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Medicine

अगर सही जीन मुंह बंद: संभावित कैंसर चिकित्सीय एजेंटों के लिए एक Heptamer-प्रकार के छोटे गाइड आरएनए लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग

doi: 10.3791/53879 Published: June 2, 2016
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम रक्त कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय दवाओं के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

अगर सही जीन मुंह बंद करने के बाद (टीआर Nase जेड एल करार दिया - यू tilizing fficacious जीन मुंह बंद) आरएनए का निर्देशन जीन प्रौद्योगिकियों मुंह बंद है, जो एक कृत्रिम छोटे गाइड आरएनए (sgRNA) का इस्तेमाल tRNA 3 'प्रसंस्करण endoribonuclease, tRNase जेड एल मार्गदर्शन में से एक है , एक लक्ष्य शाही सेना पहचान करने के लिए। sgRNAs किसी भी अभिकर्मक अभिकर्मकों बिना कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है और अपने लक्ष्य आरएनए स्तरों downregulate और / या मानव कैंसर कोशिकाओं में apoptosis प्रेरित कर सकते हैं। हम मानव मायलोमा और ल्यूकेमिया कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर प्रभाव के लिए 156 heptamer प्रकार sgRNAs युक्त एक sgRNA पुस्तकालय की जांच की, और पाया कि उनमें से 20 कुशलता से कैंसर कोशिका लाइनों के कम से कम एक में apoptosis प्रेरित कर सकते है। यहाँ हम रक्त कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय दवाओं के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल कैसे sgRNA पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए, कैसे सेल व्यवहार्यता, और प्रत्येक पर sgRNA के प्रभाव का आकलन कैसे फू करने के लिए शामिलrther प्रवाह cytometry द्वारा प्रभावी sgRNAs का मूल्यांकन। 2,000 के आसपास हिट पूर्ण पैमाने पर sgRNA 16,384 heptamers से बना पुस्तकालय स्क्रीनिंग द्वारा प्राप्त किया जा करने की उम्मीद होगी।

Introduction

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अगर सही जीन मुंह बंद करने के बाद (टीआर Nase जेड एल करार दिया - यू tilizing fficacious जीन मुंह बंद) आरएनए का निर्देशन जीन मुंह बंद प्रौद्योगिकियों 1 में से एक है। इस तकनीक विकसित की tRNase जेड एल (या 3 'tRNase), tRNA 3' प्रसंस्करण endoribonuclease के गुणों के आधार पर किया गया है: यह एक पहचानने से एक कृत्रिम छोटे गाइड आरएनए (sgRNA) की दिशा के तहत किसी भी उम्मीद साइट पर किसी भी लक्ष्य शाही सेना काटना कर सकते हैं 9 - लक्ष्य शाही सेना और sgRNA 2 के बीच का गठन पूर्व tRNA की तरह या सूक्ष्म पूर्व tRNA की तरह संरचना। sgRNA, जो आमतौर पर 7-31 NT लंबाई में है, चार समूहों, 5'-आधा tRNA, heptamer आरएनए, 14-NT रेखीय शाही सेना, और हुक आरएनए में वर्गीकृत किया जाता है।

15 - हम कोशिकाओं 10 में रहने वाले विभिन्न कृत्रिम रूप से डिजाइन sgRNAs शुरू से सच जीन मुंह बंद करने की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है। हम यह भी पता चला है कि sgRNAs कोशिकाओं वाई द्वारा लिया जा सकता हैकिसी भी अभिकर्मक अभिकर्मकों thout और उनके लक्ष्य शाही सेना के स्तर को downregulate और / या मानव कैंसर की कोशिकाओं को 16 में apoptosis प्रेरित कर सकते हैं - 18। 21 - सही जीन मुंह बंद intracellular और tRNase जेड एल और प्राकृतिक sgRNAs 19 के माध्यम से कहनेवाला जीन विनियामक नेटवर्क सिस्टम पर काम करने के लिए प्रकट होता है।

हम रक्त कैंसर के लिए 22 संभावित चिकित्सीय heptamer प्रकार sgRNAs के लिए खोज करने के लिए 156 heptamer प्रकार sgRNAs युक्त एक sgRNA पुस्तकालय का निर्माण किया है। हम मानव मायलोमा और ल्यूकेमिया कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर प्रभाव के लिए यह जांच की, और पाया कि उनमें से 20 कुशलता से कैंसर कोशिका लाइनों के कम से कम एक में apoptosis प्रेरित कर सकते है। और उनमें से 4 माउस जेनोग्राफ्ट प्रयोगों में ट्यूमर के विकास दरों को कम करने के लिए दिखाया गया है।

यहाँ हम रक्त कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय दवाओं के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल कैसे शामिलsgRNA पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए, कैसे सेल व्यवहार्यता, और कैसे आगे प्रवाह cytometry द्वारा प्रभावी sgRNAs का मूल्यांकन करने पर प्रत्येक sgRNA के प्रभाव का आकलन करने के लिए। हालांकि इन इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं माउस जेनोग्राफ्ट मॉडल में sgRNA के सेलुलर लक्ष्य RNAs के लिए विश्लेषण और प्रभावी sgRNAs के मूल्यांकन, पारंपरिक तरीकों 17,22 के अनुसार किया जा सकता है।

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Protocol

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1. एक Heptamer प्रकार के निर्माण sgRNA लाइब्रेरी

  1. 16,384 (4 से 7) 7-NT दृश्यों का एक उपसमूह चुनने जब ​​तक पूर्ण पैमाने पर पुस्तकालय का निर्माण किया जा रहा है।
    नोट: दृश्यों यादृच्छिक और / या विशिष्ट सेलुलर RNAs को निशाना बनाया जा सकता है। बाद के लिए, एक उपयुक्त कंप्यूटर प्रोग्राम और / या नेत्रहीन, और कुछ चुनिंदा दृश्यों 7-NT दृश्यों बाल के लिये कांटा संरचनाओं 4,10 के तुरंत नीचे की ओर करने के लिए पूरक की सहायता के साथ एक लक्ष्य शाही सेना में tRNA के टी-हाथ जैसी बाल के लिये कांटा संरचनाओं मिल जाए, 17,18।
  2. के रूप में चयनित heptamers के प्रत्येक synthesize एक पूरी तरह से 2'- हे -methylated, 5'- और एक डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र के साथ 3'-फॉस्फोरिलेटेड आरएनए। नियंत्रित ताकना ग्लास (सीपीजी) के समर्थन पर phosphoramidite विधि का प्रयोग करें, और 5'-टर्मिनल 4,4'-dimethoxytrityl (डीएमटी) संश्लेषण के अंतिम चक्र में पर समूह की रक्षा (5 'फॉस्फेट के अलावा) को छोड़ 23।
    नोट: कस्टम एसवाईnthetic आरएनए भी oligonucleotide आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया जा सकता है।
  3. पिछले संश्लेषण चक्र के पूरा होने के बाद, सीपीजी एक Teflon लाइनर पेंच टोपी के साथ एक कांच की शीशी के लिए स्तंभ संश्लेषित oligonucleotide के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर करने के लिए 8 घंटे के लिए स्थानांतरण 1 29 मिलीलीटर% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड जोड़ने के लिए, और सेते यह सीपीजी से oligonucleotide फोड़ना और कुर्सियां ​​और फॉस्फेट से रक्षा समूहों को हटा दें।
  4. 40 डिग्री सेल्सियस पर एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण के साथ अमोनियम हाइड्रॉक्साइड लुप्त हो जाना और 0.1 एम एन hexylammonium के 0.2 मिलीलीटर एसीटेट में oligonucleotide फिर से भंग।
  5. एक बफर 10-50% acetonitrile / 0.1 एम एन hexylammonium एसीटेट युक्त के साथ एक polystyrene-divinylbenzene स्तंभ का उपयोग रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से सिंथेटिक oligonucleotide शुद्ध। स्तंभ 2.0 मिलीलीटर में 80 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए मिनट भागो /।
  6. एक 20% एसिटिक एसिड समाधान बनाने के लिए fractionated नमूना (1-2 एमएल) के लिए केंद्रित एसिटिक एसिड के 0.25-0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और incubaते कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इस समाधान डीएमटी समूह हटा दें।
  7. 40 डिग्री सेल्सियस पर एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण के साथ नमूना सूखी, 1 29 मिलीलीटर% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड में यह फिर से भंग, और 5 'फॉस्फेट के पक्ष श्रृंखला को दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए समाधान सेते हैं।
  8. 40 डिग्री सेल्सियस पर एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण के साथ के बारे में 0.3 मिलीलीटर नमूने की मात्रा (1 मिलीलीटर) को कम करें।
  9. आसुत जल के खिलाफ पूरे केंद्रित नमूना (500 मिलीलीटर) कट ऑफ 1,000 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आणविक वजन का एक डायलिसिस ट्यूब का उपयोग Dialyze।
  10. एक विंदुक के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को डायलिसिस ट्यूब से dialyzed नमूना हस्तांतरण, 40 डिग्री सेल्सियस पर एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण के साथ सूखी, और बाद में यह पानी के लिए इंजेक्शन ग्रेड पानी में फिर से भंग है, जो की मात्रा चाहिए बहुत छोटे से एक 100 से अधिक माइक्रोन के समाधान बनाने के लिए किया जाना है।
  11. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 260 एनएम पर शाही सेना के नमूने की एक ऑप्टिकल घनत्व को मापने और 100 के लिए अपनी एकाग्रता को समायोजितपानी के लिए इंजेक्शन ग्रेड पानी जोड़कर माइक्रोन। -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करने से पहले कम से नीचे शाही सेना के समाधान स्टोर।

सेल व्यवहार्यता के लिए sgRNA लाइब्रेरी के 2. स्क्रीनिंग

  1. तैयार 10 3 कोशिकाओं / 99 μl / अच्छी तरह से (जैसे, HL60 और RPMI-8226) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक RPMI 1640 मीडिया में एक 96 अच्छी तरह से थाली पर। केवल पृष्ठभूमि घटाव के लिए मीडिया वाले कुओं तैयार करें। बढ़त के प्रभाव को खत्म करने के लिए, नमूना कुओं के आसपास के कुओं खाली करने के लिए बाँझ पानी जोड़ें।
  2. heptamer प्रकार sgRNA (100 माइक्रोन) के प्रत्येक अच्छी तरह से पानी के लिए इंजेक्शन ग्रेड पानी में भंग की 1 μl जोड़ें। तीन प्रतियों में प्रत्येक sgRNA परख। 3 दिनों के लिए एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध WST-8 समाधान का एक उचित मात्रा में जोड़ें। 1 से 4 घंटे के लिए ही इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  4. उपाय absorbance के एकएक microplate पाठक के साथ 450 एनएम टी।
    नोट: ज्यादातर मामलों में, absorbance और व्यवहार्य सेल नंबर के बीच linearity जब तक absorbance मूल्य 1.0 से अधिक बनाए रखा जाना प्रतीत होता है।

से फ्लो द्वारा प्रभावी sgRNAs 3. मूल्यांकन

  1. तैयार 10 3 कोशिकाओं / 99 μl / अच्छी तरह से (जैसे, HL60) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक RPMI 1640 मीडिया में एक 96 अच्छी तरह से थाली पर। के लिए एक sgRNA परीक्षण किया जा करने के लिए कम से कम 10 कुओं तैयार करें। बढ़त के प्रभाव को खत्म करने के लिए, नमूना कुओं के आसपास के कुओं खाली करने के लिए बाँझ पानी जोड़ें।
  2. heptamer प्रकार sgRNA (100 माइक्रोन) के प्रत्येक अच्छी तरह से पानी के लिए इंजेक्शन ग्रेड पानी में भंग की 1 μl जोड़ें। 3 दिनों के लिए एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  3. कोशिकाओं को एक विंदुक के साथ एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में कम से कम 10 कुओं से ही sgRNA के साथ इलाज लीजिए। 30 पर एक अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन0 XG, और मीडिया त्यागें।
  4. ट्यूब के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 300 XG पर एक अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए ट्यूब, स्पिन और पीबीएस त्यागें। ट्यूब के लिए 1x Annexin वी बाध्यकारी बफर के 150 μl जोड़ें, और कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  5. , Phycoerythrin के 2 μl (पीई) संयुग्मित Annexin वी समाधान और ट्यूब के लिए 7-Aminoactinomycin (7AAD) समाधान के 1 μl जोड़ने के लिए उन्हें अच्छी तरह मिक्स, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं। नमूना 24 कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग का विश्लेषण।

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Representative Results

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छह heptamer प्रकार sgRNAs 5'-AUCUUCA -3 '(H1885), 5'-ACACACA -3' (H3277), 5'-GGGGGCG -3 '(H10927), 5'-GGGGCCC -3' (H10944), 5'-GCCCCCG -3 '(H12287), और 5'-CACCAGC -3' (H13260) रासायनिक 2'- हे -methyl आरएनए 5'- और 3'-फॉस्फेट युक्त के रूप में संश्लेषित कर रहे थे।

ये sgRNAs एक मानव ल्यूकेमिया सेल लाइन, HL60, और एक मानव मायलोमा सेल लाइन, RPMI-8226 की व्यवहार्यता पर प्रभाव के लिए जांच की गई। सेल व्यवहार्यता assays के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1 में दिखाया जाता है। चार sgRNAs H1885, H3277, H10927, और H13260 बहुत प्रभावी रहे थे और> 80% और> 70%, क्रमशः द्वारा HL60 और RPMI-8226 कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो। heptamers H3277 और H10927 भी गैर कैंसर HEK293 सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया, और शायद ही Affe दिखाया गया हैसीटी सेल 22 व्यवहार्यता।

Annexin वी और 7AAD डबल धुंधला के साथ प्रवाह cytometry HL60 कोशिकाओं heptamer H1885, H3277, H10927, या H13260 के साथ इलाज के लिए प्रदर्शन किया था। प्रत्येक sgRNA में, जल्दी और देर apoptotic चरणों में कुल सेल नंबर (56-95%) नकली (चित्रा 2) की तुलना में है कि (4-6%) काफी ज्यादा था। इन टिप्पणियों का सुझाव है कि HL60 सेल व्यवहार्यता की कमी apoptosis के कारण है।

आकृति 1
चित्रा 1. सेल व्यवहार्यता assays। सेल व्यवहार्यता HL60 कोशिकाओं (ए) या ​​RPMI-8226 कोशिकाओं (बी) के अभाव या नग्न heptamer प्रकार sgRNA H1885 के 1 माइक्रोन, H3277, H10927 की उपस्थिति में सुसंस्कृत थे के बाद 72 घंटा मापा गया था, H10944, H12287, या H13260। sgRNAs के अभाव में रिश्तेदार जीवित कोशिका संख्या 100 त्रुटि को समायोजित कर रहे हैंसलाखों से संकेत मिलता है एसडी (एन = 3)। *, पी <0.002। लेकिमिया अनुसंधान, वॉल्यूम से पुनर्प्रकाशित। 38, ताकाहाशी एम एट अल।, Hematological कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय एजेंट, पीपी 808-815, अंजीर के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की स्क्रीनिंग। 1, कॉपीराइट (2014), Elsevier से अनुमति के साथ। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रवाह cytometry। HL60 कोशिकाओं के लिए सम्मान के साथ, प्रवाह cytometry Annexin वी और 7AAD डबल धुंधला के साथ प्रदर्शन किया गया था। कोशिकाओं अभाव या नग्न heptamer प्रकार sgRNA H1885 (ए), H3277 (ए), H13260 (ए), या H10927 (बी) के 1 माइक्रोन की उपस्थिति में सुसंस्कृत होने के बाद 72 घंटा विश्लेषण किया गया। लेकिमिया अनुसंधान, वॉल्यूम से पुनर्प्रकाशित। 38, ताकाहाशी एम एट अल।, Hematological कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय एजेंट, पीपी 808-815, अंजीर के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की स्क्रीनिंग। 2, कॉपीराइट (2014), Elsevier से अनुमति के साथ। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Acknowledgments

इस काम के लक्ष्य पर ही आधारित अनुसंधान एवं विकास, जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी, जापान के निजी स्कूलों के लिए संवर्धन और आपसी सहायता निगम से साइंस रिसर्च प्रमोशन कोष के माध्यम से अनुकूलनीय और निर्बाध प्रौद्योगिकी हस्तांतरण कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया था, और JSPS KAKENHI अनुदान नंबर 24300342 और 15H04313 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom heptamer RNA Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge Transgenomic 99-3860
Water-for-injection-grade Water Otsuka Pharmaceutical  7131400A2129
RPMI-1640 medium Wako 189-02025
Fetal Bovine Serum SIGMA-ALDRICH 172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai Tesque 26253-84
96 Well Plate Greiner Bio-one 655 180
Cell Counting Kit-8 DOJINDO 343-07623 WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R TEKAN 510-82851
FACS Round-Bottom Tube BD Falcon 60819-820
Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 51-66121E
PE Annexin V BD Biosciences 51-65875X
7AAD SIGMA-ALDRICH A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur BD Biosciences 342973

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References

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Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).More

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).

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