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Developmental Biology

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한 doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

닭 배아 유전자 기능의 조작은 오보에서 비교적 용이하게 수행 될 수있는 배아 발달 공부 이상적인 모델 시스템이다. 내이의 청각 감각 기관들을 수있는 우리의 능력 중요합니다. 그것은 지원 세포 (희주) 아교와 같은 고도로 전문화 된 감각 HCS () - 기계 열 변환 유모 세포로 구성되어 상피와 주변 주택. 청각 기관의 구조적인 차이에도 불구하고, 청각 기관의 발달을 조절하는 분자 메커니즘이 진화 포유 동물과 AVES 사이에 보존되어 비켜 전기에서 E1의 초기 단계에 크게 제한된다 -. E3. 때문에 E5의 청각 기관의 상대적으로 늦게 개발, E3 과거 비켜 전기에 의한 청각 기관의 조작으로 인해 나중 단계에서 닭 배아의 고급 개발에 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 관심 유전자를 타겟팅하는 일시적 유전자 전달 방법단계 E4 - 비켜 마이크로 전기의를 통해 개발 치킨 청각 감각 기관에 E4.5. 이 방법은 이득 - 및 상실 함수 종래의 플라스미드 DNA 계 발현 벡터를 적용하고 상기 전체 배아 EDU (5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘)을 첨가하여 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있다 전기의 시간입니다. 녹색 또는 적색 형광 단백질 (GFP 또는 RFP) 발현 플라스미드의 사용은 실험 신속 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 판단 할 수있다. 이 방법 논문에서는 GFP 전기 천공 표본의 대표적인 예는 예시; 전기 후 96 시간과 청각 기관의 프로 감각 영역에 GFP의 대상은 현장 하이브리드의 RNA에 의해 확인되었다 - 배아는 18을 수확했다. 이 방법은 종이 셀 prolif를 분석 듀 아날로그 티미 딘의 사용을 위해 최적화 된 프로토콜을 제공한다eration; 면역 라벨링을 결합 듀 화학을 클릭했을 듀 계 세포 증식 분석의 예를 제공한다.

Introduction

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포유류 및 조류 청각 감각 기관 사이의 형태 차이 및 세포 패턴에도 불구하고, 분자 요인과 감각 HC의 개발을 담당 경로는 진화 1-3 보존 될 것으로 생각된다. 청각의 HC와 그 주변으로 SC를 수용하는 기저 유두는, 내부 귀 otocyst의 outpocketing으로 개발하고 있습니다. 초기 HC 및 SC 조상의 풀은 귀의 placode / 귀 컵 신경 감각 능력 도메인 (NSD) 내에서 지정됩니다. 운명 매핑 데이터는 신경 및 감각 계통이 연결과 귀 컵의 안테 - 복부 지역에 위치한 나 마우스와 치킨 4,5에 otocyst NSD에서 발생된다는 증거를 제공. 먼저 neuroblasts 결국 청각 및 전정 신경으로 분할 청각-전정 신경절의 뉴런을 야기 할 NSD로부터 박리. 이 신경은 뇌간에있는 내이 및 핵의 감각의 HC를 신경을 분포시키다. 세포 일NSD에 남아있는 열 변환 - 기계 감각의 HC 및 연관된으로 SC 구성된 청각의 감각 기관을 포함하는 다양한 관능 패치를 야기 할 것으로 생각된다.

병아리와 쥐 모두에서, 청각 기관의 감각 전구 세포주기 출구와 HC 차별화 그라디언트 반대에서 발생합니다. 병아리 청각 전구 세포주기 종료 ~ E5 주위 시작 기저부로부터 꼭지점까지 진행하고, 중심으로부터 외주 6. 어느 날 이후, HC 차별화가 정점에서 시작베이스 (7)에 진행한다. 작용 메커니즘이 복잡한 수술을 필요로 다른 모델 시스템에서의 자궁에 배아 조작 반대로 오보에서 비교적 용이하게 조사 할 수 있기 때문에 닭 내이의 개발 공부 많은 기술적 장점을 제공한다. 여기에 설명 된 방법은 추정 basila에 대한 관심의 유전자를 대상으로 비켜 마이크로 전기에 사용특히 E4에 귀의 소포의 연구 유두 영역 전방 - 복부.

OVO의 전기가 잘 설립하고 일반적으로 8-14를 사용하는 기술이다. 일렉트로 기술의 원리는 뉴클레오티드 (예를 들면, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드) 음으로 하전된다는 사실에 기초한다. 한 DNA는 관심있는 조직으로 주입된다. 전류는 조직을 통해 배치 될 때, 전류는 셀 벽에서 과도 모공을 열어 상기 음으로 하전 된 DNA는 양극 (애노드)을 향하여 흐를 때 상기 DNA의 흡수를 허용한다. 이득의 기능 실험을 위해, 관심의 유전자는 일반적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)에 적합한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드에 서브 클로닝된다. 손실의 기능 실험 플라스미드 기반의 지배적 인 부정적인 리프레 구조, 또는 RNAi의, 또는 모르 폴리 노의 구조를 들어 C는ommonly는 15, 16을 사용했다. 플라스미드 계 전형적 마이크로 RNA (miRNA의) 기능의 miRNAs 스폰지 구조를 억제하기 위해 17 사용될 수있다. 오보 마이크로 전기 천공 방법에서의 용이 전체 배아 듀를 추가 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있는 여기에 기술 된 방법은 청각 기관의 증식 및 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 조사 할 수있다.

일렉트로과 에두의 추가는 어느 날 청각 기관의 세포주기 출구의 시작 앞에있는 귀의 소포에 E4에서 수행됩니다. 일반적으로 18 수행되는 청각 기관의 분석 - (HC 분화시) E5 (감각 전구 세포주기 출구의 시작), E6 (HC 차별화의 시작)와 E7에서 전기 후 96 시간을; 이상 ~ E9 (HC 차별화 끝)까지. 유전자 전달이 전기 천공 방법은 ~ 4 일 정도 지속 일시적인 becauSE는 관심 유전자가 게놈 내로 통합되지 않지만, 상기 방법은 TOL2 매개 유전자 전달 (11)의 게놈 내로 통합하는 능력이 있는가 적절한 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 함께 사용하기 위해 적용 가능하다. 이 방법 강력한 GFP 또는 RFP 발현 지속 ~로 신호를 가리 페이드, 아직 청각 기관의 복잡한 현상을 연구하기 위해 충분한 시간 창을 제공 한 후, 달팽이관 4 일. 비켜 유전자 전달 방법이 소설 특히 청각 기관에 HC 개발에 초점 조사에 최적입니다 E4에서 추정 청각 기관을 대상으로 할 수 있습니다. 훨씬 이하의 개발 단계 (11, 12) 또는 기저 관내 유두 이식편 배양 물 (18)의 사용에 비해 electroporate 다른 방법에 좋은 재료이다.

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Protocol

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계란과 깐 배아는 마음에 든다고 윤리적 및 인도적으로 처리됩니다. 깐 배아 사용에 대한 모든 프로토콜은 의학, 볼티모어, 메릴랜드의 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 계란과 식 구조의 제조

  1. 달걀 :
    1. 3 품어 - 4 다스 수정 된 닭고기 달걀 (갈 루스 갈 루스) 37 ° C에서 자신의 양쪽에 평평하게 누워.
      1. 배양 24 시간 후, 계란의 라운드 백 엔드에서 주사기와 알부민의 3 CC를 당겨 명확한 테이프로 구멍을 밀봉. 이 계란 (19)의 상단에 액세스를 위해 창을 절단 할 때 쉘을 고집 배아없이 배아에 대한 접근의 용이성을 허용, 배아와 껍질 사이에 공기 실을 만듭니다.
      2. 배양 시간의 117 시간에서 햄버거와 해밀턴 (20) 발달 단계에 따라 배아를 무대E4 (HH24-25)에서 (그림 1D 참조).
  2. 식 구축 :
    1. 시약을 사용하여 플라스미드 DNA와 시판 제제 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜을 준비한다. 제제의 최종 단계에서, 500 ㎕의 TE (트리스 EDTA) 1.5 ㎖의 튜브에 키트에 제공된 버퍼에 DNA를 용출시킨다.
    2. 에탄올을 3 M 아세트산 나트륨 50 μL 튜브 100 % 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 농축하는 DNA를 침전. -20 ° CO / N에서 튜브를 놓습니다.
    3. 4 ℃에서 14,000 rpm으로 30 분 동안 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 실온에서 10 분 동안 펠렛을 공기 건조. ~ 4 μg의 / μL의 농도를 산출한다 15 ㎕의 TE 버퍼에 펠렛을 용해.
      참고 : 여기에 사용되는 제어 식 구조는 닭 β - 액틴 프로모터에 의해 구동된다 pMES-IRES-GFP (10), 또는 PCI-H2B-IRES-RFP 있습니다 CMV 프로모터에 의해 구동된다> (10), 최대.

비켜 마이크로 전기에와 비켜 세포 증식 분석 2.

  1. 발현 구조체 및 마이크로 일렉트로 비켜 마이크로 인젝션 조작에있어서 :
    1. 2.5 X 2.5 mm 상자 플래티넘 난방 필라멘트에 대해 다음과 최적화 된 매개 변수를 사용하여 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 바늘로 유리 모세관 튜브를 당겨 : 압력 = 500, 열 = 600 ° C, 속도 = (105), 및 시간 = 64 당겨 = 150 밀리 초 (표 1 참조).
    2. 왼쪽 및 현미경을 측면 오른 손잡이 마이크로 매니퓰레이터 단계는 설정 (그림 1A 참조). 오른쪽 손잡이 마이크로 매니퓰레이터는 유리 모세관 바늘과 왼손 마이크로 매니퓰레이터는 전극 (그림 1A)를 보유하고를 보유하고있다.
    3. 절단에 의해 미세 주입을위한 미세 뽑아 유리 모세관 바늘을 준비겸자와 바늘의 끝은 현미경으로 작업하는 동안.
    4. 현미경으로 작업하는 동안 0.1 % 빠른 그린으로 색을 칠한 플라스미드 DNA의 2.5 μL와 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 손으로 직접 바늘을 입력합니다.
    5. (그림 1A 참조) 금형 / 계란 유지 장치 내 옆에 누워 계란을 놓습니다. 가위 19 (그림 1A)를 사용하여 계란의 상단에 둥근 창을 잘라.
    6. 현미경으로 작업하는 동안주의 깊게 집게를 사용하여 배아를 오버레이 두 막을 엽니 다.
    7. 현미경에서 작업하는 동안, 수동으로 미세 조작기를 사용하여 마이크로 일렉트로 오른손을 사용하여 마이크로 인젝션에 의해 오른쪽 귀 소포 루멘 플라스미드 DNA의 약 0.5 ~ μl를 제공한다.
      1. 동시에 왼손 머무르고 사용시 그래서 우측의 마이크로 매니퓰레이터 (도 1b-D)과 DNA와 오른쪽 귀 소포 루멘 마이크로 - 주입 수행태아의 머리가 단계 E4에서 딥 때문에 조지아 forcep는 배아의 머리를 안정합니다. 이 귀의 소포가 손상 될 수 있기 때문에, 귀의 소포 루멘 과거 마이크로 주입하지 마십시오.
      2. 바로 마이크로 주사 후, 현미경으로 작업하는 동안, 양극 (양극) 백금 전극의 전방-복부 오른쪽 귀의 소포 및 병렬 부정적인 2mm 전극 (음극)에 2mm를 배치 왼쪽 미세 조작기를 사용 1mm 간격 (도 1 C 참조). 100 밀리 초 지속 시간 200 밀리 초 간격으로 12 V에서 4 펄스를 제공합니다. 왼쪽 귀의 소포는 내부 처리되지 않은 제어 역할을합니다.
        참고 : 1X PBS에 담근 면봉 electroporations 사이에 전극을 청소합니다.
  2. 비켜 세포 증식 분석에서 :
    1. 즉시 전기 후 수동으로 전체에 50 μl의 에듀 솔루션을 놓아 0.25 밀리그램의 50 μl를 추가 / ㎖ EDU 1X PBS에서피펫을 사용하여 OVO의 배아. 테이프로 계란을 밀봉하고 18 일 동안 인큐베이터로 돌아 - 96 시간.
    2. ( '그림 1 EE 참조) 표준 형광 현미경을 사용하여 24 시간 - 조심스럽게 테이프를 제거하고 18 후 귀의 소포 내에서 형광 GFP 또는 RFP 신호의 배아를 확인합니다. 형광 시그널이있는 경우 ( 'FP도 1 참조),이 시점에서 분석을 위해 수확하거나 배아 테이프 봉인 및 수집 동안 인큐베이터로 돌아가서 이후 단계에서 분석한다.
      참고 : - 7 시간 전기 10pMES-IRES-GFP 구조와 GFP 신호의 발현은 6 분명하다.

현장 하이브리드 및 면역 조직에서 RNA 3. 배아 수확 및 조직 처리

  1. 집게를 사용하여 배아를 수확. 차가운 1X PBS에서 배아를 씻어. 목으로 머리를 절단하여, 배아의 머리를 제거4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 O / N로 머리를 집게를 사용하고 배치합니다. 헤드 내부의 4 % 파라 포름 알데히드의 침투를 허용하는 forcep을 이용하여 뇌에 구멍.
  2. 4 ° C에서 O / N (1X PBS)에 30 % 자당의 머리를 탈수.
  3. 드라이 아이스와 메틸 부탄 (2- 메틸 부탄)의 슬러리에 급속 냉동하여 cryoprotective 매체의 헤드를 탑재합니다. 대안 적으로, 신속한 액체 질소 cryoprotective 매체에 헤드를 고정. -80 ° C에 탑재 된 헤드를 저장합니다.
  4. 12 μm의 두께 조직 섹션에 머리를 동결 절단 (Cryosections) 및 superfrosted 현미경 유리 슬라이드 위에 모든 내이 함유 조직 섹션을 수집합니다.
  5. 이전 4,21 바와 같이 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 화학의 표준 RNA를 수행하고, 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜은 다음 듀 세포 증식 분석.
    주 : 머리 셀의 토끼 폴리 클로 날 사용하여 식별 될 수-α를 MyosinVIIa (Myo7a)을tibody (1 : 1000, 프로테우스 Biosciences 사)과 형광 표지 된 이차 항체 (1 : 250, 염소 항 - 토끼 AlexaFluor 488; 인비 트 로젠).

4. 이미지 캡처 및 처리

  1. 디지털 이미징 장비와 이미지를 가져 가라. 표준 형광 현미경 (배의 배율 40 배까지) 표준 와이드 필드 현미경을 사용하여 현장에서의 결과와 이미지 면역 조직 화학 염색 결과.
  2. 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리​​.

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Representative Results

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녹색 형광 단백질로 구성된이 방법 종이 플라스미드 DNA에서 (GFP) 발현 카세트는 ~를 산출, 12 V 4 100 밀리 초 펄스 폭과 펄스와 200 밀리 초 간격의 최적화 된 매개 변수를 사용하여 개발 치킨 기저 돌기 (BP)에 대상이되었다 50 % 태아 생존율 및 BP에 타겟팅 플라스미드 DNA의 효율. (; 흰색 화살표 그림 1 EE ')와 GFP 발현 시간 걸쳐 올 수 있습니다 배아를 개발 기본 GFP 발현의 형광 이미징은 전기의이 방법은 우선적으로 BP에 상승을 제공하는 otocyst의 앞쪽-복부 측면을 대상으로했다 약 ~ 4 일까지 (그림 1 EH). 계내 혼성화 (ISH)에서 RNA는 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 결정하는 데 사용되었다. GFP는 청각에 의해 찍은 여부를 확인하려면감각 선조는 ISH 실험 BP 인접 부에서 수행 하였다. 개발 BP 감각 조상은 Sox2이 (그림 1 K와 N)와 미치광이 프린지 (Lfng) (그림 1 J)의 발현에 의해 확인되었다 내. 그리고 정점 (그림 1 L, 블랙 브라켓), 성공적으로 대상과 전기의 68 시간 (그림 1 IGFP를 표현 하였다 이러한 실험은 개발 BP에 걸쳐 감각 조상은,베이스 (검은 브래킷 그림 1 I)에 대한 그림과 같이 입증 그리고 L, 블랙 브라켓). (적색 화살표 그림 1 I 및 L) 및 청각 신경절 (그림 1I 및 L, AG, 노란색 화살표)에서 또한, GFP가 아닌 감각 상피 세포의 감각 도메인 외부로 표현 된 Neurod1 식으로 표시 (그림 1M) . 전형적인 실험 GFP에서 (그림 1 H) 동안 지속; 이 연구자가 현상 BP 감각 전구 세포주기 철회 및 분화의 시공간적 패턴을 분석 할 수있다. 감각 전구 세포의 증식 거동을 결정하기 위하여 티미 딘 유사체 듀 E4에서 전기 천공시에 첨가 하였다. 나흘 후, 개발 BP의 듀 통합 화학 "를 클릭"을 사용하여 조직 섹션에서 분석 하였다. HC를 특정 단백질 MyosinVIIa (Myo7a)에 대한 면역 라벨은 개발 BP에서 차별화의 HC를 식별하는 데 사용되었다. 기본 만 몇 Myo7a +의 HC가 EDU (그림 1 OO를 통합 한 반면, '; O'를하며 BP Myo7a의 꼭대기 부분에 +의 HC 자주 EDU + ( '흰색 화살표'P '그림 1 PP)을했다', 흰색 화살표), E4에서 듀 또한시 그 제안, 감각 프로기본에 genitors 이미 대부분 유사 분열을 게시 할 수 있습니다. 이러한 결과는 병아리 BP 6,7에서 세포주기 출구와 HC 차별화의 기울기 반대의 이전 연구를 확인합니다.

그림 1
비켜 Electroporation에에서 & 비켜 세포 증식 분석에서 그림 1. (AD) 전기 방식의 브라이트 이미지. 비켜 마이크로 주입에 전극의 오른쪽 귀의 소포 (B) 및 배치에 미세 주입 후 전방 - 복부 지역을 대상으로 귀의 소포 (C). 마이크로 주입 및 전기 (, 녹색 귀의 소포, 검은 색 화살표 D) 후 단계 HH24-25에서 배아. 전기 후 (EH) 녹색 형광 단백질 (GFP) 식입니다. ( (E ') 18 시간에서 GFP 발현 (귀의 소포, 흰색 화살표). (FH) 흰색 화살표는 40 시간 (F, 귀의 소포), 68 시간 (G, BP)에 GFP 발현을 가리 키, 88 시간에서 (H, BP). 혈압의 (IN) 인접 인공 조직 섹션은 68 시간. Lfng (J, 블랙 브라켓) 및 Sox2이 (K와 N, 검은 색 브래킷)에서 현장 하이브리드의 RNA에 의해 GFP, Lfng, Sox2이, 그리고 Neurod1는 성적에 대한 프로브 마르크 감각 상피 및 Neurod1 (M)는 청각 신경절은 (Ag)을 표시합니다. GFP가 감각 내 (IL, 블랙 브라켓) 및 비 감각 조직 (IL, 빨간색 화살표)하고 A를 표현uditory 신경절 (IL, 노란색 화살표). (OP '') MyosinVIIa (Myo7a)의 형광 이미지 / 에듀 라벨. (O'-O '와로부터 p'-P' ') O와 P의 높은 배율. '베이스보다 (흰색 브라켓 (O (O'와 P ') 표시가 정점에 감각 상피 내에 존재 EDU 더 P)', 흰색 브래킷). O ''및 P '') 형광 이미지 병합, 흰색 화살표는 정점 (P ')과베이스 (O')에서 Myo7a (+) / EDU (+) 유모 세포를 가리 킵니다. 더 EDU (+) 세포는베이스 (O),은 (Ag)보다 정점 (P),은 (Ag)의 청각 신경절 내에서 존재한다. (낭, O에서 saccule). 패널 B에서 (A, 전방 및 V, 복부 및E). 규모는 100 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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오보 마이크로 일렉트로에서의 여기에 설명 된 방법은 현상 청각 기관으로의 유전자 전달에 대해 최적화되어있다. 그것은 일반적으로 유전자 기능 / 발현을 조작하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 호환된다. E4에서 전기의 타이밍은 청각 기관에서는 HC 개발에 집중 조사에 적합하다. 가장 중요한 단계는 바늘 너무 깊이 가서 귀의 소포를 손상시키지 않고 귀의 소포 루멘에 DNA를 미세 주입하는 귀의 소포의 앞쪽-복부 도메인에 의해으로 DNA를 대상으로, (그림. 1A-D 참조) 구체적 추정 청각 타겟팅 - (4- μg의 / μL ~ 3.5) 이에 따라 전극을 배치하는이 전기 매개 변수를 최적화 된 플라스미드 DNA의 농도를 최적화 12 V.에서 4 펄스의 최적화 된 전기 매개 변수 전달 (.도 1C를 참조), E4에서 기관. 처음에 우리가 시작 오유타은 형광 신호를 산출하지 6 V에서 electroporations을 실시. 전압은 12 V가 점진적으로 최적 인 상태, 8 V, 10 V를 사용함으로써 증가되었다. 마찬가지로, 펄스 수는 달성 펄스 지속 시간 및 펄스 간격을 최적화 하였다. 12 V에서 100 밀리 초 지속 시간 200 밀리 초 간격 4 펄스가 이상적이다. 이들 파라미터뿐만 아니라, E4의 효율적인 유전자 전달을 획득하기에 적합 할뿐만 아니라 ~ 약 50 %의 태아 생존율에 적합하다. 더 형광 신호가 전기의 24 시간 내에 얻을 수없는 경우, 다음을 고려해야한다 : 1) 플라스미드 DNA 농도가 적어도 3.5 μg의 / μL 있는지 확인합니다. 2) 배양 시간의 117 시간 내에서 E4 (HH24-25) 단계의 배아를 얻기에 관해서는 10 또는 14 V로, 예를 들어, 2 V하여 전기 매개 변수를 조정합니다 (그림. 1D), 계란의 인큐베이터 온도를해야 인큐의 더 많거나 더 적은 시간으로 39 ° C - 37 사이의 최적화들고 다른 실험실 사이에 다른 인큐베이터를 사용하여 온도를 실행의 변화가 있기 때문에 bation 시간은 사용 온도에 따라 117 시간보다 필요합니다. BrdU의 (5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘) 또는 듀 등 다양한 티미 딘 유사체는 오보 세포 증식을 연구하는데 사용될 수있다. 화합물의 너무 많은 셀 / 배아 생존 독성 증명 화합물 너무 적은 비효율적 증명하지만, 어느 하나의 화합물의 사용은 각 발달 단계에 대해 최적화되어야한다. 이 방법은 / mL로 특히 이후 E4에서 세포 증식 및 세포주기 출구를 공부 비켜에서 전체 배아에 50 μL로 적용 0.25 밀리그램의 농도로 EDU의 최적화 된 사용에 대해 설명합니다.

오보 전기 유전자를 조작하는 방법이 몇 가지 제한이있다. 계란의 상대적으로 많은 수의 적절한 제어 구조와 E4에서 electroporations에 대한과 experimenta 필요리터 조건. 이 약, 계란의 비율에 기인 ~ 27 %, 때문에 수정의 부족, 발달 결함 및 배아 죽음의 조합에 전기에 대해 사용할 수있는. 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 전기 후 배아의 생존율이다. 생존율은 대략 ~ 50 %이다. 이것은 E4에서 이전 배아 조작 후의도 생존하지 않는다는 사실에 기인한다; 젊은 배아는 탄력 있고 더 나은 조작되고 용납. E4에서 전기 후 관심있는 유전자의 표현은 초점과 비 감각과 감각 조직뿐만 아니라 청각 신경절을 포함한 전체 인공 와우 덕트를 통해 현지화입니다. 일렉트로의 대상 E4에서 추정 미개발 청각 기관이기 때문에 닭 청각 기관은 E5 밖으로 성장하기 시작 ~ E9 (1)에 의해 그 특성이 겸상 자 형상으로 뻗어 나온 전에 더 초점 및 국소 발현의 이유가있다 . 마지막으로, 일전자의 방법은 여기에 사용 된 관심의 유전자가 게놈에 통합하지 않기 때문에 표현 신호 만 ~ 4 일 동안 유지 과도이다. 그러나,이 방법은 게놈 내로 통합하는 능력이 않는 적절한 플라스미드 계 발현 구조체와 함께 사용될 수있다.

일렉트로 방법을 마스터하는 것은 닭 배아 작업에 연습, 훈련 된 눈과 손과 전문 지식을 필요로한다. 내이 개발 및 닭 개발지도 책에 제공된 참조는 초보자를위한 좋은 출발점을 좋은 가이드를 제공하고 있습니다. 이러한 최적화 된 전기 매개 변수 방법을 습득 한 후에, 상기 방법은 ~ E4.5로 E2에서 귀 폐쇄 소포의 조작을 위해 사용될 수있다. E2 및 E3에서 electroporating를 들어, 10 V 수정 전기 매개 변수를 사용하여 귀 placode과 귀 컵, 사용자 정의 백금 전극을 대상으로 E1에 전기를 들면 12 V. 대신 사용되어야하지만 사용할 수 있습니다 8 ~ 10의 개발을 포함한 귀 개발에 앞서 이벤트를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 청각 기관의 개발 연구뿐만 아니라이 방법은 또한 근에 분포 청각 신경절의 개발 연구라는 것으로. 전기 천공 표본에서 GFP 발현의 분석은 특히 전방 - 복부 귀의 소포를 대상으로하는 것이 아니라 신경 감각 능력 (NSD) 상피 내의 감각 도메인을 대상으로뿐만 아니라 NSD 내에 상주 신경 인구를 대상 것으로 나타났습니다. 구 심성 신경은 전정 청각 감각 기관은 주로 귀 placodal 기원이다 지배하는. 강렬한 세포 증식을 겪고 neuroblasts가 지속적으로 E를 (귀의 컵 (~ E1.5)과 귀의 소포의 NSD 상피에서 박리 ~ 병아리에 E4.5을 ​​- 신경은 ~ E1.5에서 약 오랜 기간 동안 발생2.5 - E4.5)과 뉴런에게 인공 와우 - 전정 신경절 (CVG 차별화로 채 웁니다; VIII 뇌신경) 8,10,13,22을.

또한, 일부 수정과 전정 기관이 제시 한 방법으로 타겟팅 할 수 있습니다. 예를 들어, 추정 전방 crista은 전방 - 복부 NSD (9)의 지느러미 앞쪽 끝 부분에 놓여 E3에서 타겟팅 할 수 있습니다. 전방 - 복부 귀의 소포 수익률은 감각 전정 기관, 즉의 cristae 및 utricluar와 주머니 모양 황반의 모든 감각과 비 감각 조직 내에서 아직 강력한 GFP의 성적 표현을 초점 대상으로 E4에서 Electroporating (데이터는 도시하지 않음).

결론적으로, 여기에 제시된에서 비켜 방법을 수행하기위한 특정 이득 및 E4에서 시작 기능과 개발 치킨 청각 기관에서 증식 및 분화 연구를위한-의 손실. 또한,이 방법은 쉽게 다른 공부를 위해 적용 할 수 있습니다NER 귀 내이 신경과 전정 기관의 개발을 포함한 발달 현상.

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Acknowledgments

우리는 발현 플라스미드과 현장 프로브 박사 도리스 K. 우 감사, 감각 생물 이미징 시설의 존스 홉킨스 대학 센터와 청력과 균형을위한 센터. 이 작품은 LE에 NIDCD 부여 T32 DC000023에 의해 지원되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

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References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기
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Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

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