Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Gene Transfer inn i Chicken hørbar Organ av doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Kylling embryo er ideelle modellsystem for å studere embryonale utvikling som manipulasjoner av gen-funksjon kan utføres med relativ letthet i ovo. Det indre øret auditive sanseorgan er avgjørende for vår evne til å høre. Det huser en høyt spesialisert sensorisk epitel som består av Mekano-transducing hårcellene (HC'er) og omkringliggende glial-lignende støtte celler (SCS). Til tross for strukturelle forskjeller i hørselsorganene, blir molekylære mekanismene som regulerer utviklingen av den auditive organ evolusjonært konservert mellom pattedyr og aves In ovo elektroporasjon er i stor grad begrenset til tidlige stadier ved E1 -. E3. På grunn av den relative sent utviklingen av hørselsorganet på E5, manipulasjoner av hørselsorganet ved i ovo electroporation siste E3 er vanskelig på grunn av avansert utvikling av kylling embryo på senere stadier. Metoden som presenteres her er en forbigående genoverføring metode for målretting gener av interesse påstadium E4 - E4.5 i utviklings kylling auditive sanseorgan via in ovo mikro electroporation. Denne fremgangsmåte er anvendelig for gevinst-og tap-av-funksjoner med konvensjonelt plasmid DNA-baserte ekspresjonsvektorer og kan kombineres med i ovo assay celleformering ved tilsetning EDU (5-etynyl-2'-deoksyuridin) til hele embryoet i tidspunktet electroporation. Bruk av grønn eller rød fluorescerende protein (GFP eller RFP) ekspresjonsplasmider gjør at eksperimentator raskt avgjøre om elektroporeringsmetoden vellykket målrettet auditive delen av å utvikle indre øret. I denne fremgangsmåte papiret, er representative eksempler på GFP elektroporert prøvene illustrert; embryoene ble høstet 18-96 timer etter electroporation og målretting av GFP til pro-sensorisk område av hørselsorganet ble bekreftet av RNA in situ hybridisering. Fremgangsmåten papir tilveiebringer også en optimal protokoll for anvendelse av tymidinanalog EDU for å analysere celle formeringenbeid; et eksempel på en Edu basert celleproliferasjon analyse som kombinerer immuno-merking og klikk Edu kjemi er gitt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Til tross for forskjeller i morfologi og cellulære mønster mellom pattedyr og avian auditive sanseorgan, er de molekylære faktorer og stier som er ansvarlige for sanse HC utvikling antas å være evolusjonært konservert 1-3. Basilaris papilla, som huser de auditive HC'er og deres omkringliggende SC'er, utvikler seg som en outpocketing i det indre øret otocyst. Tidlig på en pool av HC og SC stamfedre er spesifisert i otic placode / otic cup nevrale sensorisk kompetent domene (NSD). Fate-kartdata dokumentere at nevronale og sensoriske linjene er koblet og oppstår fra NSD ligger i Antero-ventral regionen otic kopp eller otocyst i mus og kylling 4,5. Først neuroblasts delaminere fra NSD til å gi opphav til nervecellene i hørsels-vestibular ganglion, som til slutt delt i auditiv og vestibular ganglier. Disse nervecellene innerverer de sensoriske HC'er i det indre øret og kjerner i hjernestammen. Cellene thved forbli i NSD er tenkt å gi opphav til ulike sensoriske patcher, inkludert det auditive sanseorgan, bestående av Mechano førende sensoriske HC'er og deres tilknyttede SC'er.

I både dama og muse, auditiv organ sansestamcellesyklus exit og HC differensiering skje i motsatte stigninger. I chick, starter auditiv stamcellesyklus exit rundt ~ E5 og utvikler seg fra bunnen til toppen, og fra sentrum til periferien 6. En dag senere, starter HC differensiering i apex og utvikler seg til bunnen 7. Å studere utviklingen av det indre øret hos kylling gir mange tekniske fordeler som funksjonelle mekanismer kan bli undersøkt med relativ letthet i ovo i motsetning til å manipulere embryo in utero i andre modellsystemer, som krever komplekse operasjoner. Metoden som beskrives her bruker i ovo mikro electroporation å målrette gener av interesse i presumptive Basilar papilla området anterior-ventralt i otic vesikkel spesielt på E4.

Elektroporering i ovo er en teknikk som er godt etablert, og som vanligvis brukes til 8-14. Prinsippet for elektroporering teknikken er basert på det faktum at nukleotider (for eksempel plasmid-DNA, syntetisk DNA, RNA eller oligonukleotider) er negativt ladet. DNA ble injisert inn i vevet av interesse. Når en elektrisk strøm legges på tvers av vev, åpner den nåværende opp forbigående porer i celleveggene og muliggjør opptak av DNA, som negativt ladet DNA strømmer mot den positive elektrode (anode). For forsterkning-av-funksjon eksperimenter, er gener som er av interesse vanligvis subklonet inn i ekspresjonsplasmider som inneholder hensiktsmessige ekspresjonskassetter for grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP). For tap-av-funksjon eksperimenter plasmid-baserte dominerende negative repressor konstruksjoner eller RNAi, eller morfolino konstruksjoner er commonly brukte 15,16. For å hindre mikroRNA (miRNA) funksjons mirnas svamp konstruksjoner, som er typisk plasmid basert, kan brukes 17. Den her beskrevne metoden gjør for å undersøke de molekylære mekanismene som styrer spredning og differensiering i hørselsorganet, som i ovo mikro elektroporeringsmetoden kan enkelt kombineres med i ovo analysen celleproliferasjon ved å legge Edu til hele embryo.

Elektroporeringsmetoden og tillegg av Edu er utført på E4 i otic vesikkel, som er en dag før utbruddet av cellesyklus exit i hørselsorganet. Analyse av auditiv organ er vanligvis utført 18-96 timer etter electroporation på E5 (utbruddet av sensorisk stamcellesyklus exit), E6 (utbruddet av HC differensiering), og E7 (under HC differensiering); og senere opp til ~ E9 (slutten av HC differensiering). Denne elektroporering fremgangsmåte for genoverføring er forbigående varer omkring ~ 4 dager, because genene av interesse ikke å integrere i genomet, men metoden er anvendelig for bruk med passende plasmid DNA-baserte ekspresjonsvektorer, som har evnen til å integrere i genomet, slik som Tol2-mediert genoverføring 11. Med denne metoden robust GFP eller RFP uttrykk varer ~ 4 dager i sneglehuset, etter som peker signalene svekkes, men gir en god tidsvindu til å studere den intrikate utvikling av auditiv organ. Dette i ovo genoverføring metoden er ny og lar spesifikt mot den presumptive auditive organ ved E4, som er optimal for undersøkelser som fokuserer på HC utvikling i hørselsorganet. Det er et godt tillegg til alternative metoder, som electroporate på mye yngre utviklingsstadier 11,12 eller i forhold til bruk av in vitro basilaris papiller eksplantering kulturer 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Egg og unhatched embryoer blir tatt vare på og behandlet etisk og humant. Alle protokoller for unhatched embryo bruk ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland.

1. Egg og klargjøring av Expression konstruerer

  1. egg:
    1. Inkuber 3-4 dusin befruktet kylling egg (Gallus gallus) ligger flatt på sine sider ved 37 ° C.
      1. Etter 24 timers inkubasjon trekke tre cc av eggehvitestoff med en sprøyte fra runden bakenden av egg og forsegle hullet med klar tape. Dette skaper et luftkammer mellom embryoet og eggeskallet, slik at for enkel tilgang til embryoet uten at embryoet fester seg til skallet når kutting av vinduet for tilgang på toppen av egget 19.
      2. På 117 timers inkubasjonstid, iscenesette embryoene ifølge Hamburger og Hamilton 20 utviklingsstadierved E4 (HH24-25) (Se figur 1D).
  2. Expression Konstruerer:
    1. Forbered plasmid DNA ved hjelp av reagenser og protokollen gitt av produsenten av en kommersielt tilgjengelig forberedelse kit. Ved det siste trinnet i fremstillingen, eluering av DNA i 500 ul TE (Tris-EDTA) buffer i settet inn i et 1,5 ml rør.
    2. Etanol utfelle det DNA for å konsentrere det ved tilsetning av 50 ul 3 M natriumacetat og 1 ml av 100% etanol til røret. Plasser røret ved -20 ° CO / N.
    3. Sentrifuger røret i 30 minutter ved 14000 rpm ved 4 ° C. Fjern supernatanten og luft-tørke pellet i 10 minutter ved RT. Oppløs pelleten i 15 pl TE-buffer, som skal gi en konsentrasjon på ~ 4 ug / ul.
      MERK: kontroll uttrykk konstruerer brukes her er pMES-IRES-GFP 10, som er drevet av en kylling β-aktin promoter, eller PCI-H2B-IRES-RFP CMV-promoteren.

2. Chicken In Ovo Micro-electroporation og I Ovo Cell Proliferation Assay

  1. I Ovo Micro-injeksjon av Expression Construct og Micro-elektroporering:
    1. Trekk glass kapillarrør i fine nåler ved hjelp av en mikro-pipette avtrekker med følgende optimaliserte parametere for en 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Oppvarming Filament: Trykk = 500, Varme = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, og Time = 150 msek (se tabell 1).
    2. Sett opp venstre- og høyrehendte mikro-manipulator etapper flankerer mikroskop (se figur 1A). Den høyrehendt mikro-manipulator holder glass kapillær nålen og venstrehendte mikro-manipulator holder elektrodene (Figur 1a).
    3. Klargjør fint trukket glass kapillær nål for mikro-injeksjon ved å kuttetuppen av nålen med en pinsett under arbeidet under mikroskopet.
    4. Fyll nålen manuelt for hånd ved hjelp av mikro-manipulator med 2,5 mL av plasmid DNA farget med 0,1% Fast Grønn mens han jobbet under mikroskopet.
    5. Plasser egg liggende på siden inne i en form / egg holdeinnretning (se figur 1A). Skjær en runde vinduet på toppen av egget med saks 19 (figur 1A).
    6. Mens han jobbet under mikroskopet, nøye åpne de to membraner overliggende embryo ved hjelp av pinsett.
    7. Mens han jobbet under mikroskopet, levere ca ~ 0,5 mL av plasmid DNA til de riktige otic vesikkel lumen ved mikroinjeksjon manuelt ved hjelp av høyre hånd ved hjelp av mikro-manipulator og av mikro-elektroporering.
      1. For å gjøre dette, mikro-injisere de riktige otic vesikkel lumen med DNA med Høyre mikro-manipulator (Figur 1B-D), mens på samme tid ved hjelp av venstre Holdinga forcep å stabilisere hodet av embryoet, fordi hodet av embryoet dips på scenen E4. Ikke mikro-injisere forbi otic vesikkel lumen, fordi dette vil skade otic vesikkel.
      2. Umiddelbart etter mikroinjeksjon, mens han jobbet under mikroskop, bruk Venstre hånd mikro-manipulator for å plassere positive (anode) 2 mm platina elektrode anterior-ventral til høyre otic vesikkel og negative 2 mm elektrode (katode) i parallell 1 mm fra hverandre (se figur 1 C). Lever 4 pulser på 12 V med 100 msek varighet og 200 ms mellomrom. Den venstre otic vesikkel tjener som en intern ubehandlet kontroll.
        MERK: Rengjør elektrodene i mellom electroporations med en bomullspinne dyppet i 1x PBS.
  2. I Ovo celleproliferasjonsanalyse:
    1. Umiddelbart etter electroporation legge til 50 mL av 0,25 mg / ml Edu i 1x PBS ved manuelt å slippe 50 ul Edu løsning på heleembryo in ovo ved anvendelse av en pipette. Forsegl eggene med tape og gå tilbake til inkubatoren for 18 - 96 timer.
    2. Fjerner du teipen forsiktig og sjekke embryoer for fluorescerende GFP eller RFP signal innenfor otic vesikkel etter 18 - 24 timer ved hjelp av en standard fluorescerende mikroskop (se figur 1 EE '). Hvis fluorescerende signal er til stede, på dette punktet høste embryoer for analyser eller forsegle med tape og returnere det til inkubator for høsting og analyser på senere stadier (se figur 1 FP '').
      MERK: Uttrykk for GFP signal med pMES-IRES-GFP konstruksjonen er tydelig 6-7 timer etter electroporation 10.

3. Embryo Høsting og Tissue Processing for RNA in situ hybridisering og Immunohistochemistry

  1. Høste embryoer ved hjelp av tang. Skyll embryo i kaldt 1x PBS. Fjern hodene på embryoer, ved å kutte hodet av nakkenved hjelp av tang, og plassere hodene til 4% paraformaldehyde O / N ved 4 ° C. Punktere hjernen ved hjelp av en forcep for å tillate gjennomtrengning av 4% paraformaldehyd inne i hodet.
  2. Dehydrere hodene i 30% sukrose (i 1x PBS) O / N ved 4 ° C.
  3. Monter hoder i kryobeskyttende medium ved hurtig frysing i en oppslemming av tørris og metylbutan (2-metylbutan). Alternativt rask fryse hodene i kryobeskyttende medium med flytende nitrogen. Oppbevar montert hoder ved -80 ° C.
  4. Cryosection hodene til 12 mikrometer tykke vevssnitt og samle alle indre øret inneholder vevssnitt ut mot superfrosted mikroskop glass.
  5. Utfør standard RNA in situ hybridisering og immunhistokjemi som tidligere beskrevet 4,21, og analysere for Edu celleproliferasjon følge protokollen gitt av produsenten av settet.
    MERK: Hårcellene kan identifiseres ved hjelp av kanin polyklonale α-MyosinVIIa (Myo7a) entibody (1: 1000, Proteus Biosciences) og fluorescens-merket sekundært antistoff (1: 250, geit anti-kanin AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Image Capture og Processing

  1. Ta bilder med digital bildebehandling utstyr. Bilde immunhistokjemi resultater med en standard fluorescerende mikroskop og resultatene av in situ ved hjelp av en standard wide-feltet mikroskop (varierer fra 5x til 40x forstørrelse).
  2. Behandle bilder med bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved denne fremgangsmåte papiret plasmid DNA som består av grønt fluorescerende protein (GFP) ekspresjonskassetter ble rettet inn mot å utvikle kylling basilær papilla (BP) med optimale parametre for 12 V og 4 pulser med 100 msek pulsvarighet og intervaller på 200 millisekunder, noe som ga en ~ 50% embryo overlevelsesrate og effektivitet av plasmid-DNA målretting til BP. Fluoriserende avbildning av nativt GFP-ekspresjon i utviklingen av embryoer viste denne metoden for elektroporering fortrinnsvis er rettet mot det anterior-ventral aspekt av otocyst, som gir opphav til BP (figur 1 EE '; hvit pil) og GFP uttrykk kan følges over et tidsforløp på opp til ca. ~ 4 dager (figur 1 EH). RNA in situ hybridisering (ISH) ble anvendt for å bestemme hvorvidt den elektroporering med hell rettet den auditive parti av det fremkallende indre øret. For å avgjøre om GFP ble tatt opp av auditivsensoriske stamfedre, ISH eksperimenter ble utført på tilstøtende BP seksjoner. Innenfor utviklings BP sensoriske forfedre ble identifisert ved deres uttrykk for Sox2 (figur 1 K og N) og Lunatic frynser (Lfng) (figur 1 J). Disse eksperimentene viser at sanse forfedre hele utvikle BP, som vist for basen (Figur 1 I; sort brakett) og apex (Figur 1 L, svart brakett), ble vellykket målrettet og uttrykke GFP etter 68 timer av electroporation (figur 1 jeg og L, svart parentes). I tillegg ble GFP uttrykt utenfor den sensoriske domene i ikke-sanse epitelceller (figur 1. I og L, røde piler) og i det auditive ganglion (fig 1I og l; ag, gule piler) merket med Neurod1 uttrykket (figur 1 M) . I et typisk eksperiment GFP (figur 1 H); dette gjør at etterforsker for å analysere romlig og tidsmessig mønster av sensorisk stamcellesyklus tilbaketrekking og differensiering i utviklings BP. For å bestemme den proliferative oppførselen til sensoriske progenitorceller, ble det tymidinanalog EDU tilsatt ved tidspunktet for elektroporering ved E4. Fire dager senere ble Edu innlemmelse i utviklings BP analysert i vevssnitt med "klikk" kjemi. Immuno-merking for HC-spesifikt protein MyosinVIIa (Myo7a) ble anvendt for å identifisere differensiere HC'er i u BP. I den apikale del av BP Myo7a + HC'er var ofte utd + (figur 1 PP '; P' ', hvite piler), mens det i bunnen bare få Myo7a + HC'er hadde innlemmet EDU (figur 1 OO'; O '', hvite piler), noe som tyder på at ved tidspunktet for tilsetning eDU ved E4, sensorisk progenitors i basen er allerede i stor grad legge mitotisk. Disse resultatene bekrefter tidligere studier av motstrid gradienter av cellesyklus exit og HC differensiering i dama BP 6,7.

Figur 1
Figur 1. I Ovo Electroporation & I Ovo Cell Proliferation analysen. (AD) Lysfelt bilder av elektroporeringsmetoden. I ovo mikro-injeksjon i høyre otic vesikkel (B) og plassering av elektroder etter mikroinjeksjon rettet mot anterior-ventral området otic vesikkel (C). Embryo på scenen HH24-25 etter mikro-injeksjon og electroporation (D; grønn otic vesikkel, svart pil). (EH) Grønn fluorescerende protein (GFP) uttrykk etter electroporation. ( (E ') GFP uttrykk på 18 timer (otic vesikkel, hvit pil). (FH) hvite pilene peker til GFP ekspresjon ved 40 timer (F, otic vesikkel), 68 t (G, BP), og ved 88 timer (H, BP). (IN) Tilstøtende cochlea vev-deler av BP undersøkt for GFP, Lfng, Sox2, og Neurod1 transkripsjoner av RNA in situ hybridisering på 68 timer. Lfng (J, sort brakett) og Sox2 (K og N, svart braketten) markerer sensorisk epitel og Neurod1 (M) markerer auditive ganglion (ag). GFP uttrykkes innenfor sensoriske (i og L, sort brakett) og ikke-sensorisk vev (jeg og L, røde piler), og enuditory ganglion (jeg og L, gule piler). (OP '') Fluorescent bilder av MyosinVIIa (Myo7a) / Edu merking. (O'-O '' og p'-P '') Høyere forstørrelse av O og P. (O 'og P') Mer EDU merking er til stede i sensorisk epitel på toppen (P ', hvit ramme) enn i bunnen (O', hvit ramme). O '' og P '') Sammenslåtte fluorescerende bilder hvite piler peker på Myo7a (+) / eDU (+) hårceller ved spissen (P '') og basen (O ''). Flere EDU (+) celler er til stede i den auditive ganglion ved spissen (P, ag) enn i bunnen (O, ag). (sac; saccule i O). (A, Anterior og V, Ventral i panelene B ogE). Scale barer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den her beskrevne fremgangsmåte for in ovo mikro elektroporering er optimalisert for genoverføring inn i det fremkallende auditive organ. Det er kompatibelt med plasmid DNA-baserte ekspresjonsvektorer som typisk benyttes for å manipulere genfunksjon / ekspresjon. Tidspunktet for electroporation ved E4 er optimal for undersøkelser som fokuserer på HC utvikling i hørselsorganet. De mest kritiske trinn er mikro-injeksjon av DNA inn i otiske vesikkel hulrommet uten å gå for dypt med nålen og skade på otic vesikkel (se fig. 1A-D), rettet mot DNA i anterior-ventral domene av otic vesikkel etter plassere elektrodene deretter (se figur 1C.), og levere optimaliserte electroporation parametre av 4 pulser på 12 V. Disse er optimalisert electroporation parametre og optimalisert konsentrasjon av plasmid DNA (~ 3,5 til 4 ug / ul) for spesifikt rettet mot presumptive auditive organ på E4. Utgangspunktet vi startet oUT gjennomføre electroporations på 6 V, som ga ingen fluorescerende signaler. Spenningen ble gradvis økt ved hjelp av 8 V og 10 V, med 12 V være optimal. Tilsvarende til det antall pulser levere og pulsvarigheter og avstand mellom pulser ble optimalisert. Ved 12 V, 4 pulser med 100 msek varighet og 200 ms avstanden er ideell. Disse parametrene er ikke bare ideell for å få effektiv genoverføring ved E4, men er også ideelt for et embryo overlevelsesrate på ca ~ 50%. Hvis ingen fluorescerende signal oppnås innen 24 timer fra electroporation, bør følgende vurderes: 1.) Kontroller at plasmid DNA konsentrasjonen er minst 3,5 ug / ul. 2.) Juster electroporation parameter ved 2 V, for eksempel til 10 eller 14 V. Når det gjelder å skaffe E4 (HH24-25) trinns embryoer i 117 timers inkubasjonstid (se fig. 1 D), inkubator temperatur for eggene skal optimaliseres mellom 37-39 ° C med flere eller færre timer incuvestand tiden som trengs enn 117 timer avhengig av temperaturen som brukes, fordi det er variasjoner i holder og kjører temperaturer ved hjelp av ulike inkubatorer mellom ulike laboratorier. Ulike tymidin analoger inkludert BrdU (5-brom-2'-deoxyuridine) eller Edu kan brukes til å studere i ovo celleproliferasjon. Imidlertid har bruken av enten forbindelsen som skal optimaliseres for hver utviklingsstadiet som for mye av forbindelsen viser seg giftige for celle / embryo levedyktighet og for lite av forbindelsen viser seg ineffektiv. Denne fremgangsmåten beskriver optimal bruk av edu ved en konsentrasjon på 0,25 mg / ml anvendt som 50 pl på hele embryoet i ovo spesielt for å studere celleproliferasjon og cellesyklus-utgang fra E4 framover.

I ovo elektroporering som en fremgangsmåte for genmanipulering har noen begrensninger. En relativ stort antall egg er nødvendig for electroporations på E4 med egnede kontroll konstruksjoner og for Experimental forhold. Dette er på grunn av en andel av egg, ca. ~ 27%, å være ubrukelig for elektroporering skyldes en kombinasjon av mangel på befruktning, utviklingsdefekter, og embryonale død. En annen viktig faktor å vurdere er overlevelse av embryoene etter electroporation. Overlevelsesraten er ca ~ 50%. Dette skyldes det faktum at eldre embryoer ved E4 ikke overlever godt etter å ha blitt manipulert; yngre embryoer er mer robust og tåler å bli manipulert bedre. Uttrykk av gener av interesse etter electroporation ved E4 er navet og lokalisert i hele cochlea kanalen inkludert ikke-sensorisk og sensorisk vev samt auditive ganglion. Bakgrunnen for mer fokus og lokalisert uttrykk er fordi målet for electroporation er den presumptive, uutviklet auditive organ ved E4, før kyllingen auditive organ begynner å vokse ut på E5 og forlenges til sin karakteristiske sigdformet form ved ~ E9 1 . Til slutt, the metode er forbigående ekspresjon hvor signalene bare være for ~ 4 dager, fordi gener av interesse som brukes her ikke integrerer i genomet. Imidlertid kan fremgangsmåten anvendes med passende plasmid-baserte ekspresjonskonstruksjoner som har evne til å integrere i genomet.

Maste elektroporeringsmetoden krever litt øvelse, trente øyne og hender, og kompetanse i å arbeide med kylling embryoer. Referansene gitt for indre øret utvikling og kylling utviklings atlas tjene som gode guider og er et godt utgangspunkt for en nybegynner. Etter å mestre fremgangsmåten med disse optimaliserte electroporation parametere, kan fremgangsmåten anvendes for manipuleringer i det lukkede otic vesikkel fra E2 til ~ E4.5. Selv for electroporating på E2 og E3, bør 10 V brukes i stedet for 12 V. For electroporation på E1 rettet mot otic placode og otic cup, tilpassede platinaelektroder med modifiserte electroporation parametre kan brukes 8-10. I tillegg til å studere utviklingen av den auditive organ egner denne metoden seg også for å studere utviklingen av den auditive innervating ganglion. Analyse av GFP uttrykk i electroporated prøvene viste at målretting spesielt anterior-ventral otic vesikkel ikke bare retter seg mot den sensoriske domene innenfor det nevrale sensorisk kompetent (NSD) Epitel men også mål nevronale befolkningen som bor i NSD. Afferente neuroner innervating vestibular og auditive sanseorganer er hovedsakelig av otic placodal opprinnelse. Nevrogenese skjer over en lengre tidsperiode omtrent fra ~ E1.5 - E4.5 i dama, hvor neuroblasts, gjennomgår intense celleproliferasjon kontinuerlig delaminere fra NSD epitel otic cup (~ E1.5) og otic vesikkel (~ E2,5 - E4.5) og befolke som skiller nevroner cochlea-vestibular ganglion (CVG, VIII hjernenerven) 8,10,13,22.

Dessuten, med noen modifikasjoner vestibulære organer kan være målrettet med fremgangsmåten presentert. For eksempel kan den presumptive fremre crista være målrettet på E3, som ligger på rygg fremre spissen av anterior-ventral NSD 9. Electroporating på E4 rettet mot anterior-ventral otic vesikkel gir Focal ennå robuste GFP avskrift uttrykk innenfor sensoriske og ikke-sensorisk vev i alle de sensoriske vestibulære organer, nemlig cristae, og utricluar og saccular maculae (data ikke vist).

I konklusjonen, er det i ovo Metoden som presenteres her spesifikt for å gjennomføre gevinst-og tap-funksjoner starter på E4 og for å studere spredning og differensiering i utviklings kylling auditive organ. Videre kan denne fremgangsmåte lett kan tilpasses for å studere andre iner øre utviklings fenomener, inkludert indre øret neurogenesis og utvikling av vestibulære organer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Doris K. Wu for ekspresjonsplasmider og in situ sonder, Johns Hopkins University Center for Sensory biologi bildebehandling anlegget og Senter for hørsel og balanse. Dette arbeidet ble støttet av NIDCD Grant T32 DC000023 til LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
Gene Transfer inn i Chicken hørbar Organ av<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter