Abstract
Het intra-oculaire route van toediening van geneesmiddelen kan de levering van hoge concentraties van therapeutische geneesmiddelen, terwijl het minimaliseren van hun systemische absorptie. Verschillende geneesmiddelen worden toegediend in de voorste kamer of glasvocht, en de intraoculaire injectie effectief in het genezen van diverse ziekten intraoculaire geweest. Konijnenogen zijn op grote schaal gebruikt voor oogheelkundig onderzoek, het dier gemakkelijk te hanteren en goedkoop in vergelijking met andere zoogdieren, en de grootte van een konijn oog is vergelijkbaar met die van een menselijk oog. Met behulp van een 30 G naald, kunnen medicijnen worden geïnjecteerd in de intracamerale en intravitreale ruimten van konijn ogen. De oogbollen worden vervolgens bevroren tot analyse, en kan worden verdeeld in het kamerwater, glasvocht en retina / choroidea. Het glasvocht en retina / choroidea monsters worden gehomogeniseerd en oplosbaar gemaakt vóór de analyse. Vervolgens kunnen immunoassays worden uitgevoerd om de concentraties van intraoculaire drugs meten elk compartiment. Geschikte farmacokinetische modellen kunnen wordengebruikt om verschillende parameters, zoals de halfwaardetijd en maximale concentratie van het geneesmiddel te berekenen. Konijnenogen kan een goed model voor farmacokinetische studies van intraoculaire drugs.
Introduction
Voor de komst van intraoculaire geneesmiddelafgifte, de belangrijkste zorg van medische therapie voor intraoculaire aandoeningen was de efficiëntie waarmee het geneesmiddel in het oog kan binnendringen. De bloed-oculaire barrière voorkomt veel stoffen, zoals geneesmiddelen, diffundeert in het oog. Daarom concentraties van geneesmiddelen die boven therapeutische niveaus kunnen niet gemakkelijk worden verkregen. De intraoculaire toediening werkwijze, waaronder intracamerale en intravitreale injecties, direct kunnen omzeilen de bloed-oculaire barrière 1-3, zodat therapeutische concentraties van geneesmiddelen kunnen worden bereikt in het oog 4,5.
Daarom heeft intravitreale drug delivery uitgegroeid tot een populaire methode van de behandeling van verschillende intra-oculaire ziekten 5,6. Zo wordt intravitreale injectie wijd uitgevoerd leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, diabetische retinopathie, retinale ader occlusies en intraoculaire infecties 7-10. Aangezien met namede introductie van anti-VEGF medicatie is de frequentie van intravitreale injecties opmerkelijk verhoogd voor de behandeling van retinale ziekten. Daarom is het belangrijk om de intraoculaire farmacokinetiek van dergelijke geneesmiddelen begrijpelijk voor het evalueren van de werkzaamheid en veiligheid van de medische behandeling.
Hoewel de intraoculaire toediening van geneesmiddelen wordt beschouwd als een belangrijke doorbraak in de medische therapie voor oculaire ziekten, bewaken van de geneesmiddelconcentratie in de oogbol is technisch veeleisend. Omdat menselijke ogen slechts kleine hoeveelheden waterige humor (ongeveer 200 ui) en kunstmatige (ongeveer 4,5 ml, tabel 1) bevatten, is het technisch moeilijk om voldoende hoeveelheden oogvloeistof de geneesmiddelconcentratie meten verkrijgen. Bovendien methoden die worden gebruikt om de oogvloeistof te verkrijgen, zoals glasachtige tikken of voorste kamer paracentesis kan het oogweefsel beschadigen en ernstige complicaties, zoals cataract, endoftalmitis, ofnetvliesloslating 11,12. Dienovereenkomstig worden diermodellen gebruikt in farmacokinetische studies van de meest gebruikte geneesmiddelen intraoculaire 13. Onder deze diermodellen, konijnen of apen zijn de meest gebruikte dieren.
Konijnen, die kleine zoogdieren van de orde Lagomorpha in de familie Leporidae zijn, worden gevonden in verschillende delen van de wereld. Omdat konijnen zijn niet agressief, ze zijn gemakkelijk te hanteren, te gebruiken in een experiment, en observeren. Lagere kosten, gemakkelijke beschikbaarheid van het dier, vergelijkbaar grootteoogschaduw mens, en een grote database van informatie vergelijking gunst uitvoeren farmacokinetische studies met konijnenogen. In dit artikel wordt een protocol voor farmacokinetisch onderzoek van de intra-oculaire drugs bij konijnen ogen beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ons protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Seoul National University Hospital Bundang, die alle van het dier procedures en verzorging van dieren methoden die in dit protocol goedgekeurd. De IACUC is volledig in overeenstemming met de achtste editie van de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (2011). Alle procedures werden uitgevoerd met de naleving van de richtlijnen van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek bij dieren. Individuele kooien werden gebruikt voor de huisvesting van de konijnen. Extra chirurgie of voorbereiding voor het uitvoeren van dit experiment (dat wil zeggen, sterilisatie) mag niet worden verlangd.
1. Intraoculaire Injectie van het geneesmiddel in Rabbit Eyes
- Verdoven gezonde Nieuw-Zeelandse witte konijnen met een gewicht van 1,5-2 kg met een intramusculaire injectie van een mengsel van tiletamine hydrochloride en zolazepamhydrochloride (15 mg / kg) en xylazine hydrochloride (5 mg / kg). Controleer verdoving door het bewaken van de palpebrale (knipperen) reflex of op het gehoor snuifje.
LET OP: Als een intra-oculaire drug bindt aan oculaire pigmenten, kan de mate van binding wijziging van oculaire farmacokinetiek van het geneesmiddel te induceren. Bijvoorbeeld kan de halfwaardetijd van een pigment bindende geneesmiddel in het glaslichaam en waterige lichaamsvochten van gepigmenteerde konijnen verhoogd worden vergeleken met die in albinokonijnen 14. In dit geval kan de verkregen gepigmenteerde konijnenogen data meer vergelijkbare en toepasbaar voor het menselijk oog als menselijke ogen een verschillende mate van pigmentatie en albino konijnen ogen kan niet menselijke tegenhangers vertegenwoordigen. Aldus gezien geneesmiddel-interactie pigment, het gebruik van gepigmenteerde of albino konijnen zorgvuldig worden overwogen en de resultaten moeten samen worden uitgelegd met de stam (pigmentatie) van konijn. Echter, zijn albino konijnen aanbevolen voor gebruik in vergelijkende studies met farmacokinetische eigenschappen als het dkleed pigment-interactie kan een verwarrende factor in de vergelijking.- Breng een plaatselijke verdoving met 1% proparacaine hydrochloride oogheelkundige oogdruppels. Gebruik vet zalf (2% hydroxypropylmethylcellulose) om droge ogen te voorkomen totdat herstel van anesthesie.
LET OP: Laat het konijn onbeheerd terwijl verdoofd.
- Breng een plaatselijke verdoving met 1% proparacaine hydrochloride oogheelkundige oogdruppels. Gebruik vet zalf (2% hydroxypropylmethylcellulose) om droge ogen te voorkomen totdat herstel van anesthesie.
- Verwijden de pupil met een of twee druppels fenylefrine hydrochloride en tropicamide.
- Voor chirurgische voorbereiding voor de intraoculaire injectie toepassing 5-10% povidonjood met peri-oculaire huid met een wattenstaafje 5. Plaats een druppel 5-10% povidonjood op de conjunctiva van het oog.
- Dien de intra-oculaire drugs ofwel intravitreaal of intracamerally met behulp van aseptische technieken 5.
NB: De drug geabsorbeerd in de systemische circulatie kan ook de collega-oog te dringen. Wanneer een geneesmiddel wordt toegediend aan beide ogen, kan de geneesmiddelconcentratie in een oog worden beïnvloed door farmaceutische geïnjecteerdhet andere oog. Wanneer wordt vastgesteld dat het effect van de contralaterale injectie kan worden genegeerd als het geneesmiddel in systemische circulatie kan niet door het andere oog, kan het gebruik van beide ogen intraoculaire injecties worden beschouwd, omdat het economisch en minimaliseert het aantal dieren opgeofferd de farmacokinetische studies. Farmacokinetische studie systemische concentratie na intraoculaire injectie, het gebruik van slechts één oog dienen.- Voor intravitreale injecties, injecteer het geneesmiddel intravitreaal 1 mm achter de chirurgische limbus in de superotemporal kwadrant met behulp van een 30 G naald en ofwel commerciële 1 ml spuiten, insuline spuiten, of glas spuiten loodrecht op het sclerale oppervlak 5.
OPMERKING: De hoeveelheid geneesmiddel voor intracamerale en intravitreale injectie afhankelijk van de te onderzoeken geneesmiddelen. Voor farmacokinetische experimenten op anti-VEGF agenten met behulp van konijn ogen, eerdere studies gebruikt 0,025, 0,05 (meest voorkomende), of 0,1 ml van bevacizumab of ranibizumab voor de intracamerale of intravitreale injectie. In onze eerdere studies naar intraoculaire farmacokinetiek van anti-vasculaire endotheliale groeifactor, 0,05 ml 15 bevacizumab, 0,025 ml ranibizumab of 0,03 ml VEGF-Trap 16 gebruikt. De grootste veilig geluidsniveau zonder paracentese wordt verondersteld om 0,1 ml te zijn, hoewel er weinig bewijs om deze 17 te ondersteunen is geweest. Als er te veel volume ofwel intracamerally of intravitreaal wordt geïnjecteerd, wordt intra-oculaire druk sterk toegenomen. Naast optische zenuwschade direct veroorzaakt door een verhoogde intraoculaire druk (IIOP), namelijk glaucomateuze optische zenuwbeschadiging, in extreme gevallen IIOP leidt tot verminderde perfusie en oculaire centrale retinale arterie occlusie, analoog aan beroerte in de hersenen. - Voor intracamerale injectie, injecteren het geneesmiddel in de voorste kamer door het met een 30 G naald door de corneoscleral limbus met de afschuining en vooruit te parallel aan de iris vlak om het risico van trauma aan de iris en lens minimaliseren.
Opmerking: Afhankelijk van de geneesmiddelformulering, naalden groter dan 30 G worden gebruikt. De voorwaarden die grotere-gauge naald onder andere geneesmiddelen die microsferen, groot-eiwit drugs, en hoge viscositeit formuleringen. - Na injectie, te comprimeren de injectieplaats met een steriele katoen-tip applicator wondgenezing bevorderen.
OPMERKING: Normaal 30 sec is genoeg voor wondgenezing, wanneer een 30 G naald wordt gebruikt voor intra-oculaire injectie. Indien een dikkere naald wordt gebruikt voor intra-oculaire injectie, langer passend is gewikkeld de sluiting om de lekkage van de sclerotomie wond minimaliseren. Controleren op sclerotomie wond lekkage belang dat de hoeveelheid intraoculaire geneesmiddel onmiddellijk na de intraoculaire injectie is gelijk aan de geïnjecteerde hoeveelheid, vooral als een dikkere naald wordt gebruikt.
- Voor intravitreale injecties, injecteer het geneesmiddel intravitreaal 1 mm achter de chirurgische limbus in de superotemporal kwadrant met behulp van een 30 G naald en ofwel commerciële 1 ml spuiten, insuline spuiten, of glas spuiten loodrecht op het sclerale oppervlak 5.
- Let op de behandelde konijnen dagelijkséén week en een keer per week daarna op tekenen van ernstige intraoculaire ontsteking (conjunctivale injectie en hypopyon) tot euthanasie.
OPMERKING: Analgetica na injectie niet vereist als intraoculaire injectie met een 30 G naald is een minimaal invasieve procedure die niet vergezeld gaat van postoperatieve pijn. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het bedrijf van de andere dieren tot ze volledig hersteld niet meer terug.
2. Monstervoorbereiding
- Voor enucleatie, euthanize de konijnen op verschillende tijdstippen (bijv., 1 uur of 1, 2, 5, 9, 14 of 30 dagen) na de intraoculaire geneesmiddelinjectie.
Opmerking: Deze tijdstippen zijn afhankelijk van het geneesmiddel van belang en de bekende farmacokinetische profielen. Voor elk tijdstip tenminste gebruik van twee ogen 13. Voor betrouwbare datakwaliteit bemonsteringstijd moet zorgvuldig worden gekozen, ten minste vier tijdstippen met gebalanceerde bemonstering minstens een tijdspanne van twee halfwaardetijden van het geneesmiddel 13 18, in het bijzonder meer dan 1 tijdpunt gedurende de eerste 24 uur cruciaal. Dienovereenkomstig, voor macromoleculen (> 1000 Da) 18, een bemonsteringsperiode zoals 1 uur en 1, 2, 5, 9, 14 en 30 dagen 19 kan een goede optie. Voor kleine moleculen (≤1,000 Da), 1, 2, 4 en 8 uur en 1, 3 en 7 dagen kan een optie 20 zijn. Afhankelijk van het molecuulgewicht, kan de bemonsteringsperiode verder worden gemodificeerd.- Euthanasie, dienen 10 ml 15% intraveneuze KCl snel na verdoven konijnen met een intramusculaire injectie van een mengsel van tiletamine hydrochloride, zolazepam hydrochloride (15 mg / kg) en xylazine hydrochloride (5 mg / kg).
- Open de ooglidspleet met een ooglid retractor. Wordt 360 ° conjunctivale incisie 2-3 mm achter de limbus en uitbreiden posterieur door het ontleden van de conjunctiva en Tenon's capsule uit de hele wereld.
- Snijd de oculaire spieren dicht bij hun inbrengen in de hele wereld. Klem de oogzenuw met gebogen pincet en snijd de zenuw tussen de tang en de hele wereld. Verwijder de oogbol zelf terwijl de omringende weefsels intact. Na enucleatie, onmiddellijk invriezen oogbollen en bewaar ze bij -80 ° C.
NB: Er kunnen twee opties voor onmiddellijke bevriezing. Als de geneesmiddelconcentratie wordt gemeten bij een zeer vroege fase (bijv. Minder dan 1 uur), kan vloeibare stikstof geschikter beter tijdige bevriezing van de oogbol waarborgen. Voor latere perioden ijs kan worden gebruikt om de oogbol direct afkoelen en vervolgens diepvriezer kan worden gebruikt om de oogbollen bewaren bij -80 ° C. - Na het verkrijgen van de ogen voor elk van de tijdstippen, scheiden de bevroren oogbollen in drie compartimenten, het glasachtig lichaam, de waterige humor en het netvlies / vaatvlies. Scheid deze compartimenten voor defrosTing.
OPMERKING: De belangrijkste voor de verdeling in drie compartimenten is de snelheid van de procedure. De oogbol moet zeer snel het ontdooien worden gescheiden en de procedure kan worden uitgevoerd op het ijs te ontdooien vertragen.- Om de wereld te openen, maak dan een incisie in het hoornvlies limbus (300 ° of hoger) met een scalpel. Verkrijgen van de bevroren, gelegen voor de iris, de waterige humor.
- Verwijder de bevroren iris en de lens door te trekken en excoriating met behulp van weefsel tang. Wanneer het glasvocht toegankelijk wordt, krijgen de bevroren glasachtige door scheiden van de resterende weefsels (retina / choroid / sclera).
- Met behulp van een scalpel No. 15, scheiden het netvlies / vaatvlies weefsel van de onderliggende sclera.
- Voor immunoassays, ontdooien kamerwater monsters, en meet het volume van elk monster. Meet het gewicht van de bevroren monsters door het aftrekken van het gewicht van een lege buis dan die van de buis met tHij bevroren monster.
Opmerking Aangezien het soortelijk gewicht van de bevroren monsters ongeveer 1, kan het gewicht van elk monster worden gebruikt om het volume van het monster. - Weeg de glasachtige monsters, ontdooien van de monsters en oplosbaar ze in 1,0 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing die 1% runderserumalbumine op een rotator nacht bij 4 ° C. Vervolgens centrifuge de monsters bij 387 xg gedurende 10 min 21.
- Weeg de bevroren netvlies / vaatvlies monsters voor homogenisering. Voeg eiwit extractie reagens met een verhouding van weefsel reagens van 1:10 (1 g weefsel / 10 ml reagens). Homogeniseren het weefsel met een voorgekoeld microhomogenizer. Centrifugeer de gelyseerde monster gedurende 10 min bij 12,000-20,000 xg en het supernatant over te dragen aan een gekoelde EPP buis.
3. Immunoassay
OPMERKING: Verscheidene analysemethoden kunnen worden gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie. Kies een geschikte kwantitatieve methode, dfhankelijk op het detectiebereik. In het kort, kan de geselecteerde ion bewakingsmodus van HPLC detecteren picogram niveaus van de molecule, terwijl LC-MS / MS kan detecteren nanogram en picogram niveaus van eiwitten voor het profileren met MRM / PRM-modus, respectievelijk. De detectielimiet van ELISA wordt geacht te zijn op het niveau picogram.
- Voor de indirecte enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA's) om concentraties van anti-VEGF middelen meten, gebruik ELISA kits in 96-well platen voor het geneesmiddel van belang te detecteren en genereren van een standaardcurve van bekende geneesmiddelconcentraties.
- Verdun het glasvocht, de waterige humor en het netvlies / vaatvlies monsters met 0,1% runderserumalbumine in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) concentraties die binnen het lineaire gebied, en deze gebruiken voor de test.
- Verdeel de monsters in aliquots aan de plaat bij 100 pl / putje. Incubeer overnacht bij 4 ° C en was de plaat driemaal met gebruikmaking van 200 pl van de wasoplossing van 0.05% Tween20 in 1x PBS.
OPMERKING: De anti-VEGF aanwezig is in het monster fungeert als het primaire antilichaam voor ELISA; daarom aanvullend gebruik van een primair antilichaam niet nodig. - Verdun het secundaire antilichaam 1: 20.000 in 0,1% BSA in 1x PBS en voeg 100 ul van de verdunde oplossing per putje. Na incuberen van de plaat met een verdunde secundaire antilichaam overnacht bij 4 ° C, meet de optische dichtheid bij 450 nm golflengte. Trek de gemiddelde nulstandaard optische dichtheid van het gemiddelde van duplicaat metingen voor elke standaard en monster.
- Een standaardcurve gebaseerd op de relatieve lichtsignaal uit oplossingen van het geneesmiddel met bekende concentratie door het verminderen van de gegevens met computersoftware kunnen genereren een vier-parameter logistische (4-PL) curve fit, zoals SoftMax Pro. Voor het maken van een standaard curve, kan de 4-PL curve fit worden verkregen door te klikken op [4-parameter] in [Standard Curve] - [Fit].
- Bereken de geneesmiddelconcentratie in de monsters frOM de standaardcurve.
OPMERKING: De detectielimieten (LOD) van anti-VEGF geneesmiddelen werden onderzocht in ons experiment. De LOD van bevacizumab was 0,024-3,125 ng / ml en die van aflibercept was 0,039-10 ng / ml.
4. farmacokinetische analyse Methoden
LET OP: Voor PK-analyse, kan men ofwel compartimentspecifieke of niet-compartimentele analyse. In compartimentele analyse kan dispositie gedrag van moleculen worden verklaard door een vergelijking (model). Zo kan compartimentele PK analyse van de concentratie te voorspellen op elk moment t terwijl de niet-compartimentele model niet kan visualiseren of te voorspellen concentratie-tijd profielen voor andere doseringsschema's. Echter, het aanbrengen van compartimentele modellen kunnen een complex en langdurig proces zijn. In tegenstelling, veronderstellingen zijn minder restrictief in niet-compartimenten model. De niet-compartimentele methode is eenvoudig en algemeen gebruikt om de farmacokinetische parameters zoals halfwaardetijd, klaring en distributievolume berekenen.We kozen compartimentele farmacokinetische modellen voor studies naar anti-VEGF middelen.
- Analyseer de drug concentratie gegevens met de compartimentele modellen met behulp van modeling software, zoals Phoenix WinNonlin software.
- Klik [PK model] in [WNL5 klassieke modellering] en de kaart van de observatietijd, toegediende dosis, en de concentratie van het geneesmiddel in het menu [Instellen].
- Selecteer compartimenten model (bv aantal compartimenten) in het tabblad [model selectie], en klik op de [Execution] knop om model parameters te berekenen.
- Na de analyses, selecteert u het laatste compartiment model dat het beste beschrijft de concentratie van het geneesmiddel gegevens op basis van de volgende criteria: (bijv., Standaard fout) (1) Akaike Information Criterion, (2) de precisie van parameterschattingen, en (3) grafische analyse (bv., goedheid van fit percelen).
- Bereken farmacokinetische parameters van belang, zoals halfwaardetijd (T 1/2) en het gebied onder de time-Concentratie curve (AUC) van de modelparameters en vergelijkingen gedreven door de compartimentele model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De procedure die wordt gebruikt om intravitreale injecties van een geneesmiddel van interesse in konijnenogen met steriele technieken te voeren wordt getoond in figuur 1. De behandelde ogen enucleated op een geplande tijd en bewaard bij -80 ° C. Voor de analyse, drie compartimenten, de waterige humor, het glasvocht en het netvlies / vaatvlies, gescheiden van de bevroren konijnenogen, zoals aangetoond in figuur 2. Monsters van de compartimenten zijn opgesteld voor ELISA. Na incubatie met een secundair antilichaam, wordt de optische dichtheid gemeten in een 96-well plaat, die bekende concentraties van het geneesmiddel van belang voor de standaardcurve en monsters van de drie compartimenten op verschillende tijdstippen werden verzameld na intravitreale injectie (fig 3). De concentratie data die wordt berekend uit de standaardkromme (aanvullende figuur 1) kan het worden aangebracht pharmacokinetic model, en de farmacokinetische parameters kan worden bepaald uit de gemonteerde lijn (figuur 4). In figuur 4, farmacokinetiek van intravitreaal geïnjecteerd bevacizumab in vitrectomized en niet-vitrectomized ogen geëvalueerd en vergeleken. Compartimentele PK analyse uitgevoerd, waarbij de volgende vergelijking verschaft om PK gedrag te verklaren.
C (t) = C 1 exp (- k 1 t) + C "2 exp (- k 2 t)
C (ug / ml) Concentratie allen tijde t (uren)
C 1, C 2:-back geëxtrapoleerd onderschept van de distributie- en eliminatiefase
k 1, k 2: snelheidsconstanten bij The distributie- en eliminatiefase
Zoals getoond in figuur 4, de geschatte concentratie overeenkomstig de aangepaste model vrij goed afgestemd met het actuele waarden. Er waren geen significante verschillen in glasachtige concentratie bevacizumab en farmacokinetische parameters zoals halfwaardetijd tussen met en zonder vitrectomie. Dit experiment suggereert dat de rol van het glasachtig lichaam in de verdeling en klaring van bevacizumab onbeduidend.
Figuur 1:. Procedure for Performing intravitreale injecties van Intraoculaire Drugs in de konijnenogen onder narcose Aseptische technieken worden toegepast indien 5% povidonjood druppels en door skin voorbereiding en de intravitreale injectie van het geneesmiddel plaats wordt uitgevoerd met een injectiespuit voorzien verstandha 30 G naald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Scheiding van de bevroren Konijn oogbol in drie compartimenten Na sclerale incisie met een chirurgisch mes en verwijdering van de iris, de waterige humor en glasvocht gescheiden. Vervolgens werd het netvlies / vaatvlies kan worden voorzichtig uit de sclera, dat is de witte buitenste laag van de oogbol gescheiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Enzyme-linked ImmunoAssay (ELISA) van de intraoculaire Drug in de monsters die de drie compartimenten. Deze figuur toont een 96-well plaat, die wordt gebruikt voor de immunoassay. Na incubatie met een secundair antilichaam, wordt een kleurverandering vastgesteld in de putjes. De optische dichtheid van de kleur is afhankelijk van de concentratie van het geneesmiddel van belang zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Montage van de geobserveerde data naar de farmacokinetische Model In dit experiment een vergelijking van de farmacokinetiek van bevacizumab in vitrectomized en non-vitrectomized ogen, wordt de werkelijke intravitreale concentratie van bevacizumab gepresenteerd als stippen. Gemonteerde curven voor de concentratie data die worden aangedreven door de farmacokinetischemodel, die worden voorgesteld door twee lijnen worden getrokken en gebruikt voor de berekening van de farmacokinetische parameters, zoals de halfwaardetijd van het geneesmiddel. Fout balken geven 95% betrouwbaarheidsintervallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Figuur 1:. De Standard Curve van de ELISA gebruikt voor de detectie van Bevacizumab Dit wordt verkregen met behulp van de software in staat is het genereren van een vier-parameter logistische curve fit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| species | glasachtig | waterige humor | Verwijzenlingen |
| Muis | 5.3 ul | 4,4 pl | 22 |
| Rat | 50-55 ul | 13,6 pl | 22, 24 |
| Konijn | 1,15-1,7 ml | 350 ul | 23, 27, 28 |
| Aap | 3,0-4,0 ml | 102 pl | 23, 26, 28 |
| menselijk | 3,0-5,0 ml | 144-247 gl | 23, 20, 21, 28 |
Tabel 1: glasvocht en Waterige Humor Volume in verschillende diersoorten 17,22-30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zoletil | Virbac Laboratories, Carros Cedex, France | ||
| Xylazine hydrochloride | Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA | ||
| Proparacaine hydrochloride (Alcaine) | Alcon laboratories, Fort Worth, TX | ||
| Phenylephrine hydrochloride and tropicamide | Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan | ||
| Recombinant Human VEGF 165 | R&D systems | 293-VE-050 | |
| Carbobate-Bicarbonate buffer | SIGMA | C3041-50CAP | |
| Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si | Thermo SCIENTIFIC | 167008 | 96 well plate |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) | BOVOGEN | BSA025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml | gibco | 10010-023 | |
| Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-28652 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) | abcam | ab97225 | |
| Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-85183 | |
| CelLytic MT Cell Lysis Reagent | SIGMA | C3228-50ML | lysis buffer |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #15 | |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #10 | |
| Feather surgical blade stainless steel | FEATHER | 11 | |
| 1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34018 | |
| Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34062 | |
| Softmax Pro | Molecular Devices | v.5.4.1 | software for generating standard curve |
| SAAM II | Saam Institute, Seattle, WA | software for pharmacokinetic modeling | |
| Phoenix WinNonlin | Pharsight, Cary, NC | v. 6.3 | software for pharmacokinetic modeling |
| Avastin (bevacizumab) | Genentech |
References
- Urtti, A. Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 58, 1131-1135 (2006).
- Geroski, D. H., Edelhauser, H. F. Drug delivery for posterior segment eye disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 961-964 (2000).
- Ghate, D., Edelhauser, H. F. Ocular drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 3, 275-287 (2006).
- Del Amo, M. E., Urtti, A. Current and future ophthalmic drug delivery systems. A shift to the posterior segment. Drug Discov Today. 13, 135-143 (2008).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal injection technique and monitoring: updated guidelines of an expert panel. Retina. 34, Suppl 12. S1-S18 (2014).
- Kim, Y. C., Chiang, B., Wu, X., Prausnitz, M. R. Ocular delivery of macromolecules. J Control Release. 190, 172-181 (2014).
- Group, C. R., et al. Ranibizumab and bevacizumab for neovascular age-related macular degeneration. N Engl J Med. 364, 1897-1908 (2011).
- Campochiaro, P. A., et al. Sustained benefits from ranibizumab for macular edema following central retinal vein occlusion: twelve-month outcomes of a phase III study. Ophthalmology. 118, 2041-2049 (2011).
- Brown, D. M., et al. Ranibizumab for macular edema following central retinal vein occlusion: six-month primary end point results of a phase III study. Ophthalmology. 117, 1124-1133 (2010).
- Diabetic Retinopathy Clinical Research Network. Aflibercept, bevacizumab, or ranibizumab for diabetic macular edema. N Engl J Med. 372, 1193-1203 (2015).
- McCannel, C. A. Meta-analysis of endophthalmitis after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor agents: causative organisms and possible prevention strategies. Retina. 31, 654-661 (2011).
- Meyer, C. H., et al. Incidence of rhegmatogenous retinal detachments after intravitreal antivascular endothelial factor injections. Acta Ophthalmol. 89, 70-75 (2011).
- Del Amo, E. M., Urtti, A. Rabbit as an animal model for intravitreal pharmacokinetics: Clinical predictability and quality of the published data. Exp Eye Res. 137, 111-124 (2015).
- Hughes, P. M., Krishnamoorthy, R., Mitra, A. K. Vitreous disposition of two acycloguanosine antivirals in the albino and pigmented rabbit models: a novel ocular microdialysis technique. J Ocul Pharmacol Ther. 12, 209-224 (1996).
- Ahn, J., et al. Pharmacokinetics of Intravitreally Injected Bevacizumab in Vitrectomized Eyes. J Ocul Pharmacol Ther. , (2013).
- Park, S. J., et al. Intraocular pharmacokinetics of intravitreal vascular endothelial growth factor-Trap in a rabbit model. Eye (Lond). 29, 561-568 (2015).
- Jager, R. D., Aiello, L. P., Patel, S. C., Cunningham, E. T. Risks of intravitreous injection: a comprehensive review. Retina. 24, 676-698 (2004).
- Durairaj, C., Shah, J. C., Senapati, S., Kompella, U. B. Prediction of vitreal half-life based on drug physicochemical properties: quantitative structure-pharmacokinetic relationships (QSPKR). Pharm Res. 26, 1236-1260 (2009).
- Ahn, S. J., et al. Intraocular pharmacokinetics of ranibizumab in vitrectomized versus nonvitrectomized eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 567-573 (2014).
- Mochizuki, K., et al. Intraocular kinetics of ceftazidime (Modacin). Ophthalmic Res. 24, 150-154 (1992).
- Bakri, S. J., et al. Pharmacokinetics of intravitreal ranibizumab (Lucentis). Ophthalmology. 114, 2179-2182 (2007).
- Kondo, T., Miura, M., Imamichi, M. Measurement method of the anterior chamber volume by image analysis. Br J Ophthalmol. 70, 668-672 (1986).
- Toris, C. B., Yablonski, M. E., Wang, Y. L., Camras, C. B. Aqueous humor dynamics in the aging human eye. Am J Ophthalmol. 127, 407-412 (1999).
- Remtulla, S., Hallett, P. E. A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat. Vision Res. 25, 21-31 (1985).
- Barza, M. Animal models in evaluation of chemotherapy of ocular infections. Experimental Models in Antimicrobial Chemotherapy. Zak, O., Sande, M. A. , Harcourt Brace Jovanovich. 187-211 (1986).
- Hughes, A. A schematic eye for the rat. Vision Res. 19, 569-588 (1979).
- Maurice, D. M., Mishima, S. Ocular pharmacokinetics. 69, Springer Verlag. (1984).
- Greenbaum, S., Lee, P. Y., Howard-Williams, J., Podos, S. M. The optically determined corneal and anterior chamber volumes of the cynomolgus monkey. Curr Eye Res. 4, 187-190 (1985).
- Ruby, A. J., Williams, G. A., Blumenkranz, M. S. Vitreous humor. Foundations of Clinical Ophthalmology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Jaffe, G. J., Ashton, P., Andrew, P. Intraocular Drug Delivery. , Taylor & Francis. (2006).
- Iyer, M. N., et al. Clearance of intravitreal moxifloxacin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 317-319 (2006).
- Fauser, S., et al. Pharmacokinetics and safety of intravitreally delivered etanercept. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 242, 582-586 (2004).
- Scholes, G. N., O'Brien, W. J., Abrams, G. W., Kubicek, M. F. Clearance of triamcinolone from vitreous. Arch Ophthalmol. 103, 1567-1569 (1985).
- Stastna, M., Behrens, A., McDonnell, P. J., Van Eyk, J. E. Analysis of protein composition of rabbit aqueous humor following two different cataract surgery incision procedures using 2-DE and LC-MS/MS. Proteome Sci. 9, 8 (2011).
- Sinapis, C. I., et al. Pharmacokinetics of intravitreal bevacizumab (Avastin(R)) in rabbits. Clin Ophthalmol. 5, 697-704 (2011).
- Gaudreault, J., Fei, D., Rusit, J., Suboc, P., Shiu, V. Preclinical pharmacokinetics of Ranibizumab (rhuFabV2) after a single intravitreal administration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 726-733 (2005).
- Maurice, D. Review: practical issues in intravitreal drug delivery. J Ocul Pharmacol Ther. 17, 393-401 (2001).
- Laude, A., et al. Intravitreal therapy for neovascular age-related macular degeneration and inter-individual variations in vitreous pharmacokinetics. Prog Retin Eye Res. 29, 466-475 (2010).
- Christoforidis, J. B., Carlton, M. M., Knopp, M. V., Hinkle, G. H. PET/CT imaging of I-124-radiolabeled bevacizumab and ranibizumab after intravitreal injection in a rabbit model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 5899-5903 (2011).
- Sangwan, V. S., Pearson, P. A., Paul, H., Comstock, T. L. Use of the Fluocinolone Acetonide Intravitreal Implant for the Treatment of Noninfectious Posterior Uveitis: 3-Year Results of a Randomized Clinical Trial in a Predominantly Asian Population. Ophthalmol Ther. 4, 1-19 (2015).
- Bajwa, A., Aziz, K., Foster, C. S. Safety and efficacy of fluocinolone acetonide intravitreal implant (0.59 mg) in birdshot retinochoroidopathy. Retina. 34, 2259-2268 (2014).
- Sanford, M. Fluocinolone acetonide intravitreal implant (Iluvien(R)): in diabetic macular oedema. Drugs. 73, 187-193 (2013).
- Haller, J. A., et al. Dexamethasone intravitreal implant in patients with macular edema related to branch or central retinal vein occlusion twelve-month study results. Ophthalmology. 118, 2453-2460 (2011).
- Boyer, D. S., et al. Three-year, randomized, sham-controlled trial of dexamethasone intravitreal implant in patients with diabetic macular edema. Ophthalmology. 121, 1904-1914 (2014).
- Patel, S. R., et al. Targeted administration into the suprachoroidal space using a microneedle for drug delivery to the posterior segment of the eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4433-4441 (2012).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3, 1377-1397 (2011).
