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Developmental Biology

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Embriões de galinha são sistemas modelo ideal para estudar o desenvolvimento embrionário como manipulações da função do gene pode ser realizada com relativa facilidade in ovo. O ouvido interno órgão sensorial auditivo é fundamental para a nossa capacidade de ouvir. Ele abriga um epitélio altamente especializada sensorial que consiste em células ciliadas de transdução mecano (HCs) e envolvente glial-como células de suporte (SCS). Apesar das diferenças estruturais nos órgãos auditivos, os mecanismos moleculares que regulam o desenvolvimento do órgão auditivo são evolutivamente conservada entre mamíferos e aves Em electroporação in ovo é largamente limitado a fases precoces em E1 -. E3. Devido ao desenvolvimento tardio relativa do órgão auditivo na E5, manipulações do órgão auditivo por em eletroporação in ovo passado E3 são difíceis devido ao desenvolvimento avançado do embrião de galinha em fases posteriores. O método aqui apresentado é um método de transferência de genes transitória para alvejar genes de interesse noestágio E4 - E4.5 no frango auditivo órgão sensorial desenvolvimento via in ovo micro-eletroporação. Este método é aplicável para gain- e perda de funções com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo convencional e pode ser combinada com a proliferação celular num ensaio in ovo adicionando EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) para todo o embrião no tempo de electroporação. O uso da proteína fluorescente verde ou vermelho (GFP ou RFP) plasmídeos de expressão permite que o experimentador para determinar rapidamente se a eletroporação alvo com sucesso a porção auditiva do ouvido interno em desenvolvimento. Neste trabalho método, exemplos representativos dos espécimes GFP electroporadas são ilustrados; embriões foram recolhidas 18-96 horas após a electroporação e a segmentação de GFP à região pró-sensitivo do órgão auditivo foi confirmada por RNA de hibridação in situ. O papel método também proporciona um protocolo optimizado para a utilização da timidina EdU analógico para analisar célula prolifração; um exemplo de um ensaio de proliferação celular baseado EdU que combina imuno-marcação e clique EdU química é fornecida.

Introduction

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Apesar das diferenças na morfologia e padronização celular entre os mamíferos e órgão sensorial auditiva aviária, os fatores moleculares e vias responsáveis ​​pelo desenvolvimento HC sensorial são pensados ​​para ser evolutivamente conservada 1-3. A papila basilar, que abriga os HCs auditivas e suas SCs circundantes, se desenvolve como um outpocketing do otocyst ouvido interno. Logo no início de uma piscina de progenitores HC e SC é especificado dentro do plac�io ótica ótica domínio / copo neural-sensorial competente (NSD). Dados destino de mapeamento de fornecer evidências de que linhagens neuronais e sensoriais são ligados e surgem da NSD localizada na região antero-ventral do copo ótica ou otocyst em ratos e galinhas 4,5. Em primeiro lugar, neuroblasts delaminate da NSD para dar origem aos neurônios do gânglio auditivo-vestibular, o que acabou dividida em gânglios auditivo e vestibular. Esses neurônios inervam os HCs sensoriais do ouvido interno e núcleos no tronco cerebral. As células Them permanecer no NSD são pensados ​​para dar origem a várias manchas sensoriais, incluindo o órgão auditivo sensorial, que consiste em os HCs sensoriais de transdução mecano e seus SCs associados.

Em ambos os pintos e murino, órgão auditivo progenitor sensorial saída do ciclo celular e diferenciação HC ocorrer em gradientes opostos. Em pintinho, progenitor auditiva saída do ciclo celular começa em torno de ~ E5 e progride a partir da base para o ápice, e do centro para a periferia 6. Um dia mais tarde, começa HC diferenciação no vértice e progride para a base 7. Estudando o desenvolvimento do ouvido interno em frango proporciona muitas vantagens técnicas como mecanismos funcionais podem ser investigadas com relativa facilidade in ovo em oposição a manipulação de embriões no útero, em outros sistemas de modelos, que requer cirurgias complexas. O método descrito aqui utiliza in ovo micro-electroporação de genes alvo de interesse no Basila presuntivoárea de papila r ântero-ventral na vesícula ótica especificamente a E4.

A electroporação in ovo é uma técnica que está bem estabelecida e utilizada 8-14. O princípio da técnica de electroporação, é baseado no facto de nucleótidos (por exemplo, ADN de plasmídeo, DNA sintético, RNA ou oligonucleótidos) são carregadas negativamente. O ADN é injectada no tecido de interesse. Quando uma corrente eléctrica é colocada ao longo do tecido, a actual abre poros transientes nas paredes das células e permite a captação do ADN, como flui do ADN carregado negativamente em direcção ao eléctrodo positivo (ânodo). Para as experiências de ganho-de-função, os genes de interesse são subclonados em vulgarmente plasmídeos de expressão que contêm cassetes de expressão adequados para a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente vermelha (RFP). Para as experiências de construções de perda de função com base em plasmídeos dominantes negativos repressores, ou RNAi, ou construções morfolino são commonly usado 15,16. Para inibir microARN (miARN) função miARNs construções de esponja, que são tipicamente plasmídeo com base, pode ser usado 17. O método aqui descrito permite investigar os mecanismos moleculares que controlam a proliferação e diferenciação no órgão auditivo, em que o método de micro-electroporação in ovo pode ser facilmente combinado com no ensaio de proliferação celular in ovo adicionando EdU a todo o embrião.

A electroporação e a adição de EdU é realizada em E4 na vesícula ótica, que é um dia antes do início da saída do ciclo celular no órgão auditivo. Análise do órgão auditivo é tipicamente realizada 18-96 horas após a electroporação em E5 (aparecimento de células progenitoras saída sensorial do ciclo celular), E6 (início da diferenciação HC), e E7 (durante a diferenciação HC); e mais tarde até ~ E9 (fim da diferenciação HC). Este método de electroporação de transferência de genes é transitória que dura aproximadamente 4 dias ~, because os genes de interesse não se integram no genoma, mas o método é aplicável para utilização com vectores de expressão à base de ADN de plasmídeo apropriado, que têm a capacidade de integrar no genoma, tal como a transferência de genes mediada Tol2-11. Com este método GFP robustos ou expressão RFP dura ~ 4 dias na cóclea, após o que apontam os sinais desaparecem, mas fornecem uma janela de tempo suficiente para estudar o desenvolvimento intrincado do órgão auditivo. Este, por método de transferência de genes in ovo é novo e permite que visar especificamente o órgão auditivo presuntivo em E4, que é ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. É um bom complemento para métodos alternativos, que electroporate em muito mais jovens estágios de desenvolvimento 11,12 ou em comparação com o uso de in vitro papilas basilar de explantes culturas 18.

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Protocol

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Os ovos e embriões não eclodidos são cuidadas e tratadas de forma ética e humana. Todos os protocolos de utilização de embriões unhatched foram aprovados pelo Animal Care e do Comitê Use na Johns Hopkins School of Medicine, em Baltimore, Maryland.

1. Os ovos e Preparação de construções de expressão

  1. Ovos:
    1. Incubar 3-4 dúzia de ovos de galinha fertilizados (Gallus gallus) deitado em seus lados a 37 ° C.
      1. Após 24 horas de incubação, puxe 3 cc de albumina com uma seringa a partir da extremidade traseira rodada do ovo e selar o buraco com fita adesiva transparente. Isto cria uma câmara de ar entre o embrião e a casca do ovo, permitindo a facilidade de acesso para o embrião sem o embrião que adere ao invólucro de corte quando a janela de acesso no topo do ovo 19.
      2. Em 117 horas de tempo de incubação, encenar os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton 20 estágios de desenvolvimentoa E4 (HH24-25) (ver figura 1D).
  2. Expressão Constrói:
    1. Prepara-se o ADN do plasmídeo usando reagentes e o protocolo fornecido pelo fabricante do kit de uma preparação disponível comercialmente. No passo final da preparação, eluir o ADN em 500 ul de TE (Tris-EDTA) tampão fornecido no kit para um tubo de 1,5 ml.
    2. Etanol precipitar o ADN para concentrá-la por adição de 50 ul de acetato de sódio 3M e 1 ml de etanol a 100% ao tubo. Colocar o tubo à temperatura de -20 ° CO / N.
    3. Centrifuga-se o tubo durante 30 minutos a 14000 rpm a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ar-secar o sedimento durante 10 minutos à TA. Dissolve-se o sedimento em 15 ul de tampão TE, os quais devem produzir uma concentração de ~ 4 mg / mL.
      NOTA: O construções de expressão de controlo utilizados aqui são PMES-IRES-GFP, 10, que é conduzido por um promotor de frango β-actina, ou pCI-H2B-IRES-RFP de CMV.

2. galinha In Ovo Micro-electroporação e In Ovo celular Ensaio de Proliferação

  1. Em Ovo Micro-injecção de construção de expressão e Micro-eletroporação:
    1. Retire os tubos capilares de vidro em agulhas finas utilizando um extractor de micropipeta com os seguintes parâmetros optimizados para um 2,5 x 2,5 milímetros Caixa de platina de aquecimento de filamento: Pressão = 500, de calor = 600 ° C, Pull = 64, velocidade = 105, e Tempo = 150 mseg (ver Tabela 1).
    2. Configure a esquerda e para a fase micro-manipulador destros flanqueando o microscópio (ver Figura 1A). O micro-manipulador Destro segura a agulha capilar de vidro e micro-manipulador canhota detém os eletrodos (Figura 1A).
    3. Prepare a agulha finamente puxado capilar de vidro para micro-injecção, cortandoa ponta da agulha com uma pinça, enquanto trabalha com o microscópio.
    4. Encher a agulha manualmente à mão usando o micro-manipulador com 2,5 ul de ADN de plasmídeo coloridas com 0,1% de Fast Green, enquanto que trabalham sob o microscópio.
    5. Coloque o ovo deitado de lado dentro de um dispositivo de suporte para moldes / ovo (ver Figura 1A). Cortar uma janela redonda na parte superior do ovo usando uma tesoura 19 (Figura 1A).
    6. Enquanto trabalhava sob o microscópio, abra com cuidado as duas membranas que recobrem o embrião usando uma pinça.
    7. Ao trabalhar sob o microscópio, entregar aproximadamente ~ 0,5 ul de ADN de plasmídeo para o lúmen vesícula ótica direita por micro-injecção manualmente utilizando a mão direita, utilizando o micro-manipulador e por micro-electroporação.
      1. Para tal, a micro-injectar o lúmen vesícula ótica direita com o ADN com o lado direito do micro-manipulador (Figura 1B-D), ao mesmo tempo usando a mão esquerda Holdinga pinça para segurar a cabeça do embrião, porque a cabeça do embrião mergulha na fase E4. Não micro-injetar passado o lúmen vesícula ótica, porque isso irá prejudicar a vesícula ótica.
      2. Imediatamente após a micro-injecção, enquanto trabalhava sob o microscópio, use a Esquerda mão micro-manipulador para colocar o positivo (ânodo) 2 milímetros eletrodo de platina ântero-ventral à vesícula ótica direita e o eletrodo de 2 milímetros negativo (cátodo) em paralelo 1 mm entre si (ver Figura 1 C). Deliver 4 impulsos a 12 V com 100 mseg de duração e espaçamento 200 mseg. A vesícula ótica esquerda serve como um controlo não tratado interno.
        NOTA: Limpe os eléctrodos entre electroporations com um chumaço de algodão embebido em 1x PBS.
  2. In Ovo celular Ensaio de Proliferação:
    1. Imediatamente após a electroporação adicionar 50 uL de 0,25 mg / mL em 1X PBS EdU soltando manualmente a solução EdU 50 ul para o conjuntoembrião no ovo usando uma pipeta. Selar os ovos com fita e retornar para o incubador durante 18-96 horas.
    2. Remova cuidadosamente a fita e verifique os embriões para GFP fluorescente ou sinal de RFP dentro da vesícula ótica após 18-24 horas usando um microscópio de fluorescência padrão (veja a Figura 1 EE '). Se o sinal fluorescente está presente, neste ponto colher os embriões para análise ou feche com fita adesiva e devolvê-lo para a incubadora para a colheita e analisa em fases posteriores (ver Figura 1 FP '').
      NOTA: Expressão de sinal de GFP com o constructo PMES-IRES-GFP é evidente 6-7 horas após a electroporação 10.

Colheita 3. Embryo e processamento de tecidos para o RNA hibridização in situ e imuno-histoquímica

  1. Colher os embriões usando uma pinça. Lavar o embrião em 1x PBS frio. Retirar as cabeças dos embriões, cortando a cabeça por seu pescoçousando uma pinça e coloque as cabeças em paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C. Perfurar o cérebro utilizando um fórceps para permitir a penetração do paraformaldeído 4% dentro da cabeça.
  2. Desidratar as cabeças em 30% de sacarose (em 1x PBS) O / N a 4 ° C.
  3. Montar as cabeças em forma crioprotector por congelação rápida em uma suspensão de gelo seco e metilbutano (2-metilbutano). Alternativamente, rápida congelar as cabeças em meio crioprotector com nitrogênio líquido. Armazenar as cabeças montadas à temperatura de -80 ° C.
  4. Criocorte as cabeças em 12 mm cortes de tecidos grossos e recolher todas as secções de tecido contendo ouvido interno em lâminas de microscópio de vidro superfrosted.
  5. Realizar ARN padrão de hibridação in situ e imuno-histoquímica como previamente descrito 4,21, analisar e para a proliferação celular EdU seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante do kit.
    NOTA: As células ciliadas podem ser identificadas usando policlonais de coelho α-MyosinVIIa (MYO7A) umtibody (1: 1000, Proteus Biosciences) e o anticorpo secundário marcado fluorescentemente (1: 250, de cabra anti-coelho AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Captura e Processamento de Imagem

  1. Tire fotos com equipamentos de imagem digital. Resultados de imunohistoquímica imagem com um microscópio de fluorescência padrão e os resultados dos controlos no local utilizando um microscópio de campo amplo padrão (que varia de 5x a 40x em ampliação).
  2. Processar as imagens usando o software de processamento de imagem.

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Representative Results

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Neste ADN método papel plasmídeo consistindo de proteína fluorescente verde (GFP) cassetes de expressão foi alvo para o desenvolvimento de frango papila basilar (PA), com parâmetros optimizados de 12 V e 4 impulsos com 100 duração do impulso mseg e intervalos de 200 mseg, obtendo-se uma ~ taxa de sobrevivência embrionária 50% e eficiência de plasmídeo de DNA alvo para a BP. Imagiologia de fluorescência da expressão da GFP nativa no desenvolvimento de embriões mostraram este método de electroporação preferencialmente alvos do aspecto anterior-ventral do otocyst, que dá origem ao PA (Figura 1 EE '; seta branca) e a expressão da GFP pode ser seguido ao longo de um curso de tempo de até cerca de ~ 4 dias (Figura 1 EH). RNA de hibridação in situ (ISH) foi usada para determinar se a electroporação alvo com sucesso a porção auditiva do ouvido interno em desenvolvimento. Para determinar se a GFP foi recolhido por auditivoprogenitores sensoriais, ISH experimentos foram realizados em secções adjacentes da BP. Dentro dos progenitores sensoriais em desenvolvimento BP foram identificados pela sua expressão de Sox2 (Figura 1 K e N) e franja excêntrica (Lfng) (Figura 1 J). Estas experiências demonstram que progenitores sensoriais em todo o BP desenvolvimento, como mostrado para a base (Figura 1 I; suporte de preto) e vértice (Figura 1 G; suporte de preto), foram visados ​​e expressar GFP após 68 h de electroporação (Figura 1 I com sucesso e L; parênteses preto). Além disso, a GFP foi expresso fora do domínio sensorial em células epiteliais não sensoriais (Figura 1 I e L; setas vermelhas) e no gânglio auditivo (Figura 1I e L; AG, setas amarelas) marcado pela expressão Neurod1 (Figura 1M) . Numa experiência típica GFP (Figura 1 H); isso permite que o investigador para analisar o padrão espacial e temporal da retirada do ciclo celular progenitor sensorial e diferenciação no BP em desenvolvimento. Para determinar o comportamento de proliferação de progenitores sensoriais, o EdU analógico timidina foi adicionada no momento da electroporação em E4. Quatro dias mais tarde, EdU incorporação na BP desenvolvimento foi analisada em cortes de tecidos usando o "clique" química. Imuno-marcação para a proteína específica do HC MyosinVIIa (MYO7A) foi utilizado para identificar HCs diferenciadores na BP em desenvolvimento. Na porção apical da BP MYO7A + HCs foram frequentemente EdU + (Figura 1 PP '; P' ', setas brancas), enquanto que na base de poucos MYO7A + HCs tinha incorporado EdU (Figura 1 OO'; O '', setas brancas), sugerindo que, no momento da adição EdU em E4, Pro sensorialgenitores na base já estão postar em grande parte mitótico. Estes resultados confirmam estudos anteriores de gradientes de saída do ciclo celular e diferenciação HC oposto na pinto BP 6,7.

figura 1
Figura 1. In Ovo electroporação & In Ovo celular Ensaio de Proliferação. (AD) imagens de campo claro de método de electroporação. In ovo a micro-injecção para dentro da vesícula ótica direita (B) e a colocação dos eléctrodos após a micro-injecção de segmentação zona ântero-ventral a vesícula ótica (C). Embrião no estágio HH24-25 após micro-injeção e eletroporação (D; vesícula ótica verde, seta preta). (EH) proteína fluorescente verde (GFP) expressão após a eletroporação. ( (E ') a expressão da GFP em 18 horas (vesícula ótica, seta branca). (FH) As setas brancas indicam a expressão da GFP em 40 h (F, vesícula ótica), 68 h (L, PA), e em 88 horas (H, PA). (IN) adjacentes cocleares Tissue-seções da BP sondado para GFP, Lfng, Sox2 e Neurod1 transcritos pela RNA hibridização in situ em 68 hr. Lfng (J, suporte de preto) e Sox2 (K e N, suporte preto) marcar o epitélio sensorial e Neurod1 (M) marca o gânglio auditivo (AG). GFP é expressa dentro sensorial (I e L, suporte de preto) e o tecido não-sensorial (I e G, setas vermelhas), e o umgânglio uditory (I e L, setas amarelas). (OP '') imagens fluorescentes de MyosinVIIa (MYO7A) / EdU rotulagem. (O'-O '' e p'-P '') ampliações de O e P. (S 'e P') mais EdU rotulagem esteja presente no epitélio sensorial no vértice (P ', suporte de branco) do que na base (S', o suporte de branco). O '' e P '') intercalados imagens fluorescentes, setas brancas indicam a MYO7A (+) / EdU (+) células ciliadas no vértice (P '') e a base (S ''). Mais células EdU (+) estão presentes dentro do gânglio auditivo no vértice (P, AG) do que na base (S, AG). (sac; saccule em O). (A, anterior e V, Ventral em painéis B eE). Escala de barras 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O método aqui descrito de in ovo micro-electroporação é optimizado para a transferência de genes para o órgão auditivo em desenvolvimento. É compatível com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo tipicamente usadas para manipular a função do gene / expressão. O momento da eletroporação na E4 é o ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. Os passos mais críticos são micro-injecção do ADN para o lúmen vesícula ótica sem ir muito profunda, com a agulha e danificar a vesícula ótica (ver Fig. 1A-D), tendo como alvo o ADN para o domínio ântero-ventral da vesícula ótica pela colocar os eletrodos em conformidade (ver Fig 1C.), e entregar os parâmetros eletroporação otimizadas de 4 pulsos em 12 V. Estes são otimizados parâmetros eletroporação e concentração de DNA plasmídeo otimizado (~ 3,5-4 mg / mL) para alvejar especificamente a auditiva presuntivo órgão em E4. Inicialmente começamos out realização electroporations a 6 V, que não produziu sinais fluorescentes. A voltagem foi aumentada incrementalmente, utilizando 8 V e 10 V, 12 V ser óptima. Da mesma forma, o número de impulsos para fornecer e as durações de pulso e espaçamento dos impulsos foram optimizados. A 12 V, 4 impulsos com duração de 100 ms e 200 ms espaçamento é ideal. Esses parâmetros não são apenas ideal para a obtenção de transferência de genes eficiente na E4, mas também são ideais para uma taxa de sobrevivência de embriões de aproximadamente ~ 50%. Se nenhum sinal fluorescente é obtida dentro de 24 horas da electroporação, o seguinte deve ser considerado: 1.) Certifique-se de que a concentração de ADN de plasmídeo é de pelo menos 3,5 ug / uL. 2.) ajustar o parâmetro por electroporação 2 V, por exemplo a 10 ou 14 V. Tal como para a obtenção de embriões E4 (HH24-25) estágio dentro de 117 horas de tempo de incubação (ver Fig. 1D), a temperatura da incubadora para os ovos devem ser optimizado entre 37-39 ° C, com mais ou menos horas de incutempo bation precisava de 117 horas, dependendo da temperatura usada, pois há variações na segurando e funcionando temperaturas utilizando diferentes incubadoras entre diferentes laboratórios. Vários análogos da timidina incluindo BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) ou EdU podem ser usadas para estudar a proliferação das células in ovo. No entanto, o uso de qualquer dos compostos tem que ser optimizado para cada estágio de desenvolvimento, como também a maior parte do composto em prova tóxico para a viabilidade celular / embrião e muito pouco do composto prova ineficaz. Este método descreve o uso optimizado de EdU a uma concentração de 0,25 mg / ml aplicadas como 50 ul em todo o embrião no ovo especificamente para estudar a proliferação de célula e célula-ciclo-saída do E4 em diante.

Em electroporação in ovo como um método de manipulação genética tem algumas limitações. Um número relativamente grande de ovos são necessários para electroporação em E4 com construções de controlo adequados e para os Experimentacondições l. Isto é devido a uma proporção de ovos, cerca de ~ 27%, sendo inutilizável para electroporação, devido a uma combinação de falta de fertilização, defeitos do desenvolvimento e a mortalidade embrionária. Outro fator importante a considerar é a taxa de sobrevivência dos embriões após a eletroporação. A taxa de sobrevivência é de cerca de ~ 50%. Isto é devido ao facto de que os embriões mais velhos em E4 não sobrevivem bem depois de ter sido manipulado; embriões mais jovens são mais resistentes e tolerar ser manipulado melhor. Expressões dos genes de interesse após a electroporação em E4 são focal e localizada ao longo de todo o ducto coclear incluindo tecido não-sensorial e sensoriais, bem como o gânglio auditivo. A razão para a expressão mais focal e localizada é porque o alvo da electroporação é a, órgão auditivo subdesenvolvidos presuntivo em E4, antes de o órgão auditivo galinha começa a crescer para fora em E5 e se alonga na sua forma em forma de foice característico por ~ E9 1 . Por último, The método é transitória onde os sinais de expressão só permanecem durante ~ 4 dias, porque os genes de interesse utilizados aqui não integrar-se no genoma. No entanto, o método pode ser utilizado com construções de expressão à base de plasmídeos adequados que possuem a capacidade de se integrar no genoma.

Dominando o método de eletroporação requer alguma prática, os olhos e as mãos treinadas, e experiência em trabalhar com embriões de galinha. As referências previstas desenvolvimento do ouvido interno e de frango atlas de desenvolvimento servem como bons guias e são bons pontos de partida para um iniciante. Depois de dominar o método de electroporação com estes parâmetros optimizados, o método pode ser utilizado para manipulações na vesícula ótica fechado a partir de E2 a ~ E4.5. Embora para electroporating na E2 e E3, 10 V deve ser usado em vez de 12 V. Para eletroporação em E1 visando o plac�io ótica e copo ótica, eletrodos de platina personalizados com parâmetros eletroporação modificados podem ser usados 8-10. Além de estudar o desenvolvimento do órgão auditivo este método também se presta para estudar o desenvolvimento do gânglio auditivo inervação. Análise de expressão GFP em amostras eletroporados revelou que vise especificamente a vesícula ótica ântero-ventral não só tem como alvo o domínio sensorial dentro do (NSD) epitélio neural-sensorial competente, mas também tem como alvo a população neuronal que residem dentro da NSD. neurônios aferentes que inervam os órgãos sensoriais vestibulares e auditivos são principalmente de origem placodal ótica. Neurogênese ocorre durante um período de tempo prolongado aproximadamente de ~ E1.5 - E4.5 no pintainho, onde neuroblastos, submetidos a intensa proliferação celular delaminate continuamente a partir do epitélio NSD do copo ótica (~ E1.5) e vesícula ótica (~ E2.5 - E4.5) e preencher como diferenciar neurônios do gânglio coclear-vestibular (CVG; nervo craniano VIII) 8,10,13,22.

Além disso, com algumas modificações órgãos vestibulares pode ser orientada com o método apresentado. Por exemplo, a crista anterior presuntivo pode ser alvo na E3, que fica na ponta dorsal anterior do NSD ântero-ventral 9. Electroporating em E4 alvejando as ântero-ventral rendimentos vesícula ótica focal expressões GFP transcrito ainda robustos no tecido sensitivo e não-sensorial em todos os órgãos sensoriais vestibulares, ou seja, nas cristas, e utricluar e máculas sacular (dados não mostrados).

Em conclusão, o método in ovo aqui apresentado é específico para a realização de ganho e de perda de funções a partir de E4 e para estudar a proliferação e diferenciação na galinha órgão auditivo em desenvolvimento. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado para estudar outras emner ouvido fenômenos de desenvolvimento, incluindo a neurogênese ouvido interno eo desenvolvimento de órgãos vestibulares.

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Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Doris K. Wu por plasmídeos de expressão e sondas in situ, o Centro Universitário Johns Hopkins para a instalação de imagem Biologia Sensorial e do Centro de Audição e Equilíbrio. Este trabalho foi apoiado por NIDCD Grant T32 DC000023 a LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação
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Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

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