Introduction
Patienter med neuropsykiatriska funktionsnedsättningar visar vanligtvis underskott i social kommunikation (t.ex. patienter med autismspektrumstörningar, schizofreni, eller Alzheimers sjukdom) 1. Genetiskt modifierade möss allt oftare används för att modellera genetiska orsakerna till dessa sjukdomar 2. Studera social kommunikation i dessa musmodeller är av stort intresse för att förstå mekanismerna för genetiska mutationer som leder till atypiska sociala dysfunktioner och för att testa nya terapier. Eftersom möss är sociala djur och kommunicerar med varandra med hjälp av lukt, taktil, visuella och akustiska signaler, de är lämpliga modeller för att utvärdera social kommunikation.
Mus ultraljud vocalizations nu för närvarande används som en proxy för att modellera de genetiska grunderna för talkommunikation underskott 3,4 (men förekomsten av sång lärande i denna art är fortfarande diskuteras 5,6, även om de flesta nya studier argUe för frånvaron av vokala inlärning 7). Laboratoriemöss har visat sig avge ultraljud vocalizations i mor-spädbarn relationer, i män och kvinnor socio sexuella interaktioner i samkönade sociala interaktioner (översikt i referens 8) och juvenil juvenil sociala interaktioner 9. Mus valpar avger isolerings samtal under de första två veckorna i livet när isolerade från dammen och syskon 10. Manlig avger ultraljud läten när i närvaro av en brunst kvinnliga (eller urin signaler från henne) 11,12. Hanar och honor avger ultraljuds läte när de interagerar med en okänd conspecific av samma kön 13,14. Organisationen och funktioner av dessa vocalizations är inte helt klar och behöver ytterligare undersökningar. Aktuell kunskap om den funktionella aspekten är begränsad till framkallande av hämtnings beteende hos mödrar höra valp isolerings samtal, underlättande av närhet av vuxna kvinnor mot vuxna manliga vocalizatjoner 15 och den ökade undersökande beteende vuxna män hörsel vuxna kvinnliga läten 16.
Karakterisera avvikelser i talkommunikation i musmodeller av neuropsykiatriska störningar bör ske i standardiserade förhållanden för att utesluta betydande bidrag av experimentella betingelser. Sådana karakteriseringar, i kombination med utvärdering av samtidiga sociala interaktioner och neurobiologiska studier i olika genetiska modeller bör förbättra vår kunskap om den genetiska bidrag till de olika aspekterna av mus ultraljud kommunikation. Under en lång sikt bör det ge ytterligare ljus över vissa neurobiologiska grunderna för social kommunikation hos människor. Vi strävar nu till att ge enkla protokoll för att på ett tillförlitligt sätt framkalla ultraljud vocalizations under utveckling och i vuxen ålder för både manliga och kvinnliga möss i laboratoriet. Sådana protokoll bör underlätta standardiseringen av inspelningarna till mer tillförlitligt jämföra Ultrasonic utsläpp vocalization mellan stammar och laboratorier. Det bör också underlätta inrättandet av sådana inspelningar i laboratorier som inte har någon tidigare erfarenhet med mus ultraljud läten inspelningar. Vi belyser också den nuvarande möjligheten att kombinera ultraljud läten data med detaljerade beteendemässiga data som samlas in samtidigt under sociala interaktioner hos vuxna möss, för att få viktig information om sociala funktionsnedsättningar samt samband med utsläpp av ultraljud läten. Sådana analyser kommer att kasta nytt ljus över organisationen och funktioner mus ultraljud vocalizations. Slutligen, vi annonserar också möjligheten att dela ultraljud läten inspelningar med hela forskarsamhället på mouseTube databasen (http://mousetube.pasteur.fr). Fri tillgång till ljudinspelning uppgifter bör öka kunskapen om musen ultraljud kommunikation genom att tillåta forskare att jämföra sina egna data med ultraljud läten som spelats in i andra laborier (med liknande eller olika stammar / protokoll), och / eller att utmana sina analysmetoder med filer inspelade under olika förhållanden.
Protocol
Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Comité d'Ethique en experimenterande animale (CETEA) nr 89 vid Institut Pasteur, Paris.
1. Animaliska Beredning
- Om du vill spela valp isolerings samtal, få dräktiga honor från musstam av intresse. Obs: Ras heterozygota hanar och honor för att få åtminstone 10 kullar inklusive vildtypen, heterozygot och knock-out valpar att få robusta kontrolldjur.
- Skaffa två kategorier av vuxna möss för att spela in läten under samma kön interaktioner.
- Erhålla åtminstone 12 hanar eller 12 honor av varje genotyp som testmöss från stammen av intresse (att ta hänsyn till interindividuell variabilitet). Obs: Detta protokoll är väl anpassad för vuxna, men det kan anpassas till ungdomar, med minskad isolering innan försöket 9. Detta test fungerar för män eller kvinnor. Undvik dock att testa manligs från musstammar som visar en tydlig aggressiv fenotyp i hane-hane social interaktion testet.
- Att maximera mängden affiliative interaktioner, isolera testdjuren före experimenten. Hus män individuellt för 3 veckor (för att minska aggressiva interaktioner till ett minimum 14,17) och kvinnor för 3 dagar (E. Ey, opublicerade data) för att öka deras sociala motivation.
- Skaffa män eller kvinnor från stammar representativa för den genetiska bakgrunden till teststammen för att använda dem som nykomlingar (t.ex., som samverkande möss, se 3.1.3). Till exempel, om den muterade stammen som studeras har genererats på C57BL / 6J bakgrund, använd C57BL / 6J möss som nykomlingar. Beräkna antalet djur som behövs så att var och en av dessa möss inte används mer än 2 gånger per dag som nykomling. Hysa dem i grupper.
- Erhålla två kategorier av vuxna möss för att spela in manliga läten i närvaro av en brunst hona.
- Skaffa på löster 12 könsmogna hanar från varje genotyp av stammen av intresse (att ta hänsyn till interindividuell variabilitet). Obs: Om män har aldrig haft erfarenhet av kvinnor före, lägg dem i individuella burar och lämna dem tillbringa en natt med en kvinnlig två dagar före testet för att öka deras motivation att avge ultraljud läten 6.
- Skaffa könsmogna honor från bakgrunden stam av inspelade män. Till exempel, om de muterade män som studeras har genererats på C57BL / 6J bakgrund, använd C57BL / 6J honor. Beräkna antalet honor som behövs, så att var och en av dessa möss inte används mer än 3 gånger per dag. Hysa dem i grupper.
2. Pup Isolation samtal
- pup Identifiering
- Tre dagar före den förutsagda dagen för födseln, isolera dräktiga hondjur.
- Kontrollera honorna för födelse varje morgon och varje kväll. Notera dagen för födelsen som P0.
- Identifiera valparna på P1 använder långvarig tass tatueringar (subkutan injektion av grön tatuering klistra med en 0,3 mm x 13 mm [30 G ½ "] nål). Skapa en kod med en, två, tre eller fyra tassar markerade. Var så fort som möjligt, för att minimalt störa valparna, och lägg tillbaka dem i boet så snart som möjligt.
- Ställ in Cage till Record Pup Isolation samtal.
- Använd antingen en self-made ljudisolerade kammare (Figur 1A) eller en enkel frigolit låda. Placera en termometer inuti rutan för att övervaka temperaturen för varje inspelning. Se till att temperaturen är mellan 18 ° C och 22 ° C.
- Placera en mikrofon på toppen (genom ett hål i toppen av lådan). Justera höjden på mikrofonen så att membranet i mikrofonen är 12-15 cm ovanför botten av lådan där valpen kommer att ligga ner. Anslut mikrofonen till ljudkortet och ljudkortet i datorn.
- Att justera förstärkningen av sound kort, göra en inspelning prov med en valp som inte kommer att användas i försöket. Sätt valpen på samma villkor som i experimentet (se 2.3.1). Stäng dörren. Justera förstärkningen på ljudkortet, så att det är på det maximala värdet (ha den högsta amplitud möjligt för läten) men utan att överbelasta (kolla på live spektrogram visas på inspelningsprogrammet).
Notera: Några samtal kan överbelastas om amplituden av majoriteten av samtalen hålls på högsta möjliga nivå. - Registrera förstärkningsnivån för varje inspelningssession och inte ändra det mellan pups / kullar / sessioner. Variationer i förstärkningsnivåer skulle leda till felaktiga samtalsdetektering och akustiska variabler åtgärder med samma tröskelvärden i analyser med automatisk detektering och mätning (se 5,1-5,4).
- Genomför registrering av valp isolering samtal varannan dag. Genomför inspelningar på morgonen för valpar födda i natten, och på eftermiddagen för valpar födda under dagen för att undvika kategorisering i samma åldersklass valpar med en halv dag av åldersskillnad. Detta är mest märkbara för mycket unga stadier P2 och P4.
- Ta en valp i kullen. Placera den så snabbt och skonsamt som möjligt i en plast mottagare tvättas med etanol 10% och torkas (diameter: 9centimeter; höjd: 10 cm för att förhindra äldre valpar från att fly från det område som omfattas av mikrofonen). Sätta mottagaren strax under mikrofonen.
- Stänga boxen som snabbt och tyst som möjligt. Starta inspelningen av pup ultraljud vocalizations i inspelningsprogrammet (16-bitars format, 300 kHz samplingsfrekvens för att fånga upp ljud amplitud upp till 150 kHz med en hög kvalitet).
- Efter den tid som krävs för inspelningen har förflutit (upp till 5 minuter), stoppa inspelningen. Ta valpen ur lådan. Skriv ner tass tatueringar av valp.
- Ta armhålan temperatur valpen med en sond-termometer. Mark valpen på rygg med en liten punkt med en lukt mindre penna (vatten bläck), att erkänna lättare de redan inspelade valpar i boet när nästa väljs och för att undvika att manipulera alla valpar varje gång en ny är valt. Sätt valpen tillbaka i boet.
- Tvätta plast mottagaren och plast som täcker dess botten med 10% etanol och torka den välinnan nästa valp inuti.
- Välj nästa valp i kullen och upprepa 2,3.
- Kontrollera kroppsvikt, motorisk koordination, negativa geotaxis och utvecklingstecken (för mer information om den minskade testbatteri se metod avsnitt i et al. Schmeisser 18 och i Ey et al. 19) efter en period av vila av en timme för att tillåta valparna att återhämta sig efter ansträngande utsläpp av ultraljud läten. Använd en annan kohort av djur om hela utvecklingstestbatteri som i et al. Chadman 20 och et al. Scattoni 21 genomförs.
- Upprepa dessa inspelningar varannan dag mellan P2 och P12 för att karakterisera pup sång beteende och utveckling i hela sina första två veckorna i livet.
3. Ultraljuds Vocalizations under samma kön sociala interaktioner
- vocalization Record
- Förbered en test bur (50 x 25 cm x 30 cm 3; Plexiglas, 100 lux [lågintensiv vitt ljus]) rengöras med tvålvatten, torkas och fyllda med 2 cm nytt strö i ljudisolerade kammare.
- Placera mikrofonen så att läten som avges från alla hörn av buren kan registreras. Fäst mikrofonen i ett hörn av testburen (antingen på buren eller på ett stativ) och justera vinkeln mikrofon burbottnen att täcka buren hela yta.
Obs: Ultraljud är mycket riktningsgivande. - Placera en videokamera på toppen av ljudisolerade kammaren för att fånga hela ytan av testburen.
Observera: Kontrollera att mikrofonen inte döljer ett hörn av test buren på videon. - Före testning, justera förstärkningen av ljudkortet med en outnyttjad hane och ett extra hona som inte kommer att användas i experimentet senare. Sätt dessa djur i test bur i inspelningen kammaren. Justera förstärkningsnivån på ljudkortet för att maximera amplituden av de inspelade läten but för att minimera överbelastning sett i levande spektrogram visas på inspelningsprogrammet.
Obs: Förstärkningen beror på avståndet mellan mikrofonen och de vocalizing djur.
- Placera mikrofonen så att läten som avges från alla hörn av buren kan registreras. Fäst mikrofonen i ett hörn av testburen (antingen på buren eller på ett stativ) och justera vinkeln mikrofon burbottnen att täcka buren hela yta.
- Presentera djuret som ska testas (manlig eller kvinnlig, det kommer att kallas "åkande") i testburen på nytt strö. Låt det vänja till test bur i den ljudisolerade kammare under 20 minuter för att maximera sitt intresse för det okända conspecific infördes 3.1.3.
- Efter denna tillvänjning tid införa 2: a djuret för interaktionen (manlig eller kvinnlig, samma kön som den åkande, men olika öronmärken / tass tatuering för att identifiera dem senare, det kommer att kallas "nykomne").
- Starta inspelningen ultraljuds läten (16-bitars format, 300 kHz samplingsfrekvens för att fånga upp ljud amplitud upp till 150 kHz med en hög kvalitet) och videon för att fånga införandet av nykomne i testburen. Börja spela in ultrasonic läten under tillvänjning (ensam åkande) om det behövs en jämförelse mellan grundnivån för vocalization utsläpp under bur prospektering och social interaktion.
- Synkronisera manuellt / visuellt ljud och videoinspelningar genom att trycka på den tid watch ( "pip" ljud nära mikrofonen) exakt när baktassarna i nykomne mus vidrör marken.
- Låt de två djuren samverkar för önskad tid (till exempel fyra minuter, en varaktighet tillräcklig för att samla in tillräckligt ultraljud läten).
- Sätt den åkande och nykomne tillbaka i sina respektive hemma burar. Töm använt strö från test bur, tvätta med tvål vatten och torka den med hushållspapper. Sätt nytt strö och placera den tillbaka i ljudisolerade kammare för nästa test.
- Förbered en test bur (50 x 25 cm x 30 cm 3; Plexiglas, 100 lux [lågintensiv vitt ljus]) rengöras med tvålvatten, torkas och fyllda med 2 cm nytt strö i ljudisolerade kammare.
4. Man vocalizations Under interaktion med en Estrus Kvinna
- Tidigt på morgonen dagen för testning avmän, ta vaginala smetar från varje hona för att bestämma deras sexuella status inom brunstcykel.
- Håll honan i svansen och hålla henne på buren nätet. Använd en pipett för att skölja slidan flera gånger med 20 pl PBS (dvs injicera och minnas samma 20 pl PBS flera gånger). Minnas det 20 | il PBS med samma pipettspetsen. Använd steril PBS, för att undvika infektion om kvinnor ska testas för flera på varandra följande dagar.
- Sprid PBS innehållande suspensionen av vaginala celler på ett objektglas. Sätt fyra prover på en bild (identifiera de personer vid sidan av bilden med en penna). Låt objektglasen torka innan de utför färgningen.
- Arbeta under laboratorie dragskåp.
- Förbereda ett bad av ren maj-Grunwald, ett bad av fosfatbuffertlösning (0,1 M) och ett bad av Giemsa R (20/01 i fosfatbuffertlösning).
- Sätta objektglasen i badet av ren maj-Grunwald under 3 min, sedanskölj dem i badet av fosfatbuffertlösning under 1 min och slutligen överföra dem under 10 min i badet av Giemsa R (20/01 i fosfatbuffertlösning).
- Efter det, skölj glasen igen i bad av fosfatbuffertlösning under 10 sekunder och låta dem torka.
- Undersök de färgade objektglasen under mikroskop. Honor som kan användas under dagen är de vars prover närvarande endast stora cornified epitelceller (utan kärna, färgas i blått, full brunst).
- Sätt hanarna i provrummet åtminstone 30 minuter innan du testar dem.
- vocalization Record
- Upprepa 3,1 om så är nödvändigt.
- Presentera den manliga som skall testas (på nytt strö). Lämna honom vänja till test bur i den ljudisolerade kammare under 10 min.
- Efter denna tillvänjning tid införa en kvinna i brunst (bland dem valda från färgning).
- Starta inspelningen ultraljuds vocalizations och videoatt fånga införandet av honan i testburen. Starta inspelningen ultraljuds läten under tillvänjning (man enbart) om det behövs en jämförelse mellan grundnivån för vocalization utsläpp under bur prospektering och social interaktion.
- Synkronisera manuellt / visuellt ljud och videoinspelningar genom att trycka på den tid watch ( "pip" ljud nära mikrofonen) exakt när baktassarna hos den kvinnliga musen vidrör marken.
- Låt de två djuren samverkar för önskad tid (till exempel fyra minuter, en varaktighet tillräcklig för att samla in tillräckligt ultraljud läten).
- Sätt manliga och kvinnliga tillbaka i sina respektive hemma burar. Töm använt strö från test bur, tvätta med tvål vatten och torka den med hushållspapper. Sätt nytt strö och placera den tillbaka i ljudisolerade kammare för nästa test.
Obs: Det är optimalt att använda varje brunst kvinnliga endast en gång varje dag (men vid behov det kananvändas upp till 3 gånger på samma dag, men inte i en rad).
5. Variabler som extraheras
- Förbered ljudfiler för analyserna. Obs: Proceduren nedan är specifika för en VISOFT SASLab Pro och kan ändras beroende på den programvara som används.
- Skär filerna så att de börjar exakt på "pip" av tiden klocka, och avslutas efter den önskade varaktigheten (5 min för pup inspelningar, 4 min för vuxna inspelningar).
- Filtrera bort amplitud mindre än 30 kHz med hjälp av en högpassfilter (Edit> Filter> FIR Time Domain Filter, högpassfilter med 30 kHz avskurna). Använd batch-bearbetning för att filtrera alla filer av intresse (Åtgärder> Gruppbearbetning> FIR-filter).
- Identifiera varje ultraljuds läte genom att märka dem med programvaran.
- Använd automatisk detektering för pup inspelningar (Verktyg> Etiketter> Skapa avsnitt etiketter från vågformshändelser). Justera tröskeln, hålltid och marginal feller den mest exakta upptäckt. manuellt kontrollera att upptäcka och justera etiketter vid behov (rekommenderas).
- Använd visuell detektering (manuell insättning av etiketter) för vuxna inspelningar med bakgrundsljud (välj läten, högerklicka, och sätt avsnitt etikett från markör).
- Skapa spektrogram. Aktivera automatiska mätningar parameter (Verktyg> Automatisk parametermätningar> Automatiska Parameter Mätningar Ställ in).
- Kontrollera "Aktivera automatiska mätningar", de "Beräkna parametrar från hela spektrogram" och "Automatisk uppdatering" lådor. Välj "Element separation": interaktivt (avsnitt etiketter).
- Kryssrutorna för att beräkna de önskade tidsparametrarna (varaktighet element Intervall, start- / sluttid) och spektrumbaserade parametrar (Peak frekvens), och placeringen av mätningar (Start av element, Slut på elementet, Mean Max, Min) .
- Kopiera mätningarna och klistra inm i ett kalkylblad.
Obs! Inspelningar som utförts med vuxna, kan mätningar av spektrumbaserade parametrar vara omöjligt på grund av bakgrundsljud. Använd manuella mätningar av toppfrekvensen genom att klicka på de olika frekvensvärden direkt på spektrogram och klistra in värden manuellt i en tabell.
- Bestämma samtalsfrekvens, dvs antalet samtal per minut genom att först bestämma antalet läten utsända (totalt antal etiketter). Sedan beräkna samtalsfrekvens genom att dividera det totala antalet läten registrerats av varaktighet (minuter) i filen.
- Bestämma tids organisation, dvs fördelningen av tidsintervall mellan samtal för att bestämma sekvens organisation.
- Beräkna tidsintervall mellan slutet av vocalization n och början av vocalization n + 1 med hjälp av start / sluttid för varje etikett.
- Fastställa densitetsfördelningen av tidsintervallen mellan Ultrasonic läten.
- Bestämma samtals repertoar, dvs definierar samtalstyper som förekommer i inspelningen. Använda exemplet med klassificering presenteras i tabell 1 och figur 1B.
- När du namnger varje vocalization i 5.1.3, skriva namnet på samtalstyp i etiketten.
- Beräkna det exakta antalet och andelen av varje samtalstyp för att bygga den vokala repertoar.
- Bestämma akustiska egenskaper för varje läte, det vill säga, varaktighet, maximalt frekvens (dvs frekvensen med den högsta amplituden) i början och slutet av samtalet, högsta och lägsta toppfrekvensen, och menar frekvens om automatisk mätning är möjligt (Figur 1B) .
- Använd den automatiska parametermätningar funktion i programvaran för att mäta automatiskt varaktighet toppfrekvensegenskaper (t.ex. start, slut, medelvärde, maximum, minimum) i pup inspelningar. Använd varaktighet etiketten som varaktigheten av läte för vuxna inspelningar. Mät manuellt på spektrogram fönstret toppfrekvensegenskaperna (t.ex. start, slut, maximum, minimum).
- Par ultraljuds vocalization uppgifter och social interaktionsdata (MiceProfiler plugin från de isiga plattform 22).
- Se till att synkronisera så exakt som möjligt ljud- och videoupptagningar som beskrivs i protokollet.
- Koda videon av social interaktion med hjälp av möss Profiler Tracker plugin av den isiga plattformen som beskrivs i de Chaumont et al. 22. Starta spårningen exakt när baktassarna hos den införda djur vidrör marken.
- Ladda den kodade videofilen och dess motsvarande xml-fil (som genereras av möss Profiler Tracker) i möss Profiler Video Label Maker plugin av den isiga plattformen som beskrivs i de Chaumont etal. 22.
Obs: Möss Profiler Video Label Maker plugin automatiskt koppla videofilen och textfilen som genereras från analysen av ljudfilen om de har samma namn (se: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) . - Efter att ha kontrollerat att musen skala är korrekt, klicka på "Skapa UPS-statistik" för varje fil för att erhålla antalet och andelen läten som släpps ut under varje social händelse i en separat fil.
6. Ladda upp filer på mouseTube Database
- Se till att filerna på en lagringsserver som kan nås från utanför institutionen.
Obs: Servrar värd i vissa institutioner med hög säkerhetsnivåer kommer att behöva en viss konfiguration för att vara tillgängliga för människor som ansluter från utanför institutionen. - Gå till mouseTube webbplats (http://mousetube.pasteur.fr). Logga in (logga in ennd lösenord tillskrivs varje användare av administratörerna).
- Kontrollera om musstam registreras redan finns i mouseTube databasen genom att klicka på "Stammar" -knappen. Om inte, be administratörer att skapa den.
- Skapa ämnen med hjälp av "betvingar> Skapa" -knappen. Ange identifieringskoder för de djur som registrerats. Samla dem i grupper för att underlätta senare hämtning av data.
- Ange beskrivningen av protokoll som används för att spela in ultraljud läten med hjälp av "Protokoll> Skapa" -knappen.
- Skapa ett experiment för varje inspelningssession med hjälp av "Experiment> Skapa" -knappen. Ange protokollet, den grupp av personer som har spelats in, hårdvara och mjukvara som används och deras särdrag.
Obs: Experimentet samlar all metadata som motsvarar de läte filer. - Skapa länk till läte filer med hjälp av "läten> skapa & #34; knapp. Välj experimentet i listan. Kopiera och klistra in webbadressen till den vocalization filen (denna länk börjar med http: // ...) i motsvarande fält "Filer att länka" kolumnen. Bekräfta posterna genom att klicka på knappen "Skapa en länk mellan mouseTube och filer".
Obs: Det är inte nödvändigt att fylla varje ruta för varje fil samtidigt. - Om det är nödvändigt, ändra länkarna inmatade när som helst, och lägga till information i avsnittet "Notes". Tveka inte att skriva ner anteckningar att ge fler detaljer. Till exempel, om en länk mot en videofil som spelades in samtidigt med ljudfilen har matats in, detta kan anges i "Notes".
Representative Results
Med nuvarande protokoll, vi karaktäriserat sång beteende hos möss som saknar ProSAP1 / Shank2, en gen associerad med autismspektrumstörningar (ASD) 23-25. ASD kännetecknas av underskott i social kommunikation och stereotypa beteenden 1. Våra Shank2 - / - möss visade hyperaktivitet, ökad ångest och atypiska talkommunikation 18,26. I själva verket noterade vi att Shank2 - / - möss visade en atypisk utvecklingsprofil i sin utsläppsnivån för valp isolerings samtal i jämförelse med den typiska inverterad U-formad kurva i deras vildtyp kullsyskon Shank2 -. / - Möss visade en ökad sats på P4 och minskad sats på P6 i jämförelse med deras vildtyp kullsyskon (Figur 2). Vi observerade också en minskad sats hos kvinnliga interaktioner som involverar en Shank2 - / - hona i JÄMFÖRELSEn med interaktioner mellan en vild-typ kull (Figur 2). Vi undersökte repertoaren av de 5 olika samtalskategorier. Det föreföll att vara annorlunda mellan valpar (till exempel här P2, P6 och P10) och vuxna (Figur 3). Genotyp relaterade skillnader var betydande mestadels i vuxen ålder. Under sociala interaktioner mellan vuxna Shank2 - / - män eller kvinnor med en C57BL / 6N hona, var mer korta samtal och ostrukturerade samtal registreras i jämförelse med interaktioner mellan deras vildtyp kullsyskon (figur 3D och E). Mindre komplicerade samtal och frekvensen hoppar samtal noterades också under interaktioner med C57BL / 6N kvinnliga involverar vuxna Shank2 - / - honor i jämförelse med interaktioner mellan Shank2 + / + honor (figur 3E). Slutligen, mätte vi också manuellt akustiska variabler. Det fanns ingen signifikant genotyp relaterad skillnad during utveckling. I motsats, varaktigheten av samtal som registrerats under interaktioner mellan vuxna Shank2 - / - honor var kortare än vad som framgår under interaktioner mellan deras vildtyp kullsyskon (Figur 4A). Vi betonade också att toppfrekvensen för ultraljuds läten ökade under valp utveckling utan signifikant genotyp relaterad skillnad 26. Under interaktioner mellan Shank2 - / - män eller kvinnor med en C57BL / 6N hona, ultraljud vocalizations hade en lägre topp frekvens i jämförelse med samtal som registrerats under interaktioner mellan deras vildtyp kullsyskon (Figur 4B).
Dessutom det nuvarande protokollet tillåts också att studera samband med utsläpp av ultraljud läten genom att kombinera data från ljudinspelningar till beteendemässiga data som extraherats från MiceProfiler (ICY programvara, Institut Pasteur, Paris). Till exempel, i kvinno kvinnlig interaktioner, var de flesta ultraljud läten hörs när djuren var i kontakt och mer specifikt den sittande sniffa nykomne är ano-genitala regionen, eller åtminstone den åkande att ligga bakom nykomlingen. Möss som avges också många ultraljud vocalizations när den åkande närmade sig nykomne (Figur 5, övre panelen). Mindre läten noterades när den åkande Shank2 - / - möss var i fysisk kontakt med nykomne (t.ex. sniffa ano-genitala regionen av den nykomne) än när passageraren var en vild-typ mus. Mindre läten utlöstes när den åkande bakom nykomne var en Shank2 - / - mus än när det var en vild-typ mus. Fler läten noterades också när nykomne var i synfältet passagerarens musen, och mer så i det vilda typer än i mutanterna (Figur 5, lägre panelen).
s = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 2:. Emissionshastigheten för ultraljud läten under utveckling och hos vuxna manliga och kvinnliga Shank2 - / - möss och vildtyp kullsyskon Ring hastighet av valpar (varannan dag från P2 till P12, n = 18-19 Shank2 + / +, n = 15-16 Shank2 - / -) och vuxna under mans estrus kvinnliga interaktioner (n = 15 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 - / -) och kvinnliga kvinnliga interaktioner (n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 - / -) av vildtyp möss (vänster panel) och Shank2 - / - möss (högra panelen). Data presenteras som medelvärde +/- SEM och individuella punkter (icke-parade Wilcoxon-tester: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).ge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Vocal repertoar av Shank2 - / - möss och vildtyp kullsyskon proportionerna av de fem olika samtalstyper som sänds ut av P2 ungar (A; n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), P6 pups (B; n = 19 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), P10 ungar (C; n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), vuxna män med en brunst kvinnliga (D ; n = 16 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 - / -) och till vuxna kvinnor med en annan kvinnlig (E; n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 - / -) i vildtyp möss (vänster paneler) och Shank2 - / - möss (höger sida). Data presenteras som medelvärde +/- SEM och enskilda punkter (chi-kvadrat test: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Akustiska variabler extraherade från ultraljuds vocalizations i Shank2 - / - möss och vildtyp kullsyskon (A) Varaktighet för alla samtalstyper förvirrad utsänds av P2 pups (n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / - ), P6 pups (n = 19 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 - / -), P10 ungar (n = 20 Shank2 + / + Shank2 - / -), vuxna män med en brunst kvinnliga (n = 16 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 - / -) och vuxna honor med en annan kvinnlig (n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 - / -) av vildtyp möss (vänster fält) och Shank2 - / - möss (högra panelen). (B) Maximal toppfrekvensen mätt på alla samtalstyper förvirrad i P2 valpar, P6 valpar, P10 valpar, vuxna män med en brunst hona och vuxen hona med en annan kvinnlig (samma Ns som ovan). Data presenteras som medelvärde +/- SEM och enskilda punkter (icke-parade Wilcoxon tester: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Context. s av utsläpp av mus ultraljud läten i hona-hona vuxna sociala interaktioner Andel av ultraljud läten som avges av par som omfattar en Shank2 + / + med en C57BL / 6N mus (n = 16, A) och par som omfattar en Shank2 - / - med en C57BL / 6N mus (n = 13, B) under följande typer av beteendehändelser (red: åkandes, grön: nykomne): sociala kontakter, oro oral kontakt, ano-genital sniffning från passagerar mus, anod- genital sniffa från nykomne mus, åkande bakom nykomne, nykomne bakom åkande, orörlighet åkande, orörlighet nykomne, strategi från den sittande och fly från nykomne, strategi från nykomlingen & fly från den sittande, strategi och fly från den sittande, strategi och fly från nykomne, åkande efter nykomne, nykomlingen i synfältet passagerarens, åkande i synfältet för nykomlingen. Data är pharmades som medelvärde +/- SEM och individuella punkter (icke-parade proven Wilcoxon: * p <0,05, ** p <0,01). Opublicerade data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| samtalstyper | Beskrivning |
| kort | varaktighet ≤5 ms och frekvensområdet ≤6.25 kHz |
| enkel | längd> 5 ms och frekvensområdet ≤6.25 kHz (flat), eller frekvensmodulering i endast en riktning (uppåt eller nedåt) med frekvensområdet> 6,25 kHz |
| komplex | frekvensmoduleringar i mer än en riktning och frekvensområde> 6,25 kHz (modulerad), eller införande av en eller flera ytterligare frekvens component (harmoniska eller icke-linjära fenomen, men ingen mättnad) men ingen begränsning på frekvensområde (komplex) |
| frekvenshopp | införande av ett hopp (en frekvens hopp) eller flera hopp (frekvens hopp, m.fl.) i frekvens utan tidslucka mellan frekvenskomponenterna i följd, med (blandad) eller utan någon bullriga del inom den rena tonen samtal |
| ostrukturerad | ingen ren ton komponent identifieras; "bullriga" samtal |
Tabell 1:. Kännetecken för fem typer av mus ultraljud vocalizations Exempel på kriterier för varaktighet, frekvensområde, frekvensmoduleringar och frekvenshopp används för att bestämma 5 olika samtalstyper inom mus ultraljud läten.
Discussion
Protokollet presenteras här ger standardiserade och tillförlitliga sätt att samla mus ultraljud vocalizations i laboratoriet. Dessa mycket begränsade situationer har fördelen av standardisering. De används med framgång för att jämföra stammar eller genotyper inom stammar 18,19,26,27. Som framgår av de representativa resultat, de kan användas för identifiering av atypiska social kommunikation hos möss muterade för Shank2, en gen associerad med autismspektrum. Jämförelser mellan musstammar, mellan olika sammanhang eller ens mellan laboratorier kommer att utlösas av tillgången på större datamängder på mouseTube databasen. Detta verktyg bör öka studier på mus ultraljud vocalizations genom att multivariata analyser.
De protokoll som beskrivs här är optimerade för att testa möss av olika genotyper inom en stam, som det görs i de flesta studier modellering genetiska contribution till neuropsykiatriska störningar. Det rekommenderas att experimentellt utforma varje undersökning för att få de bästa kontrollerna möjliga. I själva verket kan strö effekter mask eller artificiellt blåsa genetiska effekter 28,29. Det är därför lämpligt att inkludera kull kontroller för varje genotyp. Avels heterozygota föräldrar bör därför gynnas, eftersom det kommer att möjliggöra rätt matchning av muterade och kontrollmöss inom en kull. Detta motiverar tass tatuering märkning av alla valpar (blinda för genotyp) för att spåra personer under inspelningarna varannan dag. Genotypning sker vid avvänjning, genom att svansprover. Vid inspelning valp isolerings samtal från P2 på, skulle vi inte rekommendera att ta svans prov redan i valpar, eftersom denna operation tilläggsinformation manipulation och stress mycket nära i tiden till en inspelning.
De protokoll som föreslås här för att framkalla ultraljud vocalizations hos vuxna inte tillåter tydlig identifiering av EMItter av läten. Detta förklarar varför vi manipulera motivation försöksdjuret. I själva verket är de testmöss isolerades och inte det nya-comer och försöksdjuren vänja sig under en lång tid till testburen under samma kön interaktioner. I män och kvinnor interaktioner, är den införda kvinnliga inte isolerade och test manliga habituates för kortare tid eftersom motivation kan vara högre i denna sexuella sammanhang. Dessa manipulationer av motivation bör maximera sannolikheten för testet musen avger de läten och inte infört ett. Att spela manliga ultraljud vocalizations i ett sexuellt sammanhang, kan en enkel bomullstopp med färsk (dvs inte fryst) urin från en brunst kvinnliga också införas i buren 30. Denna metod gör det möjligt att tilldelningen av ultraljud vocalizations på prov hane med 100% säkerhet, men det förhindrar att samla någon specifik information om den faktiska sociala sammanhang för utsläpp av dessa läten. Därför föredrar vi protocol som beskrivs här (med en fritt rörliga brunst hona). Vi rekommenderar också att alltid använda infört möss från samma stam vid provning möss från en mutant stam och att analysera data som ett par möss vocalizing. En färsk studie främjar användningen av triangulering för att lokalisera sändaren 31. I denna studie var honor visade sig också avge ultraljud läten under möten med en hane. Detta kan förklaras av det faktum att de var isolerade i minst två veckor innan inspelningen. Generaliseringen av användningen av triangulering föreslås i denna studie bör dock möjliggöra identifiering av sändaren av läten i de flesta fall om videoinspelningar är ordentligt synkroniseras.
Isolerings samtal från valpar som registrerats under utveckling inte störs av bakgrundsljud från sängkläder. Vanligtvis en automatisk analys fungerar mycket bra för att extrahera de viktigaste variablerna. I motsats, läten som spelats in från vuxna är disturbed av bakgrundsljud från djuren rör sig i sängkläder. Automatisk analys kan misslyckas, och därför manuell analys bör användas. Ändå bör lägga sängkläder i testburen föreskriver villkor som är mindre stressande för djuren än bar mark (att möss inte gillar). Ytterligare insatser i samhället är koncentrerade på att förbättra den automatiska detekteringen av ultraljud läten under olika förhållanden, även de som innebär bakgrundsljud. Till exempel tillåter Voice att analysera läten som hade manuellt valda för frånvaron av bakgrundsbrus 32. I detta program, är utvinning av de akustiska variabler automatisk men behöver den inledande manuellt val.
Det bör noteras att den interindividuella variabiliteten är mycket viktigt i den vokala beteendet hos möss. Till exempel är samtalsfrekvens av vuxna män i närvaro av en brunst kvinnlig mycket distribuerade (Figur 1). vi suggest dessa standardiserade protokoll för att framkalla ultraljud vocalizations redan att begränsa variationen i samband med den experimentella sammanhang. Icke desto mindre skulle vi vilja påpeka att det är viktigt att presentera inte bara medelvärdet och SEM för data, men viktigast de enskilda punkterna i prover av liten storlek 33. Det är också mycket relevant - om det är nödvändigt - för att spela minst 12 personer i varje grupp / genotyp att samla representativa uppgifter. I många fall bör interindividuella variabiliteten inte gömmas (oftast inte kan vara), och det kan vara av stor betydelse för att identifiera individer som bär den genetiska mutationen studeras men inte uppvisar någon atypisk fenotyp. Sådana personer kan ge ledtrådar om ersättningar, vilket kan öppna nya vägar för behandlingar av genetiska sjukdomar.
I de flesta beteende karakteriseringar av musmodeller för neuropsykiatriska störningar, sång beteende och sociala kontakter är övervägaEd isär (t.ex. 19,27,34,35). Nya analysmetoder nu ge en halvautomatisk detaljerad karakterisering av de sociala evenemang och händelseförlopp under en interaktion (med MiceProfiler till exempel) 36, samt möjligheten att kombinera denna analys med data från ljudinspelningar. Den största fördelen med denna metod är att ge en heltäckande bild av social kommunikation i musmodeller av ASD, att mer exakt identifiera vilka aspekter av social kommunikation påverkas. I det nuvarande protokollet synkroniseringen är fortfarande manuellt, men detta kan förbättras genom att utlösa videoinspelningen genom ljudinspelning programvara. Denna typ av analyser bör bli standard för att ge en mer heltäckande bild av den sociala kommunikations underskott i musmodeller av neuropsykiatriska störningar. Dessutom kan upp till nu, vokala signaler oftast analyseras från emittern sidan (dvs tester är byggda för att gynna utsläpp av vocal signaler från testade musen, som i förevarande protokoll). Fokus bör nu också ställas in på mottagaren av dessa signaler, för att bättre identifiera funktionerna för dessa ljudsignaler. Detta bör ske genom att utvärdera även beteendet hos de nya hörn möss i de nuvarande protokoll hos vuxna (med MiceProfiler till exempel) 36, genom att använda uppspelningsexperiment 16, eller genom att inrätta nya protokoll. Faktum är att de nuvarande protokoll ger mycket Constrained situationer som kanske inte exakt etologiska villkoren för vocalization utsläpp i möss. Den spontana emission av ultraljud vocalizations måste bättre karakteriseras med användning av kontinuerliga ljud- och videoinspelningar för att sprida mer ljus över den spontana sång beteende hos möss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | - |
| green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | - |
| thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | - |
| self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | - | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm |
| small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | - |
| smell-less pen | for instance: Giotto | - | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
| Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
| Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
| Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
| Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
| Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
| Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | - | - | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
| plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
| PBS 1x (pH = 7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | - |
| slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
| May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | - |
| Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
| phosphate buffer solution (self-made) | - | - | pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
| test cage | Institut Pasteur, Paris | - | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
| self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | - | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm |
| video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | - | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
| EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
| Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |
References
- American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-V). , (2013).
- Ey, E., Leblond, C. S., Bourgeron, T. Behavioral Profiles of Mouse Models for Autism Spectrum Disorders. Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).
- Bourgeron, T., Jamain, S., Granon, S. Animal Models of Autism - Proposed Behavioral Paradigms and Biological Studies. Contemporary Clinical Neuroscience: Transgenic and Knockout Models of Neuropsychiatric Disorders. , 151-174 (2006).
- Scattoni, M. L., Crawley, J., Ricceri, L. Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders. Neurosci. Biobehav. Rev. 33 (4), 508-515 (2009).
- Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Cur. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PLOS ONE. 7, e46610 (2012).
- Hammerschmidt, K., Schreiweis, C., Minge, C., Pääbo, S., Fischer, J., Enard, W. A humanized version of Foxp2 does not affect ultrasonic vocalization in adult mice: Ultrasonic vocalization of "humanized" FoxP2 mice. Genes Brain Behav. , (2015).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 28-34 (2007).
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative Behavior, Ultrasonic Communication and Social Reward Are Influenced by Genetic Variation in Adolescent Mice. PLOS ONE. 2, (2007).
- Zippelius, H. -M., Schleidt, W. M. Ultraschall-Laute bei jungen Mäusen. Naturwissenschaften. 43, 502 (1956).
- Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. Ultrasonic emissions: do they facilitate courtship of mice. J. Comp. Physiol. Psychol. 84, 445-452 (1973).
- Holy, T. E., Guo, Z. S. Ultrasonic songs of male mice. PLOS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
- Maggio, J. C., Whitney, G. Ultrasonic vocalizing by adult female mice (Mus musculus). J. Comp. Psychol. 99, 420-436 (1985).
- Chabout, J., et al. Adult Male Mice Emit Context-Specific Ultrasonic Vocalizations That Are Modulated by Prior Isolation or Group Rearing Environment. PLOS ONE. 7 (1), e29401 (2012).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic "songs" with approach behaviour. Biol. Lett. 5, 589-592 (2009).
- Wöhr, M., Moles, A., Schwarting, R. K. W., D'Amato, F. R. Lack of social exploratory activation in male -opioid receptor KO mice in response to playback of female ultrasonic vocalizations. Soc. Neurosci. 6, 76-87 (2011).
- Granon, S., Faure, P., Changeux, J. -P. Executive and social behaviors under nicotinic receptor regulation. Proc. Nat. Acad. Sci. 100 (16), 9596-9601 (2003).
- Schmeisser, M. J., et al. Autistic-like behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/Shank2. Nature. 486 (7402), 256-260 (2012).
- Ey, E., et al. Absence of Deficits in Social Behaviors and Ultrasonic Vocalizations in Later Generations of Mice Lacking Neuroligin4. Genes Brain Behav. 11, 928-941 (2012).
- Chadman, K. K., et al. Minimal Aberrant Behavioral Phenotypes of Neuroligin-3 R451C Knockin Mice. Autism Res. 1, 147-158 (2008).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual Repertoire of Vocalizations in the BTBR T plus tf/J Mouse Model of Autism. PLOS ONE. 3, (2008).
- De Chaumont, F., Coura, R. D. -S., et al. Computerized video analysis of social interactions in mice. Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).
- Leblond, C. S., et al. Genetic and Functional Analyses of SHANK2 Mutations Suggest a Multiple Hit Model of Autism Spectrum Disorders. PLOS Genet. 8 (2), e1002521 (2012).
- Berkel, S., et al. Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation. Nat. Genet. 42, 489-491 (2010).
- Pinto, D., et al. Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature. 466, 368-372 (2010).
- Ey, E., et al. The autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
- Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T plus tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10, 44-56 (2010).
- Zorrilla, E. P. Multiparous species present problems (and possibilities) to developmentalists. Dev. Psychobiol. 30 (2), 141-150 (1997).
- Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14 (1), 37 (2013).
- Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. Behav. 96, 602-605 (2009).
- Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
- Burkett, Z. D., Day, N. F., Peñagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Sci. Rep. 5, 10237 (2015).
- Weissgerber, T. L., Milic, N. M., Winham, S. J., Garovic, V. D. Beyond Bar and Line Graphs: Time for a New Data Presentation Paradigm. PLOS Biol. 13 (4), e1002128 (2015).
- Jamain, S., et al. Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1710-1715 (2008).
- Won, H., et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature. 486, 261-265 (2012).
- Ferhat, A. -T., Le Sourd, A. -M., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J. -C., Bourgeron, T., Ey, E. Social Communication in Mice - Are There Optimal Cage Conditions? PLOS ONE. 10 (3), e0121802 (2015).
