( (E ') GFP expressie bij 18 uur (Otic blaasje, witte pijl). (FH) Witte pijlen op GFP-expressie bij 40 uur (F, oren blaasje), 68 uur (G, BP) en 88 uur (H, BP). (IN) Aangrenzend cochleaire weefsel-secties van de BP gesondeerd voor GFP, Lfng, Sox2 en Neurod1 transcripten door RNA in situ hybridisatie bij 68 uur. Lfng (J, zwarte beugel) en Sox2 (K en N, zwarte beugel) markeren de sensorische epitheel en Neurod1 (M) geeft de auditieve ganglion (ag). GFP tot expressie wordt gebracht in sensorische (I en L, zwarte beugel) en niet-sensorische weefsel (I en L, rode pijlen), en eenuditory ganglion (I en L, gele pijlen). (OP '') Fluorescent beelden van MyosinVIIa (Myo7a) / Edu labeling. (O'-O '' en P'-P '') Hogere vergrotingen van O en P. (O 'en P') Meer Edu labeling aanwezig in de sensorische epitheel bij de top is (P ', wit beugel) dan aan de basis (O', wit bracket). O '' en P '') Samengevoegd fluorescerende beelden, witte pijlen wijzen naar Myo7a (+) / eDU (+) haarcellen aan de top (P ') en de basis (O'). Meer EDU (+) cellen zijn aanwezig in het auditieve ganglion aan de top (P, ag) dan aan de basis (O, ag). (sac; saccule in O). (A, Anterior en V, Ventral in panels B enE). Schaal bars 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De hier beschreven werkwijze in ovo micro-elektroporatie is geoptimaliseerd voor genoverdracht naar de ontwikkeling auditieve orgaan. Het is compatibel met plasmide-DNA-expressievectoren doorgaans gebruikt om genfunctie / expressie manipuleren. De timing van elektroporatie op E4 optimaal voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. De meest kritische stappen worden micro-injecteren van de DNA in de otic vesicle lumen zonder te diep met de naald en beschadiging van de otic blaasje (zie fig. 1A-D), gericht op het DNA in de anterior-ventrale gebied van de otic blaasje door dienovereenkomstig plaatsen van de elektroden (zie figuur 1C.) en levert de geoptimaliseerde elektroporatie parameters van 4 pulsen op 12 V. Deze geoptimaliseerd elektroporatie parameters en optimale concentratie van plasmide-DNA (~ 3,5-4 ug / ul) voor specifiek gericht op de vermoedelijke auditieve orgel van E4. In eerste instantie zijn we begonnen out uitvoeren electroporations bij 6 V, waarin geen fluorescentiesignalen opgeleverd. Het voltage werd stapsgewijs verhoogd met 8 V en 10 V, 12 V optimaal is. Ook het aantal pulsen te leveren en de pulsduren en afstand pulsen geoptimaliseerd. Op 12 V, 4 pulsen van 100 msec en 200 msec afstand is ideaal. Deze parameters zijn niet alleen geschikt voor het verkrijgen van efficiënte genoverdracht in E4, maar ook ideaal voor een embryo overlevingskans van ongeveer ~ 50%. Als er geen fluorescerend signaal wordt verkregen binnen 24 uur van elektroporatie, moet het volgende worden overwogen: 1) Zorg ervoor dat het plasmide DNA-concentratie ten minste 3,5 ug / ul. 2.) Stel de parameter elektroporatie van 2 V, bijvoorbeeld tot 10 of 14 V. het verkrijgen E4 (HH24-25) embryo's binnen 117 uur incubatietijd (zie Fig. 1D), de incubator temperatuur voor de eieren moeten worden geoptimaliseerd tussen 37-39 ° C met meer of minder uren Incubation tijd nodig is dan 117 uur, afhankelijk van de gebruikte temperatuur, want er zijn verschillen in het bezit en het uitvoeren van temperaturen met behulp van verschillende incubators tussen verschillende laboratoria. Verschillende thymidine analogen waaronder BrdU (5-Broom-2'-deoxyuridine) of edu kunnen worden gebruikt voor onderzoek in ovo celproliferatie. Het gebruik van hetzij verbinding worden geoptimaliseerd voor elke ontwikkelingsfase als te veel van de verbinding toxisch voor cellen / embryo levensvatbaarheid blijkt en te weinig van de verbinding niet effectief blijkt. Deze werkwijze beschrijft het optimaal gebruik van EDU in een concentratie van 0,25 mg / ml toegepast als 50 ui op het hele embryo in ovo specifiek voor het bestuderen celproliferatie en cel-cyclus verlaten E4 verder.

In ovo elektroporatie als methode van genetische manipulatie heeft enkele beperkingen. Een relatief groot aantal eieren nodig electroporations bij E4 passende besturingsconstructies en het Experimental omstandigheden. Dit komt door een deel van eieren, ongeveer ~ 27%, onbruikbaar voor elektroporatie door een combinatie van gebrek aan bevruchting, ontwikkelingsdefecten en embryonale sterfte. Een andere belangrijke factor om te overwegen is overlevingskans van de embryo's na elektroporatie. De overlevingskans is ongeveer ~ 50%. Dit komt door het feit dat oudere embryo's in E4 niet goed overleven na gemanipuleerd; jongere embryo's zijn veerkrachtiger en tolereren wordt beter gemanipuleerd. Uitingen van de genen van belang na elektroporatie op E4 zijn middelpunt en gelokaliseerd in het gehele cochleaire kanaal met inbegrip van niet-sensorische en sensorische weefsels alsmede de auditieve ganglion. De reden voor de meer centraal en gelokaliseerde uitdrukking komt omdat de doelstelling van de elektroporatie is de vermoedelijke, onontwikkelde gehoororgaan op E4, voordat de kip gehoororgaan begint uit te groeien E5 en verlengt in zijn karakteristieke sikkelvormige vorm door ~ E9 1 . Tenslotte the methode is van voorbijgaande aard, waar expressie signalen alleen voor ~ 4 dagen blijven, omdat de genen van belang hier gebruikte niet integreren in het genoom. Echter, kan de werkwijze worden gebruikt met geschikte plasmide gebaseerde expressieconstructen die beschikken over de mogelijkheid om te integreren in het genoom.

Het beheersen van de elektroporatie methode vereist enige oefening, getrainde ogen en handen, en expertise in het werken met kippenembryo's. De verwijzingen voorzien binnenoor ontwikkeling en kip ontwikkelingsstoornissen atlassen dienen als goede gidsen en zijn goede uitgangspunten voor een beginner. Na het beheersen van de werkwijze met deze geoptimaliseerde elektroporatie parameters, kan de werkwijze worden gebruikt voor manipulaties in de gesloten otische vesikel van E2 ~ E4.5. Hoewel voor elektroporeren bij E2 en E3 10 V worden gebruikt in plaats van 12 V. Voor elektroporatie in E1 gericht op het otische placode en otische cup, aangepast platina elektroden gemodificeerd elektroporatie parameters kunnen worden gebruikt 8-10 bestuderen. Naast het bestuderen van de ontwikkeling van het auditieve orgaan leent deze werkwijze zich ook voor de ontwikkeling van de auditieve ganglion innerveren bestuderen. Analyse van GFP-expressie in geëlektroporeerde monsters bleek dat gericht specifiek de voorste ventrale-Otic blaasje niet alleen gericht op de zintuiglijke domein binnen de neurale-zintuiglijke competent (NSD) epitheel, maar richt zich ook tot de neuronale bevolking die binnen de NSD wonen. Afferente neuronen innerveren het vestibulaire en auditieve zintuigen zijn voornamelijk van otic placodal oorsprong. Neurogenese plaatsvindt over een langere periode van ongeveer ~ E1.5 - E4.5 in het kuiken, waarbij neuroblasts, ondergaat intense celproliferatie continu delamineren van het NSD epitheel van de otic beker (~ E1.5) en otic blaasje (~ E2.5 - E4.5) en bevolken als differentiërende neuronen de cochleaire-vestibulaire ganglion (CVG; VIII hersenzenuw) 8,10,13,22.

Bovendien, met enkele wijzigingen vestibulaire organen kunnen worden gericht met de werkwijze gepresenteerd. Zo kan de vermoedelijke voorste crista gericht op de E3, dat aan de dorsale voorste uiteinde van het voorste-ventrale NSD 9. Electroporating bij E4 gericht op de anterior-ventrale otic blaasje opbrengsten focale maar robuuste GFP transcript uitdrukkingen in sensorische en niet-sensorische weefsel in alle sensorische vestibulaire organen, namelijk de cristae en utricluar en sacculair maculae (gegevens niet getoond).

Samenvattend, de in ovo hier gepresenteerde methode is specifiek voor het uitvoeren winst-en verlies-functies vanaf E4 en voor het bestuderen van proliferatie en differentiatie in het ontwikkelende kippenembryo auditieve orgaan. Bovendien kan deze werkwijze gemakkelijk worden aangepast voor het bestuderen van andere inner oor ontwikkelingsstoornissen verschijnselen, waaronder binnenoor neurogenese en de ontwikkeling van vestibulaire organen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Doris K. Wu voor expressie plasmiden en in situ sondes, de Johns Hopkins University Center for Sensory Biologie imaging faciliteit en het Centrum voor gehoor en evenwicht. Dit werk werd ondersteund door NIDCD Grant T32 DC000023 LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter