Abstract
La ruta de administración del fármaco intraocular permite la entrega de altas concentraciones de fármacos terapéuticos, al tiempo que minimiza su absorción sistémica. Varios fármacos se administran en la cámara anterior o vítrea, y la inyección intraocular ha sido eficaz en la curación de diversas enfermedades intraoculares. los ojos del conejo han sido ampliamente utilizados para la investigación oftálmica, como el animal es fácil de manejar y económico en comparación con otros mamíferos, y el tamaño de un ojo del conejo es similar a la de un ojo humano. Usando una aguja G 30, las drogas se pueden inyectar en los espacios intracameral y intravítreas de ojos de conejo. Los globos oculares se congelan hasta el análisis, y se pueden dividir en el humor acuoso, humor vítreo y la retina / coroides. Las muestras de vítreo y la retina / coroides se pueden homogeneizar y se solubilizaron antes del análisis. Entonces, los inmunoensayos se pueden realizar para medir las concentraciones de fármacos intraoculares en cada compartimiento. modelos farmacocinéticos apropiados pueden serutilizado para calcular varios parámetros, tales como la vida media y la concentración máxima del fármaco. ojos de los conejos pueden ser un buen modelo para el estudio farmacocinético de los fármacos intraoculares.
Introduction
Antes de la llegada de administración del fármaco intraocular, la preocupación principal de la terapia médica para enfermedades intraoculares fue la eficiencia con la que el fármaco podría penetrar en el ojo. La barrera hemato-ocular impide que muchas sustancias, incluidos los medicamentos, se difunda en el ojo. Por lo tanto, las concentraciones de los fármacos que están por encima de los niveles terapéuticos no se pueden obtener fácilmente. El método de administración del fármaco intraocular, incluyendo intracameral y intravítreas inyecciones, puede pasar por alto directamente la barrera sangre-ocular 1-3, de modo que las concentraciones terapéuticas de los medicamentos se pueden lograr en el ojo 4,5.
En consecuencia, la administración de fármacos intravítrea se ha convertido en un método popular de tratamiento para varias enfermedades intraoculares 5,6. Por ejemplo, la inyección intravítrea se realiza ampliamente para la degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, oclusión de la vena de la retina, y las infecciones intraoculares 7-10. En particular, dadola introducción de los medicamentos anti-VEGF, la frecuencia de las inyecciones intravítreas se ha incrementado notablemente para el tratamiento de enfermedades de la retina. Por lo tanto, es importante entender la farmacocinética de tales fármacos intraoculares para evaluar la eficacia y seguridad de la terapia médica.
Aunque la administración intraocular de fármacos se considera un importante avance en la terapia médica para enfermedades oculares, la supervisión de la concentración de fármaco dentro del globo ocular es técnicamente exigente. Debido a que los ojos humanos contienen sólo pequeñas cantidades de humor acuoso (aproximadamente 200 l) y vítreo (alrededor de 4,5 ml, Tabla 1), es técnicamente difícil obtener cantidades suficientes de fluido ocular para medir la concentración de fármaco. Por otra parte, los métodos que se utilizan para obtener el líquido del ojo, tales como la escucha vítrea o paracentesis de la cámara anterior, pueden dañar el tejido ocular y dar lugar a complicaciones graves, tales como cataratas, endoftalmitis, odesprendimiento de retina 11,12. De acuerdo con ello, los modelos animales se utilizan en los estudios farmacocinéticos de los fármacos intraoculares de uso común 13. Entre estos modelos animales, conejos o monos son los animales más frecuentemente utilizadas.
Conejos, que son pequeños mamíferos del orden Lagomorpha de la familia de los lepóridos, se encuentran en varias partes del mundo. Debido a que los conejos no son agresivos, son fáciles de manejar, utilizar en un experimento, y observar. Menor coste, fácil disponibilidad del animal, el tamaño del ojo similares a los humanos, y una gran base de datos de información para la comparación favor la realización de estudios farmacocinéticos utilizando los ojos del conejo. En este trabajo, se describe un protocolo para el estudio farmacocinético de los fármacos intraoculares en ojos de conejos.
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Protocol
Nuestro protocolo sigue las directrices de la Atención Institucional Animal y Uso Comisión (IACUC) del Hospital Bundang Universidad Nacional de Seúl, que aprobó todos los procedimientos con animales y los métodos de cuidado de los animales presentados en este protocolo. El IACUC está en plena conformidad con la octava edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2011). Todos los procedimientos se realizaron con apego a las directrices de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión en los animales. jaulas individuales se utilizaron para alojar a los conejos. Cirugía o preparación adicional antes de llevar a cabo este experimento (es decir, esterilización) puede no ser necesaria.
1. La inyección intraocular del fármaco en ojos de conejo
- Anestesie sanos conejos blancos de Nueva Zelanda que pesan 1,5-2 kg con una inyección intramuscular de una mezcla de clorhidrato de tiletamina y zolazepamclorhidrato (15 mg / kg) y clorhidrato de xilazina (5 mg / kg). Verificar la anestesia mediante el control del reflejo (abrir y cerrar) palpebral o pellizco oreja.
NOTA: Si un medicamento intraocular se une a los pigmentos oculares, el grado de unión puede inducir la modificación de la farmacocinética ocular de la droga. Por ejemplo, la vida media de un fármaco de unión de pigmento en los humores vítreos y acuosos de conejos pigmentados puede ser aumentado en comparación a la de conejos albinos 14. En este caso, los datos obtenidos de los ojos del conejo pigmentadas pueden ser más similar y aplicable a los ojos humanos que los ojos humanos tienen un grado diferente de pigmentación y de conejo albino ojos pueden no representar homólogos humanos. Por lo tanto, teniendo en cuenta la interacción fármaco-pigmento, el uso de conejos pigmentados o albinos debe ser cuidadosamente considerado y los resultados deben interpretarse junto con la cepa (pigmentación) de conejo. Sin embargo, se recomienda conejos albinos para su uso en estudios que comparan las propiedades farmacocinéticas como el dinteracción alfombra de pigmento puede ser un factor de confusión en la comparación.- Aplicar un anestésico tópico con 1% de clorhidrato de proparacaına colirios oftálmicos. Utilice ungüento veterinario (2% hidroxipropilmetilcelulosa) para evitar la sequedad ocular hasta que la recuperación de la anestesia.
NOTA: Nunca deje desatendido el conejo anestesiado mientras.
- Aplicar un anestésico tópico con 1% de clorhidrato de proparacaına colirios oftálmicos. Utilice ungüento veterinario (2% hidroxipropilmetilcelulosa) para evitar la sequedad ocular hasta que la recuperación de la anestesia.
- Dilatar la pupila con una o dos gotas de clorhidrato de fenilefrina y tropicamida.
- Para la preparación quirúrgica antes de la inyección intraocular, aplique un 5-10% de povidona yodada a la piel periocular con un hisopo de algodón 5. Colocar una gota de 5 a 10% de povidona yodada en la conjuntiva del ojo.
- Administrar los fármacos intraoculares ya sea por vía intravítrea o intracameral utilizando técnicas asépticas 5.
NOTA: El fármaco se absorbe en la circulación sistémica también puede penetrar en el ojo contralateral. Cuando un fármaco se administra a los dos ojos, la concentración del fármaco en un ojo puede verse afectada por la droga se inyecta enel otro ojo. Si se confirma que el efecto de la inyección contralateral puede despreciarse como el fármaco en la circulación sistémica no pueden penetrar en el otro ojo, el uso de ambos ojos para inyecciones intraoculares puede ser considerado, ya que es económico y reduce al mínimo el número de animales sacrificados para los estudios farmacocinéticos. Para el estudio farmacocinético de la concentración sistémica después de la inyección intraocular, el uso de un solo ojo es apropiado.- Para las inyecciones intravítreas, inyectar el fármaco por vía intravítrea 1 mm detrás del limbo quirúrgico en el cuadrante superotemporal utilizando una aguja G 30 y, o bien comerciales jeringuillas de 1 ml, jeringas de insulina, o jeringas de vidrio perpendicular a la superficie escleral 5.
NOTA: El volumen de medicamento que se usa para la inyección intravítrea intracameral y varía dependiendo de los fármacos bajo investigación. Para los experimentos farmacocinéticos en agentes anti-VEGF utilizando los ojos de conejos, los estudios anteriores utilizaron 0,025, 0,05 (más común), o 0,1 ml de bevacizumab o ranibizumab para la inyección intravítrea o intracameral. En nuestros estudios anteriores sobre la farmacocinética intraoculares de factor de crecimiento endotelial anti-vascular, 0,05 ml de bevacizumab 15, 0,025 ml de ranibizumab, o 0,03 ml de VEGF-Trap 16 se utilizaron. El volumen más grande segura y sin paracentesis se cree que es de 0,1 ml, aunque ha habido poca evidencia para apoyar esta 17. Si se inyecta un volumen excesivo ya sea intracameral o por vía intravítrea, la presión intraocular se incrementa en gran medida. Además del daño del nervio óptico causado directamente por el aumento de la presión intraocular (IIOP), a saber glaucomatosa daño del nervio óptico, en casos extremos, el IIOP conduce a la alteración de la perfusión ocular y oclusión de la arteria central de la retina, que es análogo al ictus en el cerebro. - Para las inyecciones intracamerales, inyecte el medicamento en la cámara anterior mediante la inserción de una aguja G 30 a través del limbo corneoescleral con el bisel y avanzarlo paralelo al plano del iris para minimizar el riesgo de traumatismo en el iris o la lente.
NOTA: Dependiendo de la formulación del fármaco, las agujas más grandes de 30 G se puede utilizar. Las condiciones que requieren aguja de calibre más grande incluyen microesferas que contienen fármacos, drogas a gran proteínas, y las formulaciones de alta viscosidad. - Después de la inyección, comprimir el sitio de la inyección con un aplicador de punta de algodón estéril para promover la curación de la herida.
NOTA: Normalmente, 30 sec es suficiente para la cicatrización de heridas, cuando se utiliza una aguja de 30 G para inyección intraocular. Sin embargo, si una aguja de calibre más grande se utiliza para la inyección intraocular, tiempo más largo sería apropiado para el sellado para minimizar la fuga de la herida sclerotomy herida. Para comprobar si hay fugas sclerotomy herida es importante asegurarse de que la cantidad de fármaco intraocular se utiliza inmediatamente después de la inyección intraocular es la misma que la cantidad de inyección, especialmente si se utiliza una aguja de calibre grande.
- Para las inyecciones intravítreas, inyectar el fármaco por vía intravítrea 1 mm detrás del limbo quirúrgico en el cuadrante superotemporal utilizando una aguja G 30 y, o bien comerciales jeringuillas de 1 ml, jeringas de insulina, o jeringas de vidrio perpendicular a la superficie escleral 5.
- Observar los conejos tratados diarias parauna semana, y una vez a la semana después, para cualquier signo de inflamación severa intraocular (inyección conjuntival y hipopion) hasta la eutanasia.
NOTA: Los analgésicos después de la inyección no son necesarios como la inyección intraocular utilizando una aguja de 30 G es un procedimiento mínimamente invasivo que no se acompaña de dolor post-quirúrgico. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de los otros animales hasta que esté completamente recuperado.
Preparación 2. Muestra
- Para la enucleación, la eutanasia a los conejos a diversos puntos de tiempo (por ejemplo., 1 hr o 1, 2, 5, 9, 14, o 30 días) después de la inyección del fármaco intraocular.
NOTA: Estos puntos de tiempo dependen del fármaco de interés y los perfiles farmacocinéticos conocidos. Para cada punto de tiempo, utilizar al menos dos globos oculares 13. Para obtener una calidad fiable de datos, tiempo de muestreo debe elegirse cuidadosamente, al menos cuatro puntos de tiempo con el muestreo equilibrado durante al menos un lapso de tiempo de dos vidas medias de la droga 13 18, en particular, más de 1 punto del tiempo durante las primeras 24 horas es crucial. Por consiguiente, para macromoléculas (> 1000 Da) 18, un periodo de muestreo, tales como 1 hr y 1, 2, 5, 9, 14, y 30 días 19 puede ser una buena opción. Para moléculas pequeñas (≤1,000 Da), 1, 2, 4 y 8 horas y 1, 3 y 7 días puede ser una opción 20. Dependiendo del peso molecular, el periodo de muestreo puede ser modificado adicionalmente.- Para la eutanasia, administrar 10 ml de 15% de KCl intravenosa rápidamente después de anestesiar a los conejos con una inyección intramuscular de una mezcla de clorhidrato de tiletamina, clorhidrato de zolazepam (15 mg / kg), y clorhidrato de xilazina (5 mg / kg).
- Abrir la hendidura palpebral con un retractor del párpado. Hacer un 360 ° incisión conjuntival 2-3 mm por detrás del limbo y extenderlo posteriormente por la disección de la conjunctiva y la cápsula de Tenon del globo.
- Cortar los músculos extraoculares cerca de su inserción en el mundo. Sujetar el nervio óptico con pinzas curvas y luego se corta el nervio entre las pinzas y el mundo. Retire el globo ocular, dejando intactos los tejidos circundantes. Después de la enucleación, congelar inmediatamente los globos oculares y almacenar a -80 ° C.
NOTA: Puede haber dos opciones para la congelación inmediata. Si la concentración del fármaco se mide en una fase muy temprana (es decir. Menos de 1 hora), el nitrógeno líquido puede ser más apropiado para asegurar la congelación mejor oportuna del globo ocular. Sin embargo, para periodos posteriores, el hielo puede ser usado para enfriar el globo ocular inmediatamente y, a continuación congelador se puede utilizar para almacenar los globos oculares a -80 ° C. - Después de obtener los globos oculares para todos los puntos de tiempo, separar los globos oculares congelados en tres compartimentos, el humor vítreo, el humor acuoso, y la retina / coroides. Separar estos compartimentos antes defrosting.
NOTA: El punto más importante para la separación en tres compartimentos es la velocidad del procedimiento. El globo ocular se debe separar muy rápidamente antes de la descongelación y el procedimiento se puede realizar en el hielo para retrasar la descongelación.- Para abrir el mundo, hacer una incisión en el limbo corneal (300 ° o mayor) con una hoja de bisturí. Obtener el compartimiento congelado delante del iris, el humor acuoso.
- Retire el iris congelados y la lente tirando y excoriantes utilizando pinzas de tejido. Cuando el vítreo se hace accesible, obtener el vítreo congelado mediante la separación de los tejidos restantes (retina / coroides / esclerótica).
- El uso de una hoja de bisturí No. 15, se separa la retina tejido / coroides de la esclerótica subyacente.
- Para inmunoensayos, descongelar las muestras de humor acuoso, y medir el volumen de cada muestra. Medir el peso de las muestras congeladas restando el peso de un tubo vacío de la del tubo que contiene tse congela la muestra.
Nota: debido a la gravedad específica de las muestras congeladas es de aproximadamente 1, el peso de cada muestra se puede usar para calcular el volumen de la muestra. - Pesar las muestras vítreas, descongelar las muestras, y solubilizar en 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato que contenía 1% de albúmina de suero bovino en un rotador durante la noche a 4 ° C. A continuación, centrifugar las muestras a 387 xg durante 10 min 21.
- Pesar las muestras congeladas de retina / coroides para la homogeneización. Añadir reactivo de extracción de proteína con una relación de tejido a reactivo de 1:10 (1 g de tejido / 10 ml de reactivo). Homogeneizar el tejido usando un microhomogenizer pre-enfriada. Centrifugar la muestra lisada durante 10 min a 12,000-20,000 xg y transferir el sobrenadante a un tubo de EPP enfriada.
3. Inmunoensayo
NOTA: Varias metodologías analíticas se pueden utilizar para la medición de la concentración de proteína. Elija un método cuantitativo adecuado, degún el rango de detección. En pocas palabras, el modo de seguimiento de iones seleccionados de HPLC puede detectar niveles de picogramos de molécula, mientras que LC-MS / MS puede detectar niveles de nanogramos y picogramos de proteína para perfilar con el modo MRM / PRM, respectivamente. El límite de detección de ELISA se considera que es en el nivel de picogramos.
- Para los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) indirecto para medir las concentraciones de anti-VEGF agentes, utilizar kits de ELISA en placas de 96 pocillos para detectar el fármaco de interés y generar una curva estándar de concentraciones de fármaco conocidos.
- Diluir la, el humor acuoso vítreo, y las muestras de retina / coroides con 0,1% de albúmina de suero bovino en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a las concentraciones que se encuentran dentro del intervalo lineal, y utilizar éstos para el ensayo.
- Divida las muestras en alícuotas en la placa a 100 l / pocillo. Incubar toda la noche a 4 ° C y luego se lava la placa tres veces con 200 l de la solución de lavado de 0.05% de Tween 20 en 1x PBS.
NOTA: El anti-VEGF presentes en la muestra actúa como el anticuerpo primario para ELISA; Por lo tanto, el uso adicional de un anticuerpo primario no es necesario. - Diluir el anticuerpo secundario a 1: 20.000 en 0,1% de BSA en PBS 1x, y añadir 100 l de la solución diluida por pocillo. Después de incubar la placa con un anticuerpo secundario diluido durante la noche a 4 ° C, se mide la densidad óptica a 450 nm de longitud de onda. Restar la media de la densidad óptica estándar cero de la media de las lecturas por duplicado para cada patrón y muestra.
- Crear una curva estándar basada en la señal de luz relativa de las soluciones de la droga con concentraciones conocidas mediante la reducción de los datos utilizando software de ordenador capaz de generar una de cuatro parámetros logísticos ajuste de la curva (4-PL), tales como SoftMax Pro. Para la creación de una curva estándar, el ajuste de la curva 4-PL se puede obtener haciendo clic en [4-parámetro] en [Curva Estándar] - [Fit].
- Calcular la concentración de fármaco en las muestras from la curva estándar.
NOTA: Los límites de detección (LOD) de los fármacos anti-VEGF se investigaron en nuestro experimento. El LOD de bevacizumab era 0,024 a 3,125 ng / ml y la de aflibercept era 0.039-10 ng / ml.
4. Métodos de análisis farmacocinéticos
NOTA: Para el análisis de PK, se puede utilizar cualquiera compartimental o el análisis no compartimental. En el análisis compartimental, el comportamiento de la disposición de las moléculas se puede explicar por una ecuación (modelo). Por lo tanto, el análisis PK compartimental puede predecir la concentración en cualquier momento t mientras que el modelo no compartimental no puede visualizar o predecir los perfiles de concentración-tiempo para otros regímenes de dosificación. Sin embargo, ajuste de modelos compartimentales puede ser un proceso largo y complejo. Por el contrario, los supuestos son menos restrictivas en el modelo no compartimental. El método no compartimental es simple y de uso común para calcular los parámetros farmacocinéticos tales como la vida media, el aclaramiento y volumen de distribución.Elegimos modelos compartimentales para estudios farmacocinéticos en agentes anti-VEGF.
- Analizar los datos de concentración del fármaco con los modelos compartimentales usando el software de modelado como el software Phoenix WinNonlin.
- Haga clic en [modelo PK] en [modelización WNL5 clásica] y el mapa del tiempo de observación, la dosis administrada y la concentración del fármaco en el menú [Configuración].
- Seleccionar modelo compartimental (por ejemplo, número de compartimientos) en la pestaña [Selección de modelo], y haga clic en el botón [Ejecución] para calcular los parámetros del modelo.
- Después de los análisis, seleccione el modelo de compartimentos final que mejor describe los datos de concentración de fármaco en base a los siguientes criterios: (. Por ejemplo, el error estándar) (1) Criterio de Información de Akaike, (2) la precisión de las estimaciones de los parámetros, y (3) análisis gráfico (por ejemplo., bondad de ajuste parcelas).
- Calcular los parámetros farmacocinéticos de interés, tales como la vida media (T 1/2) y el área bajo el tiempo-concentracióncurva de la (AUC), a partir de los parámetros del modelo y las ecuaciones impulsados por el modelo compartimental.
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Representative Results
El procedimiento que se utiliza para llevar a cabo las inyecciones intravítreas de un medicamento de interés en los ojos del conejo con técnicas estériles se muestra en la Figura 1. Los ojos tratados se enucleados a una hora programada y se almacenaron a -80 ° C. Para el análisis, tres compartimentos, el humor acuoso, el humor vítreo, y la retina / coroides, se separan de los ojos de conejo congelados, como se demuestra en la Figura 2. Las muestras de los compartimentos están preparados para el ELISA. Después de la incubación con un anticuerpo secundario, la densidad óptica se mide en una placa de 96 pocillos, que contiene concentraciones conocidas de la droga de interés para la curva estándar y las muestras de los tres compartimentos que se recogieron a varios puntos de tiempo después de la inyección intravítrea (Figura 3). Los datos de concentración que se calcula a partir de la curva estándar (Figura 1) se puede montar a la pharmacokinemodelo de tic, y los parámetros farmacocinéticos se pueden determinar a partir de la línea de ajuste (Figura 4). En la Figura 4, farmacocinética de la inyección intravítrea de bevacizumab en vitrectomizados y los ojos no vitrectomizados fueron evaluados y comparados. Se realizó el análisis de FC compartimental, que proporcionó la siguiente ecuación para explicar el comportamiento de PK.
C (t) = C 1 exp (- k 1 t) + C '2 exp (- k 2 t)
C (g / ml): Concentración en cualquier momento t (horas)
C 1, C 2: intercepta respaldo extrapolado de la fase de distribución y eliminación
k 1, k 2: constantes de velocidad en el thdistribución de correo y la fase de eliminación
Como se muestra en la Figura 4, la concentración estimada de acuerdo con el modelo ajustado coincide bastante bien con los valores de medición reales. No hubo diferencias significativas en la concentración vítrea de los parámetros de bevacizumab y farmacocinéticos tales como la vida media entre con y sin vitrectomía. Este experimento sugiere que el papel del vítreo en la distribución y el aclaramiento de bevacizumab es insignificante.
Figura 1:. Procedimiento para realizar intravítreas inyecciones de intraoculares Drugs en el ojo del conejo bajo anestesia técnicas asépticas se utilizan mediante la aplicación de 5% gotas de povidona-yodo y por preparación de la piel, y la inyección intravítrea de la fármaco de interés se realiza utilizando una jeringa equipada ingenioja 30 G aguja. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. La separación del globo del ojo de conejo congelada en tres compartimentos Siguiendo incisión escleral con una cuchilla quirúrgica y la eliminación de los iris, el humor acuoso y el vítreo se puede separar. Posteriormente, la retina / coroides se puede separar cuidadosamente de la esclerótica, que es la capa exterior blanca del globo ocular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inmuno ligado a enzimassorbente de ensayo (ELISA) de la Intraocular de drogas en las muestras que representan los tres compartimentos. Esta figura muestra una placa de 96 pocillos, que se utiliza para el inmunoensayo. Después de la incubación con un anticuerpo secundario, un cambio de color se observa en los pocillos. La densidad óptica del color depende de la concentración del fármaco de interés. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Montaje de los datos observados para el modelo farmacocinético En este experimento comparando la farmacocinética de bevacizumab en los ojos vitrectomizados y no vitrectomizados, la concentración intravítrea de bevacizumab real se presenta en forma de puntos. Las curvas ajustadas para los datos de concentración que son impulsados por la farmacocinéticamodelo, que están representados por dos líneas, se extraen y se utiliza para el cálculo de los parámetros farmacocinéticos, tales como la vida media de la droga. Las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementaria Figura 1:. La curva estándar del ELISA utilizado para la detección de bevacizumab Esto se obtiene mediante el software capaz de generar un período de cuatro parámetros ajuste de la curva logística. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
| Especies | Vítreo | Humor acuoso | Referircia |
| Ratón | 5.3 l | 4.4 l | 22 |
| Rata | 50-55 l | 13,6 l | 22, 24 |
| Conejo | 1.15-1.7 ml | 350 l | 23, 27, 28 |
| Mono | 3,0-4,0 ml | 102 l | 23, 26, 28 |
| Humano | 3,0-5,0 ml | 144 - 247 l | 23, 20, 21, 28 |
Tabla 1: Volumen vítreo y humor acuoso en diferentes especies 17,22-30.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zoletil | Virbac Laboratories, Carros Cedex, France | ||
| Xylazine hydrochloride | Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA | ||
| Proparacaine hydrochloride (Alcaine) | Alcon laboratories, Fort Worth, TX | ||
| Phenylephrine hydrochloride and tropicamide | Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan | ||
| Recombinant Human VEGF 165 | R&D systems | 293-VE-050 | |
| Carbobate-Bicarbonate buffer | SIGMA | C3041-50CAP | |
| Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si | Thermo SCIENTIFIC | 167008 | 96 well plate |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) | BOVOGEN | BSA025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml | gibco | 10010-023 | |
| Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-28652 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) | abcam | ab97225 | |
| Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-85183 | |
| CelLytic MT Cell Lysis Reagent | SIGMA | C3228-50ML | lysis buffer |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #15 | |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #10 | |
| Feather surgical blade stainless steel | FEATHER | 11 | |
| 1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34018 | |
| Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34062 | |
| Softmax Pro | Molecular Devices | v.5.4.1 | software for generating standard curve |
| SAAM II | Saam Institute, Seattle, WA | software for pharmacokinetic modeling | |
| Phoenix WinNonlin | Pharsight, Cary, NC | v. 6.3 | software for pharmacokinetic modeling |
| Avastin (bevacizumab) | Genentech |
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