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Medicine

Uso de olhos de coelhos em farmacocinéticas Estudos de intraoculares Drogas

Published: July 23, 2016 doi: 10.3791/53878

Abstract

A via intra-ocular de administração da droga permite a entrega de concentrações elevadas de drogas terapêuticas, enquanto minimiza a sua absorção sistémica. Vários fármacos são administrados dentro da câmara anterior ou vítrea, e a injecção intra-ocular tem sido eficaz na cura de várias doenças intra-oculares. Coelho olhos têm sido amplamente utilizadas para a investigação oftálmica, tal como o animal é fácil de manusear e económica em comparação com outros mamíferos, e o tamanho do olho de coelho é semelhante ao de um olho humano. Usando uma agulha G 30, a droga pode ser injectado para dentro dos espaços intracamerais e intravítrea de olhos de coelho. Os globos oculares são então congeladas até à análise e pode ser dividido em humor aquoso e do humor vítreo e retina / coróide. As amostras vítreas e na retina / coróide pode ser homogeneizada e solubilizado antes da análise. Em seguida, os imunoensaios podem ser realizados para medir as concentrações de droga intra-ocular em cada compartimento. modelos farmacocinéticos apropriados podem serutilizado para calcular vários parâmetros, tais como a meia-vida e a concentração máxima da droga. Coelho olhos pode ser um bom modelo para estudos de farmacocinética dos medicamentos intra-oculares.

Introduction

Antes do advento de entrega intra-ocular de droga, a principal preocupação de terapia médica para doenças intra-oculares foi a eficiência com a qual o fármaco pode penetrar no interior do olho. A barreira hemato-ocular impede muitas substâncias, incluindo drogas, de difundir para dentro do olho. Portanto, as concentrações dos fármacos que são acima dos níveis terapêuticos pode não ser facilmente obtido. O método de administração de droga intra-ocular, incluindo injecções intravítreas e intracamerais, é possível ignorar directamente a barreira hemato-ocular 1-3, de modo que concentrações terapêuticas de drogas pode ser conseguida no olho 4,5.

Por conseguinte, a entrega de drogas intravítreas tornou-se um método popular de tratamento para várias doenças intra-oculares 5,6. Por exemplo, injecção intravítrea é amplamente realizada para a degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, oclusão venosa retiniana, e infecções intra-oculares 7-10. Em particular, uma veza introdução de medicamentos anti-VEGF, a frequência das injecções intravítreas foi notavelmente aumentada para o tratamento de doenças da retina. Portanto, é importante compreender a farmacocinética intraoculares de tais drogas para avaliar a eficácia e segurança da terapia médica.

Embora a administração intra-ocular de drogas é considerado um grande avanço na terapia médica para doenças oculares, o monitoramento da concentração da droga dentro do globo ocular é tecnicamente exigente. Uma vez que os olhos humanos contêm apenas pequenas quantidades de humor aquoso (cerca de 200 uL) e vidro (cerca de 4,5 ml, Tabela 1), é tecnicamente difícil obter uma quantidade suficiente de fluido ocular para medir a concentração da droga. Além disso, os métodos que são usados ​​para se obter o líquido do olho, como bater vítreo ou paracentese da câmara anterior, podem danificar o tecido ocular e resultar em complicações graves, tais como cataratas, endoftalmite, oudescolamento de retina 11,12. Por conseguinte, os modelos animais são utilizados em estudos farmacocinéticos de fármacos comumente utilizados intraoculares 13. Entre estes modelos animais, coelhos ou macacos são os animais mais frequentemente utilizados.

Coelhos, que são pequenos mamíferos da ordem Lagomorpha na família dos leporídeos, são encontrados em várias partes do mundo. Porque os coelhos não são agressivos, eles são fáceis de manusear, usar em um experimento, e observar. Baixo custo, disponibilidade imediata do animal, de tamanho semelhante ao olho humano, e uma grande base de dados de informação para a comparação favorável realizar estudos farmacocinéticos usando olhos de coelhos. Neste trabalho, um protocolo para estudos de farmacocinética dos medicamentos intra-ocular em olhos de coelhos é descrito.

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Protocol

Nosso protocolo segue as diretrizes da Atenção Institucional Animal e Uso Committee (IACUC) de Seul Bundang Hospital da Universidade Nacional, que aprovou todos os procedimentos com animais e métodos de cuidados de animais apresentados neste protocolo. O IACUC está em plena conformidade com a oitava edição do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011). Todos os procedimentos foram realizados com a adesão às diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research em animais. gaiolas individuais foram utilizados para alojar os coelhos. Cirurgia adicional ou preparação antes de realizar esta experiência (ou seja, a esterilização) pode não ser necessária.

1. A injeção intra-ocular da droga em olhos de coelhos

  1. Anestesiar coelhos brancos da Nova Zelândia saudáveis ​​pesando 1,5-2 kg, com uma injecção intramuscular de uma mistura de cloridrato de tiletamina e zolazepamcloridrato (15 mg / kg) e cloridrato de xilazina (5 mg / kg). Verifique a anestesia através do monitoramento da palpebral reflex (piscar) ou por pitada orelha.
    NOTA: Se uma droga intra-ocular liga-se a pigmentos oculares, o grau de ligação pode induzir a modificação da farmacocinética oculares da droga. Por exemplo, a meia-vida de uma droga de ligação a pigmento nos humores vítreo e aquoso de coelhos pigmentados pode ser aumentada comparada com a de 14 coelhos albinos. Neste caso, os dados obtidos a partir dos olhos de coelhos pigmentados pode ser mais semelhante, aplicável para os olhos humanos, tal como os olhos humanos têm um diferente grau de pigmentação e coelho albino olhos podem não representar homólogos humanos. Assim, considerando a interação droga-pigmento, o uso de coelhos pigmentados ou albinos deve ser cuidadosamente considerada e os resultados devem ser interpretados em conjunto com a cepa (pigmentação) de coelho. No entanto, coelhos albinos são recomendados para uso em estudos comparando propriedades farmacocinéticas como a dinteração tapete-pigmento pode ser um fator de confusão na comparação.
    1. Aplicar um anestésico tópico com 1% de cloridrato de proparacaína colírios oftálmicos. Use pomada veterinário (2% de hidroxipropilmetilcelulose) para prevenir o ressecamento do olho até a recuperação da anestesia.
      NOTA: Nunca deixe o coelho sem vigilância enquanto anestesiados.
  2. Dilatar a pupila com uma ou duas gotas de cloridrato de fenilefrina e tropicamida.
  3. Para a preparação cirúrgica antes da injecção intra-ocular, aplicam 5-10% de povidona-iodo na pele periocular com um cotonete de algodão 5. Coloque uma gota de 5-10% de povidona-iodo na conjuntiva do olho.
  4. Administrar os medicamentos intra-oculares, quer por via intravítrea ou intracamerally usando técnicas assépticas 5.
    NOTA: A droga absorvida na circulação sistêmica também pode penetrar no outro olho. Quando um medicamento é administrado a ambos os olhos, a concentração de droga em um olho pode ser afectada pela droga injetadao outro olho. Se se confirmar que o efeito da injecção contralateral pode ser negligenciada como a droga na circulação sistémica não pode penetrar no outro olho, a utilização de ambos os olhos para administração de injecções intra-oculares pode ser considerado, uma vez que é económico e minimiza o número de animais sacrificados para os estudos farmacocinéticos. Para estudo de farmacocinética em concentração sistémica após injecção intraocular, a utilização de apenas um olho é apropriado.
    1. Para injecções intravítreas, injectar o medicamento intravitreamente um milímetro por trás do limbo cirúrgico no quadrante superotemporal usando uma agulha G 30, e quer comerciais seringas de 1 ml, seringas de insulina, seringas de vidro ou perpendicularmente à superfície escleral 5.
      NOTA: O volume de droga usada para a injecção intravítrea intracameral e varia de acordo com os medicamentos sob investigação. Para experiências de farmacocinética relativos a agentes anti-VEGF, utilizando olhos de coelhos, estudos anteriores usado 0,025, 0,05 (mais comum), ou 0,1 ml de bevacizumab ou ranibizumab para a injeção intracameral ou intravítrea. Nos nossos estudos anteriores sobre a farmacocinética intraoculares de factor de crescimento endotelial anti-vascular, 0,05 ml de bevacizumab 15, 0,025 ml de ranibizumab, ou 0,03 ml de VEGF-Trap 16 foram usadas. Acredita-se que o maior volume seguro sem paracentesis a ser de 0,1 ml, embora tenha havido pouca evidência para apoiar esta 17. Se o volume excessivo é injetado tanto intracamerally ou por via intravítrea, pressão intra-ocular é muito maior. Em adição aos danos do nervo óptico directamente causada por um aumento da pressão intra-ocular (IIOR), dano do nervo óptico no glaucoma ou seja, em casos extremos, a IIOR leva a perfusão ocular prejudicada e a oclusão da artéria central da retina, o qual é análogo ao acidente vascular cerebral no cérebro.
    2. Para injecções intracamerais, injectar o medicamento dentro da câmara anterior através da inserção de uma agulha G 30, por meio do limbo córneo com o bisel para cima e que o avanço aaParalela ao plano da íris para minimizar o risco de trauma para a íris ou da lente.
      NOTA: Dependendo da formulação de fármaco, agulhas maiores do que 30 L pode ser usado. As condições que requerem agulhas de calibre maior incluem drogas contendo microesferas, drogas larga de proteínas, e as formulações de elevada viscosidade.
    3. Após a injecção, comprimir o local de injecção com um aplicador de algodão-ponta estéril para promover a cicatrização de feridas.
      NOTA: Normalmente, 30 segundos é suficiente para a cura de feridas, quando uma agulha de 30 G é usada para injecção intra-ocular. No entanto, se uma agulha de calibre maior é usado para a injecção intra-ocular, um tempo mais longo seria apropriado para ferida de vedação para minimizar as fugas a partir da ferida esclerotomia. Para verificar se há fugas esclerotomia ferida é importante para garantir que a quantidade de droga intra-ocular usada imediatamente após a injecção intraocular é a mesma que a quantidade injectada, especialmente se uma agulha de calibre maior é usado.
  5. Observe os coelhos tratados diárias parauma semana, e depois uma vez por semana, para qualquer sinal de inflamação grave intra-ocular (hiperemia conjuntival e hypopyon) até que a eutanásia.
    NOTA: Os analgésicos após a injecção não são necessárias como a injeção intra-ocular usando uma agulha G 30 é um procedimento minimamente invasivo, que não é acompanhada de dor pós-cirúrgica. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia dos outros animais até que esteja totalmente recuperado.

Preparação 2. Amostra

  1. Para enucleação, sacrificar os coelhos em vários pontos de tempo (por exemplo., 1 hora ou 1, 2, 5, 9, 14, ou 30 dias) após a injeção de drogas intra-ocular.
    NOTA: Estes pontos de tempo dependem da droga de interesse e os perfis farmacocinéticos conhecidos. Para cada ponto de tempo, utilizar, pelo menos, dois 13 globos oculares. Para qualidade de dados confiável, duração de amostragem devem ser escolhidos com cuidado, pelo menos, quatro pontos de tempo com a amostragem equilibrada durante pelo menos um período de tempo de duas meias-vidas da droga 13 18 Da), em particular, mais do que um ponto de tempo durante as primeiras 24 horas é crucial. Por conseguinte, para macromoléculas (> 1000 Da) 18, um período de amostragem, tal como 1 hora e 1, 2, 5, 9, 14, e 30 dias 19 pode ser uma boa opção. Para pequenas moléculas (≤1,000 Da), 1, 2, 4, e 8 horas e 1, 3 e 7 dias pode ser uma opção 20. Dependendo do peso molecular, o período de amostragem pode ser ainda modificado.
    1. Para a eutanásia, administrar 10 ml de 15% de KCl intravenosa rapidamente após anestesiar os coelhos com uma injecção intramuscular de uma mistura de cloridrato de tiletamina, cloridrato de zolazepam (15 mg / kg), e cloridrato de xilazina (5 mg / kg).
  2. Abrir a fenda palpebral com um retractor de pálpebra. Fazer um 360 ° conjuntival incisão 2-3 mm posterior ao limbo e estendê-lo posteriormente por dissecar o conjunctiva e da cápsula de Tenon do globo.
  3. Corte os músculos extra-oculares perto de sua inserção no mundo. Prender o nervo óptico com uma pinça curva e depois cortar o nervo entre os fórceps e do globo. Remover o próprio globo ocular, deixando os tecidos circundantes intacta. Após enucleação, congelar imediatamente os globos oculares e armazená-los a -80 ° C.
    NOTA: Pode haver duas opções para a congelação imediata. Se a concentração de fármaco é medida numa fase muito precoce (isto é. A menos de 1 hora), o azoto líquido pode ser mais adequada para assegurar o congelamento melhor atempada do globo ocular. No entanto, para períodos subsequentes, o gelo pode ser utilizado para arrefecer o globo ocular imediatamente, e, em seguida, congelador pode ser utilizado para armazenar os globos oculares a -80 ° C.
  4. Após a obtenção dos globos oculares para todos os pontos de tempo, os globos oculares separar congeladas em três compartimentos, o humor vítreo, o humor aquoso, e a retina / coróide. Separar estes compartimentos antes defrosting.
    NOTA: O ponto mais importante para a separação em três compartimentos é a velocidade do processo. O globo ocular deve ser separada muito rapidamente antes da descongelação e o procedimento pode ser realizado no gelo para atrasar o descongelamento.
    1. Para abrir o mundo, fazer uma incisão no limbo da córnea (300 ° ou maior) com uma lâmina de bisturi. Obter o compartimento de congelação em frente da íris, o humor aquoso.
    2. Retirar a íris congelados e da lente puxando e excoriating usando uma pinça. Quando o vítreo torna-se acessível, obtenha o vítreo congelados, separando-a das restantes tecidos (retina / coróide / esclera).
    3. Usando uma lâmina de bisturi número 15, separar o tecido de retina / coróide da esclerótica subjacente.
  5. Para imunoensaios, descongelar as amostras do humor aquoso, e medir o volume de cada amostra. Medir o peso das amostras congeladas subtraindo o peso de um tubo vazio a partir de que o tubo contendo tele congelado amostra.
    Observação: Uma vez que a gravidade específica das amostras congeladas é de aproximadamente 1, O peso de cada amostra pode ser utilizada para calcular o volume da amostra.
  6. Pesar as amostras de vítreo, descongelar as amostras, e solubilizar-los em 1,0 ml de solução salina tamponada com fosfato contendo 1% de albumina de soro bovino num rotor durante a noite a 4 ° C. Em seguida, centrifugar as amostras a 387 xg durante 10 min 21.
  7. Pese os / as amostras congeladas de retina coróide para a homogeneização. Adiciona-se reagente de extracção de proteína com uma razão de tecido de reagente de 1:10 (1 g de tecido / 10 mL de reagente). Homogeneizar o tecido utilizando uma microhomogenizer pré-arrefecido. Centrifugar a amostra lisadas durante 10 min a 12,000-20,000 xg e transferir o sobrenadante para um tubo de PPE refrigerados.

3. Imunoensaio

NOTA: Várias metodologias de análise pode ser utilizado para a medição da concentração de proteína. Escolha um método quantitativo adequado, depending na faixa de detecção. Resumidamente, o modo de monitorização iónica seleccionada de HPLC pode detectar níveis picogramas de molécula, enquanto LC-MS / MS pode detectar nanogramas e picogramas níveis de proteína para perfilar com o modo MRM / PRM, respectivamente. O limite de detecção do ELISA é considerado estar no nível picograma.

  1. Para os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA indirecta) para medir as concentrações de agentes anti-VEGF, utilizar kits de ELISA em placas de 96 cavidades para detectar a droga de interesse e gera uma curva padrão de concentrações de drogas conhecidas.
    1. Dilui-se a, o humor aquoso vítreo, e as amostras coróide / retina, com 0,1% de albumina de soro bovino em solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) para concentrações que estão dentro do intervalo linear, e utilizá-los para o ensaio.
  2. Dividir as amostras em alíquotas em placa a 100 ul / poço. Incubar durante a noite a 4 ° C e, em seguida, lava-se a placa três vezes com 200 ul de solução de lavagem de 0.05% de Tween 20 em PBS 1x.
    NOTA: O anti-VEGF presentes na amostra actua como o anticorpo primário por ELISA; Portanto, o uso adicional de um anticorpo primário não é necessária.
  3. Dilui-se o anticorpo secundário a 1: 20000 em BSA a 0,1% em 1x PBS, e adicionar 100 uL de a-solução diluída por poço. Após incubação da placa com um anticorpo secundário diluído durante a noite a 4 ° C, à medida da densidade óptica a 450 nm de comprimento de onda. Subtrair a densidade óptica média a zero padrão a partir da média de leituras em duplicado para cada padrão e amostra.
  4. Criar uma curva padrão com base no sinal de luz relativa a partir de soluções da droga com concentrações conhecidas por reduzir os dados utilizando software de computador capaz de gerar um parâmetro de logística de quatro (4-PL) curva de ajuste, tais como SoftMax Pro. Para criar uma curva padrão, a curva de ajuste de 4-PL pode ser obtido clicando em [4 parâmetros] em [Curva Padrão] - [Fit].
  5. Calcula-se a concentração de fármaco nas amostras from a curva padrão.
    NOTA: Os limites de detecção (LOD) de drogas anti-VEGF foram investigados em nosso experimento. A LOD do bevacizumab foi 0,024-3,125 ng / ml e a de aflibercept foi 0.039-10 ng / ml.

4. Métodos de Análise farmacocinéticas

NOTA: Para a análise PK, pode-se usar qualquer compartimental ou análise não compartimental. Na análise compartimental, comportamento disposição de moléculas pode ser explicado por uma equação (modelo). Assim, a análise PK compartimental pode prever a concentração, a qualquer momento t Considerando que o modelo não-compartimental não podem visualizar ou prever perfis de tempo de concentração para outros regimes de dosagem. No entanto, montagem de modelos compartimentados pode ser um processo complexo e demorado. Em contraste, as suposições são menos restritivas no modelo não-compartimental. O método não compartimental é simples e comumente utilizados para calcular os parâmetros farmacocinéticos, tais como meia-vida, a depuração e o volume de distribuição.Nós escolhemos modelos compartimentais para estudos farmacocinéticos sobre agentes anti-VEGF.

  1. Analisar os dados de concentração de droga com os modelos compartimentados utilizando software de modelagem, tais como software Phoenix WinNonlin.
    1. Clique [modelo PK] em [modelagem WNL5 clássico] e mapear o tempo de observação, a dose administrada e a concentração do fármaco no menu [Configuração].
    2. Selecione o modelo compartimental (por exemplo, número de compartimentos) no separador [seleção de modelo], e clique no botão [execução] para calcular os parâmetros do modelo.
  2. Após as análises, selecione o modelo de compartimento final que melhor descreve os dados de concentração de droga com base nos seguintes critérios: (., Por exemplo, erro padrão) (1) Akaike Critério de Informação, (2) a precisão das estimativas de parâmetros, e (3) análise gráfica (por exemplo., a bondade de parcelas de ajuste).
  3. Calcular os parâmetros farmacocinéticos de interesse, tais como meia-vida (t 1/2) e a área sob o tempo Concentra-ção curva (AUC), a partir dos parâmetros do modelo e as equações movidas pelo modelo compartimental.

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Representative Results

O processo que é usado para realizar injecções intravítreas de uma droga de interesse em olhos de coelhos com técnicas estéreis é mostrado na Figura 1. Os olhos são enucleados tratados em uma hora programada e armazenado a -80 ° C. Para a análise, três compartimentos, o humor aquoso, o vítreo e a retina / coróide, são separados a partir dos olhos de coelhos congelados, como demonstrado na Figura 2. As amostras dos compartimentos são preparadas para o teste de ELISA. Após a incubação com um anticorpo secundário, a densidade óptica é medida num placa de 96 poços, que contém concentrações conhecidas do fármaco de interesse para a curva padrão e amostras a partir dos três compartimentos que foram recolhidas em vários pontos de tempo após a injecção intravítrea (Figura 3). A concentração de dados, que é calculado a partir da curva padrão (Recurso Figura 1) pode ser montado no pharmacokineTic modelo, e os parâmetros farmacocinéticos pode ser determinada a partir da linha ajustada (Figura 4). Na Figura 4, a farmacocinética de intravitreamente injetado bevacizumab em vitrectomized e olhos não vitrectomized foram avaliados e comparados. análise PK compartimental foi realizada, que forneceu a seguinte equação para explicar o comportamento PK.

C (t) = C 1 exp (- k 1 t) + C '2 exp (- K 2 t)

C (ug / ml): Concentração em qualquer instante t (horas)

C 1, C 2: intercepta extrapolados-back da fase de distribuição e eliminação

k 1, k 2: constantes de velocidade no thdistribuição e e fase de eliminação

Como mostrado na Figura 4, a concentração estimada de acordo com o modelo ajustado combinado muito bem com os valores reais medidos. Não houve diferenças significativas na concentração vítrea de parâmetros de bevacizumab e farmacocinéticas, como meia-vida entre com e sem vitrectomia. Esta experiência sugere que o papel do vítreo na distribuição e eliminação de bevacizumab é insignificante.

figura 1
Figura 1:. Procedimento para realizar injecções intravítreas de intraoculares drogas no olho de coelho Sob anestesia com técnicas assépticas são utilizadas através da aplicação de 5% gotas de povidona-iodo e pela preparação para a pele, e a injecção intravítrea de o fármaco de interesse é realizada utilizando uma seringa inteligênciaha 30 G agulha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Separação do globo ocular do coelho congelado em três compartimentos Após incisão da esclerótica com uma lâmina cirúrgica e remoção da íris, o humor aquoso e vítreo podem ser separados. Posteriormente, a retina / coróide pode ser separada cuidadosamente da esclera, que é a camada branca externa do globo ocular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Imuno Enzyme-linkedsorvente (ELISA) da intra-ocular de droga nas amostras representando os três compartimentos. Esta figura mostra uma placa de 96 poços, o qual é utilizado para o imunoensaio. Após a incubação com um anticorpo secundário, uma mudança de cor é observada nos poços. A densidade óptica da cor depende da concentração do fármaco de interesse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Fitting os dados observados para o modelo farmacocinético Neste experimento comparando a farmacocinética do bevacizumab em olhos vitrectomized e não vitrectomized, a concentração intravítrea real de bevacizumab é apresentado como pontos. As curvas ajustadas para os dados de concentração que são movidos pela farmacocinéticamodelo, que estão representadas por duas linhas, são desenhados e utilizados para o cálculo dos parâmetros farmacocinéticos, tais como a meia-vida da droga. As barras de erro indicam intervalos de 95% de confiança. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1:. A curva padrão do ELISA utilizado para a detecção de Bevacizumab Isto é obtido usando o software capaz de gerar uma de quatro parâmetros logística ajuste de curva. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Espécies Vítreo Humor aquoso Referircia
Rato 5.3 ul 4.4 ul 22
Rato 50-55 ul 13,6 ul 22, 24
Coelho 1,15-1,7 ml 350 ul 23, 27, 28
Macaco 3,0-4,0 ml 102 ul 23, 26, 28
Humano 3,0-5,0 ml 144 - 247 ul 23, 20, 21, 28

Tabela 1: Volume vítreo e humor aquoso em diferentes espécies 17,22-30.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zoletil Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride  Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine) Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165 R&D systems 293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer SIGMA C3041-50CAP
Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si Thermo SCIENTIFIC 167008 96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) BOVOGEN BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml gibco 10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) abcam ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent SIGMA C3228-50ML lysis buffer
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #15
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #10
Feather surgical blade stainless steel FEATHER 11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml Thermo SCIENTIFIC 34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml Thermo SCIENTIFIC 34062
Softmax Pro Molecular Devices v.5.4.1 software for generating standard curve
SAAM II  Saam Institute, Seattle, WA software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin Pharsight, Cary, NC v. 6.3 software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab) Genentech

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Ahn, S. J., Hong, H. K., Na, Y. M., Park, S. J., Ahn, J., Oh, J., Chung, J. Y., Park, K. H., Woo, S. J. Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs. J. Vis. Exp. (113), e53878, doi:10.3791/53878 (2016).

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