Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

يصح جين إسكات: عرض لHeptamer من نوع RNA دليل مكتبة صغيرة للسرطان العلاجية وكلاء المحتملة

doi: 10.3791/53879 Published: June 2, 2016
* These authors contributed equally

Summary

هنا نقدم بروتوكول للكشف عن مكتبة sgRNA heptamer من نوع العقاقير العلاجية المحتملة ضد سرطان الدم.

Abstract

إسكات الجينات الحقيقي (وهو ما يسمى بعد TR Nase Z L - ش tilizing ه إسكات الجينات fficacious) هي واحدة من الجين الموجه RNA إسكات تكنولوجيات، والتي تستخدم على دليل صغير الاصطناعي RNA (sgRNA) لتوجيه الحمض الريبي النووي النقال 3 'endoribonuclease المعالجة، tRNase Z L ، إلى التعرف على الحمض النووي الريبي الهدف. sgRNAs يمكن تناولها عن طريق الخلايا دون أي الكواشف ترنسفكأيشن ويمكن downregulate مستويات الحمض النووي الريبي الهدف و / أو تحفز الخلايا في الخلايا السرطانية البشرية. قمنا بترتيب مكتبة sgRNA تحتوي على 156 sgRNAs heptamer من نوع للتأثير على قابلية الورم النخاعي وسرطان الدم خلايا الإنسان، ووجد أن 20 منهم يمكن أن تحفز كفاءة الخلايا في واحد على الأقل من خطوط الخلايا السرطانية. هنا نقدم بروتوكول للكشف عن مكتبة sgRNA heptamer من نوع العقاقير العلاجية المحتملة ضد سرطان الدم. ويتضمن البروتوكول كيفية بناء المكتبة sgRNA، وكيفية تقييم تأثير كل sgRNA على بقاء الخلية، وكيفية فوrther تقييم sgRNAs فعالية عن طريق التدفق الخلوي. ومن المتوقع أن يتم الحصول عليها عن طريق فحص مكتبة sgRNA على نطاق واسع يتألف من 16،384 heptamers حوالي 2،000 الزيارات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إسكات الجينات الحقيقي (وهو ما يسمى بعد TR Nase Z L - ش tilizing ه إسكات الجينات fficacious) هي واحدة من التقنيات إسكات الجينات الموجهة RNA 1. تم عرض هذه التكنولوجيا المتقدمة على أساس خصائص tRNase Z L (أو 3 'tRNase)، الحمض الريبي النووي النقال 3' endoribonuclease المعالجة: يمكن أن يلتصق أي RNA الهدف في أي موقع من المتوقع تحت إشراف دليل الحمض النووي الريبي الصغيرة الاصطناعي (sgRNA) من خلال الاعتراف قبل الحمض الريبي النووي النقال مثل أو الجزئي قبل الحمض الريبي النووي النقال مثل هيكل تشكلت بين الحمض النووي الريبي الهدف وsgRNA 2-9. sgRNA، التي عادة ما تكون 7-31 الإقليم الشمالي في طول، يتم تصنيفها إلى أربع مجموعات، 5'-نصف الحمض الريبي النووي النقال، RNA heptamer، 14-الإقليم الشمالي الخطية RNA، والجيش الملكي النيبالي هوك.

لقد أثبتت فعالية إسكات الجينات الحقيقي من خلال تقديم مختلف sgRNAs مصممة بشكل مصطنع في الخلايا الحية 10-15. لقد أظهرنا أيضا أن sgRNAs يمكن تناولها من قبل خلايا وايthout أي الكواشف ترنسفكأيشن ويمكن downregulate مستويات الحمض النووي الريبي الهدف و / أو حث موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية البشرية 16-18. يبدو إسكات الجينات الحقيقي للعمل على داخل والجينات بين الخلايا نظام الشبكة التنظيمية عبر tRNase Z L وsgRNAs الطبيعية 19-21.

لقد شيدت مكتبة sgRNA تحتوي على 156 sgRNAs heptamer من نوع للبحث عن إمكانية sgRNAs heptamer من نوع العلاجية لسرطان الدم 22. لقد عرض الفيلم للتأثير على قابلية الورم النخاعي وسرطان الدم خلايا الإنسان، ووجد أن 20 منهم يمكن أن تحفز كفاءة الخلايا في واحد على الأقل من خطوط الخلايا السرطانية. وثبت 4 منهم للحد من معدلات نمو الورم في التجارب الماوس طعم أجنبي.

هنا نقدم بروتوكول للكشف عن مكتبة sgRNA heptamer من نوع العقاقير العلاجية المحتملة ضد سرطان الدم. ويتضمن البروتوكول كيفلبناء مكتبة sgRNA، وكيفية تقييم تأثير كل sgRNA على بقاء الخلية، وكيفية مواصلة تقييم sgRNAs فعالية عن طريق التدفق الخلوي. تحليل لالرنا الهدف الخلوية sgRNA وتقييم sgRNAs فعالية في نماذج طعم أجنبي الماوس يمكن أن يؤديها وفقا للأساليب التقليدية 17،22، على الرغم من أن هذه ليست مدرجة في هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. بناء على Heptamer من نوع مكتبة sgRNA

  1. تحديد مجموعة فرعية من 16384 (4 7) تسلسل 7 الإقليم الشمالي إلا إذا هي مكتبة واسعة النطاق التي يتم بناؤها.
    ملاحظة: تسلسل يمكن أن تكون عشوائية و / أو مصممة لاستهداف الرنا الخلوية محددة. لهذا الأخير، والعثور على هياكل دبوس الشعر يشبه T-ذراع الحمض الريبي النووي النقال في الحمض النووي الريبي الهدف بمساعدة من برنامج مناسب كمبيوتر و / أو بصريا، واختر تسلسل مكملة لتسلسل 7 الإقليم الشمالي المصب على الفور من الهياكل دبوس (4،10)، 17،18.
  2. تجميع كل من heptamers اختير ليكون تماما 2'- يا -methylated، 5'- وRNA 3'-فسفرته مع المزج DNA / RNA. استخدام الأسلوب phosphoramidite على الزجاج التي تسيطر عليها المسام (الدليل السياسي الشامل) الدعم، وترك 5'-محطة 4،4'-dimethoxytrityl (DMT) حماية المجموعة على في الدورة الأخيرة (إضافة الفوسفات 5 ') من التوليف 23.
    ملاحظة: سي مخصصويمكن الحصول على nthetic RNA أيضا من موردين النوكليوتيد.
  3. بعد الانتهاء من دورة تركيب الماضية، ونقل CPG مع قليل النوكليوتيد توليفها من العمود إلى قارورة زجاجية مع غطاء المسمار تفلون الخطوط الملاحية المنتظمة، إضافة هيدروكسيد الأمونيوم 1 مل من 29٪، واحتضان ذلك في 55 درجة مئوية لمدة 8 ساعات ل يلتصق النوكليوتيد من الحكومة الشعبية المركزية وإزالة مجموعة حماية من القواعد والفوسفات.
  4. تتبخر هيدروكسيد الأمونيوم مع المبخر الطرد المركزي عند 40 درجة مئوية، وإعادة بحل-قليل النوكليوتيد في 0.2 مل من 0.1 م ن hexylammonium خلات.
  5. تنقية النوكليوتيد الاصطناعية من خلال العكسية مرحلة عالية الأداء اللوني السائل باستخدام عمود البوليسترين-divinylbenzene مع العازلة التي تحتوي على 10-50٪ الأسيتونتريل / 0.1 م ن hexylammonium خلات. تشغيل العمود في 2.0 مل / دقيقة لمدة 25 دقيقة في 80 درجة مئوية.
  6. إضافة 0.25-0.5 مل من حمض الخليك المركز على عينة مجزأة (1-2 مل) لجعل محلول حمض الخليك 20٪، وincubaالشركة المصرية للاتصالات هذا الحل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لإزالة مجموعة DMT.
  7. تجفيف عينة مع المبخر الطرد المركزي عند 40 درجة مئوية، وإعادة حل لتقنية المعلومات في هيدروكسيد الأمونيوم 1 مل من 29٪، واحتضان الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة سلسلة من الجانب الفوسفات 5 '.
  8. تقليل حجم (1 مل) من العينة إلى حوالي 0.3 مل مع المبخر الطرد المركزي عند 40 درجة مئوية.
  9. Dialyze العينة كلها تتركز ضد الماء المقطر (500 مل) باستخدام أنبوب غسيل الكلى من الوزن الجزيئي قطع 1000 في 4 درجات مئوية خلال الليل.
  10. نقل العينة مدال من الأنبوب غسيل الكلى إلى أنبوب 1.5 مل مع ماصة، جففه مع المبخر الطرد المركزي عند 40 درجة مئوية، وبعد ذلك إعادة تذوب في الماء المياه لحقن الصف، وحجم والتي ينبغي أن تكون صغيرة بما يكفي لجعل حل أكثر من 100 ميكرومتر.
  11. قياس الكثافة البصرية من عينة الحمض النووي الريبي في 260 نانومتر مع الطيف الضوئي وضبط تركيزها إلى 100ميكرومتر وذلك بإضافة الماء المياه لحقن الصف. تخزين حل الحمض النووي الريبي في أقل من -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.

2. فحص مكتبة sgRNA لبقاء الخلية

  1. إعداد 10 3 خلايا / 99 ميكرولتر / جيد (على سبيل المثال، HL60 وRPMI-8226) على طبق 96-جيدا في وسائل الإعلام RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ حل البنسلين ستربتومايسين. إعداد الآبار التي تحتوي على وسائل الإعلام فقط عن خلفية الطرح. للقضاء على آثار الحافة، إضافة الماء المعقم لإفراغ الآبار المحيطة الآبار العينة.
  2. إضافة 1 ميكرولتر من heptamer من نوع sgRNA (100 ميكرومتر) الذائب في الماء إلى لحقن الصف إلى كل بئر. مقايسة كل sgRNA في ثلاث نسخ. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لمدة 3 أيام.
  3. إضافة حجم مناسب من الحلول المتاحة تجاريا إلى كل بئر WST-8. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في نفس الحاضنة لمدة 1-4 ساعة.
  4. قياس الامتصاصية لر 450 نانومتر مع قارئ صفيحة.
    ملاحظة: في معظم الحالات، تظهر الخطي بين الامتصاصية وعدد الخلايا قابلة للحياة أن تستمر إلا إذا زادت قيمة الامتصاصية 1.0.

3. تقييم sgRNAs الفعالة من قبل التدفق الخلوي

  1. إعداد 10 3 خلايا / 99 ميكرولتر / جيد (على سبيل المثال، HL60) على طبق 96-جيدا في وسائل الإعلام RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ حل البنسلين ستربتومايسين. إعداد لا يقل عن 10 بئرا لsgRNA واحد لفحصها. للقضاء على آثار الحافة، إضافة الماء المعقم لإفراغ الآبار المحيطة الآبار العينة.
  2. إضافة 1 ميكرولتر من heptamer من نوع sgRNA (100 ميكرومتر) الذائب في الماء إلى لحقن الصف إلى كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لمدة 3 أيام.
  3. جمع الخلايا المعالجة مع نفسه sgRNA من لا يقل عن 10 بئرا في أنبوب 5 مل مع ماصة. تدور الأنبوب لمدة 5 دقائق في جهاز للطرد المركزي في 300 x ج، وتجاهل وسائل الإعلام.
  4. إضافة 2 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى أنبوب، وإعادة تعليق الخلايا. تدور الأنبوب لمدة 5 دقائق في جهاز للطرد المركزي في 300 x ج، وتجاهل برنامج تلفزيوني. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة ملزمة 1X annexin الخامس للأنبوب، وإعادة تعليق الخلايا.
  5. إضافة 2 ميكرولتر من فيكوإيريترين (PE) -conjugated annexin الخامس حل و1 ميكرولتر من 7 aminoactinomycin D (7AAD) حل للأنبوب، مزجها جيدا، واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تحليل العينة باستخدام قياس التدفق الخلوي 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الست من نوع heptamer sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 "(H1885)، 5'-ACACACA-3" (H3277)، 5'-GGGGGCG-3 "(H10927)، 5'-GGGGCCC-3" (H10944)، تم توليفها 5'-GCCCCCG-3 "(H12287)، و5'-CACCAGC-3" (H13260) كيميائيا كما 2'- يا -methyl RNA يحتوي على 5'- و3'-الفوسفات.

تم فحص هذه sgRNAs عن الآثار المترتبة على بقاء خط البشري خلية سرطان الدم، HL60، وخط خلايا المايلوما البشري، RPMI-8226. وتظهر نتائج ممثلة من المقايسات بقاء الخلية في الشكل 1، وأربعة sgRNAs H1885، H3277، H10927، وH13260 كانت فعالة جدا وتخفيض قابلية HL60 والخلايا RPMI-8226 بواسطة> 80٪ و> 70٪، على التوالي. تم اختبار heptamers H3277 وH10927 أيضا عن الآثار على غير سرطانية خلية الجدوى HEK293، وقد تبين أن من الصعب affeط م الخلية جدوى (22).

تم تنفيذ التدفق الخلوي مع annexin الخامس و7AAD تلطيخ مزدوج لHL60 الخلايا تعامل مع heptamer H1885، H3277، H10927، أو H13260. في كل sgRNA، كان عدد الخلايا الإجمالي (56-95٪) في مراحل أفكارك المبكرة والمتأخرة أعلى من ذلك بكثير (4-6٪) في وهمي (الشكل 2). وتشير هذه الملاحظات أن الحد من خلية الجدوى HL60 ومن المقرر أن موت الخلايا المبرمج.

شكل 1
الشكل 1. فحوصات بقاء الخلية. وقد تم قياس بقاء الخلية بعد 72 ساعة HL60 الخلايا (أ) أو الخلايا RPMI-8226 (ب) كان المثقف في وجود أو غياب من 1 ميكرومتر من عار heptamer من نوع sgRNA H1885، H3277، H10927، H10944، H12287، أو H13260. يتم تعديل أرقام الخلية الحية النسبية في غياب sgRNAs إلى 100. خطأالحانات وتشير SD (ن = 3). *، P <0.002. طبع من اللوكيميا بحوث، المجلد. 38، تاكاهاشي محمد وآخرون، فحص مكتبة sgRNA heptamer من نوع لوكلاء العلاجية المحتملة ضد الأورام الخبيثة الدموية، ص 808-815، الشكل. 1، حقوق الطبع والنشر (2014)، بإذن من السيفير. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تدفق الخلوي. وفيما يتعلق خلايا HL60، التدفق الخلوي أجريت مع annexin الخامس و7AAD تلطيخ مزدوجة. وقد تم تحليل الخلايا بعد 72 ساعة المثقف في وجود أو غياب من 1 ميكرومتر من عار heptamer من نوع sgRNA H1885 (A)، H3277 (A)، H13260 (A)، أو H10927 (B). طبع من اللوكيميا بحوث، المجلد. 38، تاكاهاشي محمد وآخرون، فحص مكتبة sgRNA heptamer من نوع لوكلاء العلاجية المحتملة ضد الأورام الخبيثة الدموية، ص 808-815، الشكل. 2، حقوق الطبع والنشر (2014)، بإذن من السيفير. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل برنامج نقل قابل للتكيف والتكنولوجيا سلس من خلال R & D، اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة، وصندوق دعم البحث العلمي في العلوم من مؤسسة تشجيع والمساعدة المتبادلة للمدارس الخاصة من اليابان مدفوعة الهدف، وأرقام JSPS KAKENHI غرانت 24300342 و15H04313 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom heptamer RNA Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge Transgenomic 99-3860
Water-for-injection-grade Water Otsuka Pharmaceutical  7131400A2129
RPMI-1640 medium Wako 189-02025
Fetal Bovine Serum SIGMA-ALDRICH 172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai Tesque 26253-84
96 Well Plate Greiner Bio-one 655 180
Cell Counting Kit-8 DOJINDO 343-07623 WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R TEKAN 510-82851
FACS Round-Bottom Tube BD Falcon 60819-820
Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 51-66121E
PE Annexin V BD Biosciences 51-65875X
7AAD SIGMA-ALDRICH A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur BD Biosciences 342973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. Caister Academic Press. 201-226 (2008).
  2. Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
  3. Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
  4. Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
  5. Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
  6. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
  7. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
  8. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
  9. Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
  10. Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
  11. Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
  12. Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
  13. Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
  14. Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
  15. Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9, (114121), (2014).
  16. Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7, (38496), (2012).
  17. Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
  18. Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
  19. Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
  20. Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
  21. Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
  22. Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
  23. Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
  24. FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
  25. Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
يصح جين إسكات: عرض لHeptamer من نوع RNA دليل مكتبة صغيرة للسرطان العلاجية وكلاء المحتملة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).More

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter