Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Перенос генов в Куриный органа по Слуховые doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Куриные эмбрионы являются идеальными модельные системы для изучения эмбрионального развития , как манипулирование функции генов может быть проведена с относительной легкостью в яйце. Внутреннее ухо слуховой сенсорный орган, имеет решающее значение для нашей способности слышать. В нем располагаются узкоспециализированный сенсорную эпителий, который состоит из клеток волос механико-преобразовательный (ГЦ) и окружающих глиальных как поддерживающие клетки (SCS). Несмотря на структурные различия в слуховых органах, молекулярные механизмы , регулирующие развитие слухового органа эволюционно консервативны у млекопитающих и Aves В ово электропорации в значительной степени ограничена на ранних стадиях E1 -. Е3. Из - за относительной позднего развития органа слуха при E5, манипуляциями слухового органа по ово в электропорации прошлом E3 затруднено ввиду опережающего развития куриного эмбриона на поздних стадиях. Метод, представленный здесь, является временным методом переноса гена для нацеливания генов, представляющих интерес вэтап Е4 - E4.5 в развивающемся куриной слуховом органа чувств с помощью в ово микро-электропорации. Этот метод применим для амплитудно и с потерей функции с экспрессирующих векторов на основе ДНК обычные плазмиды и могут быть объединены с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Эду (5-этинил-2'-дезоксиуридин) ко всему эмбриона на время электропорации. Использование зеленого или красного флуоресцентного белка (GFP или RFP) плазмид экспрессии позволяет экспериментатору быстро определить, успешно ли целевой электропорации слуховую часть проявляющего внутреннего уха. В этом методе бумаги, представительные примеры GFP электропорации образцов показаны; Эмбрионы собирали 18 - 96 ч после электропорации и адресности GFP к про-сенсорной области слухового органа была подтверждена РНК гибридизация. Метод бумаги также обеспечивает оптимизированную протокол для использования аналогам тимидина ОБР для анализа клеток Пролифжалюзей; пример на основе Edu анализа клеточной пролиферации, который сочетает в себе иммуно-маркировку и нажмите EDU химии обеспечивается.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Несмотря на различия в морфологии и клеточных кучность между млекопитающих и птиц слуховом органа чувств, молекулярные факторы и пути , ответственные за развитие сенсорных HC , как полагают, эволюционно консервативны 1-3. Базилярной сосочка, в котором находится слуховой HCs и окружающих их ГКС, развивается как outpocketing внутреннего уха отоциста. Уже на раннем этапе пула HC и SC прародителей указана в ушные плакоды / ушные чашки нейронная-сенсорной области компетентного (НРД). Данные Судьба картированию свидетельствуют о том , что нейронные и сенсорные клоны связаны между собой и возникают из НРД , расположенной в передне-вентральной области ушные чашки или отоциста у мышей и цыплят 4,5. Во-первых, нейробласты вычленяются из НРД привести к нейронам слуховому-вестибулярный ганглий, который в конечном итоге расщепляется на слуховом и вестибулярном ганглиях. Эти нейроны иннервируют сенсорные HCs внутреннего уха и ядер в стволе мозга. Клетки-йпо-прежнему в НРД, как полагают, приводят к различным сенсорных участков, в том числе слухового органа чувств, состоящий из механико-преобразовательный сенсорных ГЦ и связанных с ними SCS.

В обоих кур и мышиным, орган слуха сенсорно прародитель выход из клеточного цикла и дифференцировки HC происходят в противоположных градиентов. У кур, слуховое прародитель выход из клеточного цикла начинается около ~ E5 и прогрессирует от основания к вершине, и от центра к периферии 6. Через день НС дифференциация начинается в вершине и прогрессирует к основанию 7. Изучение развития внутреннего уха у кур предоставляет множество технических преимуществ , как функциональные механизмы могут быть исследованы с относительной легкостью в яйце , в отличие от манипулирования эмбрионов в утробе матери и в других модельных системах, что требует сложных операций. Описанный здесь метод использует в ово микро-электропорации целевых генов , представляющих интерес в презумптивной basilaг площадь сосочек передне-вентрально в слуховым пузырьком конкретно в Е4.

Электропорация в яйце является метод , который хорошо известна и широко используется 8-14. Принцип метода электропорации основан на том факте , что нуклеотиды (например, плазмидная ДНК, синтетическую ДНК или РНК олигонуклеотиды) заряжены отрицательно. ДНК вводят в интересующую ткань. Когда электрический ток помещают поперек ткани, ток открывает переходные поры в клеточных стенках и обеспечивает поглощение ДНК, поскольку потоки отрицательно заряженная ДНК в направлении положительного электрода (анода). Для усиления из-функции экспериментов, представляющих интерес генов обычно субклонировали в экспрессирующие плазмиды, которые содержат соответствующие кассеты экспрессии для зеленого флуоресцентного белка (GFP) или красного флуоресцентного белка (RFP). Для потери из-функции экспериментов плазмиды на основе доминантных негативных конструкций репрессор или RNAi или морфолино конструкции сommonly использовали 15,16. Для подавления микроРНК (миРНК) Функция микроРНК губки конструкции, которые , как правило , плазмиду , на основе, могут быть использованы 17. Описанный здесь метод позволяет исследовать молекулярные механизмы , которые контролируют пролиферацию и дифференцировку в слуховом органе, как в ово методе микро-электропорации можно легко комбинировать с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Edu всему эмбриона.

Электропорации и добавление Эду выполняется на Е4 в слуховым пузырьком, который за один день до начала выхода из клеточного цикла в слуховом органе. Анализ органа слуха обычно проводят 18 - 96 ч после электропорации при E5 (Наступление сенсорных клеток-предшественников выхода из клеточного цикла), E6 (начало ХК дифференциации), и E7 (во время дифференцировки HC); а позже до ~ E9 (конец HC дифференциации). Этот метод электропорации переноса гена преходяще продолжительностью около ~ 4 дней, becauсебе гены интерес не интегрируются в геном, но этот метод применим для использования с подходящим плазмидных векторов экспрессии , основанных на ДНК, которые действительно имеют возможность интеграции в геном, такие как Tol2-опосредованного переноса гена 11. С помощью этого метода надежные GFP или RFP выражения длится ~ 4 дня в улитке, после чего указывают сигналы увядают, но обеспечивают достаточное окно времени, чтобы изучить запутанную развитие слухового органа. Это , в ово способе переноса генов является новым и позволяет конкретно целевой предположительный органа слуха при E4, который является оптимальным для исследований , которые сосредоточены на развитии HC в слуховом органе. Это является хорошим дополнением к альтернативным методам, которые электропорации на гораздо более молодых стадиях развития или 11,12 по сравнению с использованием в пробирке базилярной сосочков эксплантов культур 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Яйца и невылупившиеся эмбрионы заботу и лечение с этической точки зрения и гуманно. Все протоколы для невыведенное использования эмбрионов были одобрены уходу и использованию животных комитета на Джона Хопкинса школы медицины, Балтимор, штат Мэриленд.

1. Яйца и подготовка выражение конструирует

  1. Яйца:
    1. Выдержите 3 - 4 десятка оплодотворенных куриных яиц (Gallus Gallus) лежа на боку при 37 ° C.
      1. Через 24 часа инкубации тянуть 3 куб.см белке с помощью шприца с круглой задней части яйца и загерметизировать отверстие с прозрачной лентой. Это создает воздушную камеру между эмбрионом и яичной скорлупы, что позволяет для облегчения доступа к эмбриону без зародыша торчащий к корпусу при резке окно для доступа на верхней части яйца 19.
      2. В 117 ч времени инкубации стадии эмбрионов в соответствии с Гамбургер и Гамильтон 20 стадий развитияв E4 (HH24-25) (см 1D).
  2. Expression Создаёт:
    1. Готовят плазмидной ДНК с использованием реагентов и протокол, предоставляемый производителем коммерчески доступного набора препарата. На заключительном этапе подготовки, элюции ДНК в 500 мкл ТЕ (Трис-ЭДТА) предоставленный буфер в наборе в 1,5 мл пробирку.
    2. Этанол осаждения ДНК, чтобы концентрировать ее путем добавления 50 мкл 3 М ацетата натрия и 1 мл 100% этанола к трубе. Поместите пробирку при -20 ° CO / N.
    3. Отцентрифугировать пробирку в течение 30 мин при 14000 оборотах в минуту при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и воздушно-сухой осадок в течение 10 мин при комнатной температуре. Растворить осадок в 15 мкл ТЕ-буфера, который должен давать концентрацию ~ 4 мкг / мкл.
      Примечание: выражение конструирует управления , используемые здесь , являются ПМЭС-IRES-GFP 10, который приводится в движение с помощью куриных β-актина или ЧКВ-Н2В-IRES-RFP CMV.

2. Куриное В Ovo Micro-электропорации и в Ovo пролиферации клеток Пробирной

  1. В Ово микроинъекции экспрессии конструкта и Micro-электропорации:
    1. Потяните стеклянные капилляры на тонкие иглы с использованием микро-пипетки съемник со следующими оптимизированными параметрами для 2,5 х 2,5 мм Box Платиновый нагрева нити накала: Давление = 500, тепла = 600 ° C, Pull = 64, Скорость = 105, и времени = 150 мс (см таблицу 1).
    2. Настройка левой и правой рукой этапы микро-манипуляторы фланговые микроскоп (рис 1А). Правой рукой микро-манипулятор имеет стеклянную капиллярную иглу и левой рукой микро-манипулятор имеет электроды (рис 1А).
    3. Подготовьте тонко вытащил стеклянную капиллярную иглу для микроинъекции резаниемкончик иглы с пинцетом во время работы под микроскопом.
    4. Заполните иглу вручную вручную с помощью микро-манипулятором с 2,5 мкл ДНК плазмиды тонированных с 0,1% Fast Green во время работы под микроскопом.
    5. Поместите яйцо , лежащую на его стороне в устройстве формы / яйцо удержания (см рисунок 1А). Вырезать круглое окно на верхней части яйца с помощью ножниц 19 (Фигура 1А).
    6. Работая под микроскопом, осторожно откройте две мембраны, перекрывающей эмбриона с помощью щипцов.
    7. Во время работы под микроскопом, обеспечивают примерно ~ 0,5 мкл ДНК плазмиды с нужными слуховым пузырьком просвет путем микроинъекции вручную, используя правую руку с помощью микро-манипулятором и микро-электропорации.
      1. Для этого, микро-инъекционные правильные слуховым пузырьком просвет с ДНК с правой рукой микро-манипулятором (рис 1B-D) в то же самое время , используя левую руку Holdinга Forcep, чтобы стабилизировать голову эмбриона, потому что голова эмбриона опускается на стадии Е4. Не микро-инъекции мимо слуховым пузырьком просвет, так как это приведет к повреждению слуховым пузырьком.
      2. Сразу же после того, как микро-инъекции, во время работы под микроскопом, с помощью левой руки микро-манипулятор, чтобы поместить положительный (анод) 2 мм платиновый электрод передне-вентральной к правому слуховым пузырьком и отрицательным 2 мм электрода (катода) параллельно 1 мм друг от друга (см Рисунок 1 C). Deliver 4 импульса на 12 В с 100 мсек и 200 мсек интервала. Левый слуховым пузырьком служит внутренним необработанным контролем.
        Примечание: Очистите электроды между electroporations с ватным тампоном, смоченным в 1x PBS.
  2. В Ovo пролиферации клеток Пробирной:
    1. Сразу после электропорации добавляют 50 мкл 0,25 мг / мл Edu в 1x PBS вручную сбросив 50 мкл раствора Edu на целомэмбрион в яйце с помощью пипетки. Печать яйца с лентой и вернуться в инкубаторе в течение 18 - 96 часов.
    2. Осторожно снимите ленту и проверить эмбрионов для флуоресцентного сигнала GFP или RFP в слуховым пузырьком после 18 - 24 часов с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа (см Рисунок 1 EE '). Если флуоресцентный сигнал присутствует, на данный момент урожай эмбрионов для анализа или запечатать с лентой и вернуть его в инкубатор для сбора и анализа на более поздних стадиях (см Рисунок 1 FP '').
      Примечание: Выражение сигнала GFP с ПМЭС-IRES-GFP конструкции очевидна 6 - 7 ч после электропорации 10.

3. Эмбрион Сбор и обработка ткани для РНК в гибридизация и иммуногистохимии

  1. Урожай эмбрионов с помощью щипцов. Ополосните эмбриона в холодной 1x PBS. Удалите головы эмбрионов, путем отрезания головы его шеис помощью щипцов, и поместите голову в 4% параформальдегид O / N при 4 ° С. Прокол мозг с помощью Forcep, чтобы обеспечить проникновение 4% параформальдегидом внутри головы.
  2. Высушить головы в 30% сахарозы (в 1x PBS) O / N при 4 ° С.
  3. Установите головки в криозащитной среде путем быстрого замораживания в суспензии сухого льда и метилбутана (2-метилбутан). В качестве альтернативы, быстрое замораживание головы в криозащитной среде с жидким азотом. Храните смонтированные головы при -80 ° С.
  4. Cryosection головы на секции толщиной ткани 12 мкм и собрать все внутренние срезы ткани уха, содержащих на superfrosted микроскопа стеклах.
  5. Выполните стандартную РНК гибридизация и иммуногистохимии в , как описано выше 4,21, и анализировать для пролиферации клеток Edu в соответствии с протоколом , предоставленного производителем набора.
    Примечание: клетки волос могут быть идентифицированы с использованием кроличьих поликлональных альфа-MyosinVIIa (Myo7a)tibody (1: 1000, Proteus Biosciences) и флуоресцентно меченных вторичное антитело (1: 250, козы к антителам кролика AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Захват и обработка изображений

  1. Возьмите изображения с цифровым оборудованием обработки изображений. Результаты изображения иммуногистохимия со стандартным флуоресцентным микроскопом и результаты in - situ с использованием стандартного широкого поля микроскопа ( в диапазоне от 5х до 40х в увеличении).
  2. Обработки изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом методе бумаги плазмидной ДНК, состоящей из зеленого флуоресцентного белка (GFP) кассеты экспрессии были направлены в разработку цыпленка базилярной сосочка (BP) с оптимизированными параметрами 12 В и 4 импульсов с длительностью 100 мс импульсов и интервалов 200 мс, что дает ~ 50% выживаемость эмбрионов и эффективность плазмидной ДНК таргетирования в BP. Флуоресцентные изображения родной экспрессии GFP в развивающихся эмбрионах показали этот метод электропорации преимущественно нацелен на передне-вентральной отоциста, что приводит к BP (Рисунок 1 EE '; белая стрелка) и экспрессия GFP может следовать за время курса до примерно ~ 4 дней (Рисунок 1 EH). РНК - гибридизация (МОГ) в использовалась , чтобы определить , является ли успешно мишенью электропорации слуховую часть проявляющего внутреннего уха. Для того, чтобы определить, было ли принято GFP вверх по слуховымсенсорные клетки-предшественники, ISH эксперименты проводились на соседних участках BP. В развивающихся BP сенсорные клетки - предшественники были идентифицированы по их экспрессии Sox2 (рис 1 K и N) и лунатиков (Lfng) (рис 1 J). Эти эксперименты показывают , что сенсорные клетки - предшественники в развивающемся BP, как показано на основание (рис 1 I, черный скобка) и вершиной (рис 1 л, черный кронштейн), были успешно направлены и выражают GFP после 68 ч электропорации (рис 1 I и L; черные скобки). Кроме того, была выражена GFP вне сенсорной области , в несенсорных эпителиальных клеток (рисунок 1 I и L, красные стрелки) и в слуховом ганглии (рис 1I и L; Аg, желтые стрелки) , отмеченного выражением Neurod1 (рис 1M) , В типичном эксперименте GFP (рисунок 1 H); это позволяет исследователю анализировать пространственную и временную схему вывода клеточного цикла сенсорных клеток-предшественников и дифференциации в развивающемся ВР. Для того, чтобы определить, пролиферативную поведение сенсорных клеток-предшественников, то к аналогам тимидина ОБР был добавлен во время электропорации на E4. Четыре дня спустя, Edu включение в развивающихся ВР была проанализирована в срезах тканей с помощью "мыши" химии. Иммуно-маркировка для HC-специфического белка MyosinVIIa (Myo7a) использовали для идентификации дифференцирующие HCs в развивающихся ВР. В вершинной части BP Myo7a + ГЦ часто Edu + (рисунок 1 РР ', P' ', белые стрелки), в то время как в базе лишь немногие Myo7a + ГЦ включил Эду (Рисунок 1 OO', O '', белые стрелки), предполагая, что в момент ОБР добавления при E4, сенсорная проgenitors в базе уже в значительной степени размещать митоза. Эти результаты подтверждают предыдущие исследования противоположных градиентов выхода из клеточного цикла и дифференцировки HC у кур BP 6,7.

Рисунок 1
Рисунок 1. В Ovo электропорации и в Ово клеток Анализ пролиферации. (AD) Светлое изображения методом электропорации. В ово микроинъекции в правый слуховым пузырьком (B) и размещения электродов после микроинъекции таргетингом на передне-вентральной области в слуховым пузырьком (C). Зародыш на стадии HH24-25 после того, как микро-инъекции и электропорации (D; зеленый слуховым пузырьком, черная стрелка). (ЭГ) зеленый флуоресцентный белок (GFP) , выражение после электропорации. ( (Е ') выражение GFP в 18 ч (слуховым пузырьком, белая стрелка). (FH) Белые стрелки указывают на экспрессию GFP в 40 ч (F, слуховым пузырьком), 68 ч (G, ВР), и на 88 ч (Н, ВР). (В) Прилегающие кохлеарные тканевого участки BP протестировал GFP, Lfng, Sox2 и Neurod1 транскриптов РНК в гибридизация при 68 ч. Lfng (J, черный кронштейн) и Sox2 (K и N, черный кронштейн) отметьте чувствующий эпителий и Neurod1 (M) отмечает слуховую ганглий (AG). GFP выражается в сенсорных (I и L, черный кронштейн) и несенсорных ткани (I и L, красные стрелки), и Auditory ганглий (I и L, желтые стрелки). (OP '') Флуоресцентные изображения MyosinVIIa (Myo7a) / EDU маркировки. (О'-O '' и P'-Р '') увеличениями о и р. (O 'и Р') Более Edu маркировка присутствует внутри сенсорного эпителия на вершине (P ', белый кронштейн) , чем у основания (O', белый кронштейн). O '' и P '') Merged флуоресцентные изображения, белые стрелки указывают на Myo7a (+) / ОБР (+) волосковых клеток в вершине (Р '') и основание (O ''). Больше Эду (+) клетки присутствуют в слуховом ганглии на вершине (P, Ag) , чем у основания (O, Ag). (НКК; мешочка в O). (A, Передней и V, Брюшной в панелях В иЕ). Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Описанный здесь метод в ово микро-электропорации оптимизирован для переноса генов в развивающемся слуховом органе. Он совместим с экспрессирующими векторами на основе ДНК плазмиды обычно используются для манипулирования функции гена / экспрессии. Время проведения электропорации на E4 является оптимальной для исследований, которые сосредоточены на развитии HC в слуховом органе. Наиболее важные шаги микро-инъекции ДНК в слуховым пузырьком просвет , не вдаваясь слишком глубоко с иглой и повреждения слуховым пузырьком (см. 1A-D), нацеливание ДНК в передне-вентральной области слуховым пузырьком по помещая электроды соответственно (см. 1C), и поставляя оптимизированные параметры электропорации 4 импульсов при 12 В. Эти оптимизированные параметры электропорации и оптимизированы концентрации плазмидной ДНК (~ 3,5 - 4 мкг / мкл) для специально нацеленные на предполагаемую аудиторию органа в Е4. Изначально мы начали оут проведение electroporations на 6 V, который не дал никаких флуоресцентные сигналы. Напряжение постепенно увеличена за счет использования 8 В и 10 В, с 12 V является оптимальным. Аналогичным образом, количество импульсов для доставки и длительности импульсов и интервалов между импульсами были оптимизированы. На 12 V, 4 импульсы с 100 мсек и 200 мсек интервал является идеальным. Эти параметры не только идеально подходит для получения эффективного переноса гена в E4, но также идеально подходит для выживаемости эмбрионов примерно ~ 50%. Если ни один флуоресцентный сигнал не будет получен в течение 24 ч электропорации, то следует учитывать следующее: 1.) Убедитесь, что концентрация плазмидной ДНК составляет по меньшей мере 3,5 мкг / мкл. 2.) Настройте параметр электропорации на 2 V, например , 10 или 14 V. Что касается получения эмбрионов E4 (HH24-25) стадии в течение 117 ч времени инкубации (см рис. 1D), температуру инкубатора для яиц должны быть оптимизированы между 37 - 39 ° C с большим или меньшим количеством часов INCUтребуется время bation, чем 117 ч в зависимости от температуры, используемой, поскольку существуют различия в холдинге и работает с использованием различных температур инкубаторы среди различных лабораторий. Различные тимидина аналоги включая BrdU (5-бром-2'-дезоксиуридина) или Edu могут быть использованы для изучения пролиферации клеток ово. Тем не менее, использование любого из соединений должно быть оптимизировано для каждой стадии развития, как слишком большая часть соединения оказывается токсичным для жизнеспособности клеток / эмбриона и слишком мало соединения оказывается неэффективным. Этот метод описывает оптимизированное использование ОБР при концентрации 0,25 мг / мл в качестве применяемого 50 мкл на весь эмбрион в ово специально для изучения пролиферации клеток и клеточного цикла выход из E4 вперед.

В ово электропорации в качестве метода генной манипуляции имеет некоторые ограничения. Относительное большое количество яиц требуются для electroporations в Е4 с соответствующими конструкциями управления и для experimentaл условия. Это происходит из-за пропорции яиц, примерно ~ 27%, будучи непригодными для электропорации из-за сочетания отсутствия оплодотворения, пороки развития и гибель эмбриона. Другим важным фактором является уровень выживаемости эмбрионов после электропорации. Выживаемость составляет примерно ~ 50%. Это связано с тем, что старшие эмбрионов на E4 не хорошо выживают после того, как манипулируют; молодые эмбрионы являются более устойчивыми и терпимо манипулируют лучше. Выражения интересующих генов после электропорации в Е4 фокальной и локализованы в течение всего улиткового канала, включая несенсорных и сенсорной ткани, а также слуховом ганглии. Причиной более фокусной и локализованной экспрессии происходит потому , что объектом электропорации является предположительным, неразвитый орган слуха на Е4, перед началом курица орган слуха расти на Е5 и удлиняется в его характерной серповидным форме ~ E9 1 , И, наконец, йМетод е является временным, где выражение сигналы остаются только в течение ~ 4 дня, потому что гены интереса, используемые здесь не интегрируют в геном. Тем не менее, этот метод может быть использован с соответствующей искусственной плазмиды на основе экспрессирующих конструкций, которые имеют возможность интеграции в геном.

Овладение методом электропорации требует некоторой практики, обученные глаза и руки, а также опыт работы с куриных эмбрионах. Ссылки, предусмотренные внутреннее развитие уха и куриных атласов развития служат как хорошие проводники и хорошие стартовые позиции для новичка. После освоения метода с этими оптимизированными параметрами электропорации, метод может быть использован для манипуляций в замкнутом слуховым пузырьком от Е2 до ~ E4.5. Хотя для электропорации в E2 и E3, 10 V следует использовать вместо 12 В. Для электропорации в E1 ориентации отическую плакоду и ушные чашки, настроенные платиновые электроды с измененными параметрами электропорации могут быть использованы 8-10. В дополнение к изучению развития органа слуха этот метод также поддается изучению развития иннервирующих слуховом ганглии. Анализ экспрессии GFP в электропорации образцов показали , что нацеливание специфически передне-вентральной отический пузырек не только ориентирована на сенсорное домен в нейронном-сенсорно компетентному (НРД) эпителия , но и нацелен на нейронную популяцию , которые находятся в пределах НРД. Афферентные нейроны иннервирующие вестибулярные и слуховые сенсорные органы, в первую очередь из ушные плакодной происхождения. Нейрогенез происходит в течение длительного периода времени приблизительно от ~ E1.5 - E4.5 в птенца, где нейробласты, подвергающиеся пролиферацию клеток интенсивный непрерывно вычленяются из НРД эпителия ушные чашки (~ E1.5) и слуховым пузырьком (~ E2.5 - E4.5) и заселить в дифференциации нейронов кохлеарного-вестибулярный ганглий (CVG, VIII черепных нервов) 8,10,13,22.

Кроме того, с некоторыми изменениями вестибулярных органов могут быть направлены с методом, предложенным. Например, передняя Предположительный гребешок могут быть направлены на Е3, которая лежит на спинной передней оконечности передне-вентральной НРД 9. Электропорации на E4 нацеливание передне-вентральной ушные выходы везикул очаговых еще устойчивые выражения GFP транскриптов внутри сенсорной и не сенсорной ткани во всех сенсорных вестибулярных органов, а именно гребешков и utricluar и саккулярной пятнах (данные не показаны).

В заключение отметим , что в ово метод , представленный здесь , является специфическим для проведения коэффициента усиления и потерь функций , начиная с Е4 и для изучения пролиферации и дифференцировки в развивающемся курином слуховом органе. Кроме того, этот способ может быть легко адаптирован для изучения других внер уха явления развития, в том числе внутреннего уха нейрогенеза и развития вестибулярных органов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Дорис К. Ву для экспрессии плазмид и зондов измерений в точке, Университета имени Джона Хопкинса Центр Сенсорное объекта биологии визуализации и Центр слуха и равновесия. Эта работа была поддержана NIDCD Грант T32 DC000023 на LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
Перенос генов в Куриный органа по Слуховые<em&gt; В Ово</em&gt; Micro-электропорации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter