Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

DOĞRU gen susturma: Potansiyel Kanser Tedavi Ajanlar için heptamer tipi Küçük Rehberi RNA Kütüphanesi Taranması

Published: June 2, 2016 doi: 10.3791/53879
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Research Institute for Healthy Living, Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Burada kan kanserlerine karşı potansiyel terapötik ilaçların bir heptamer tipi sgRNA kitaplığının taranması için bir protokol mevcut.

Abstract

DOĞRU gen susturma (tR Nase Z L sonra adlandırılan - u, e fficacious gen susturulması tilizing) tRNA 3 'işleme endoribonuclease, tRNase Z L rehberlik edecek bir yapay küçük bir rehber RNA (sgRNA) kullanır teknolojileri susturma RNA yönettiği genin, biri bir hedef RNA tanımak için. sgRNAlardır bir transfeksiyon reaktifleri olmayan hücreler tarafından alınabilir ve hedef RNA seviyelerini bozulduğunu ve / veya insan kanser hücrelerinde apoptosisi teşvik edebilir. İnsan miyeloma ve lösemi hücrelerinin canlılığı üzerindeki etki için 156 heptamer tipi sgRNAlardır ihtiva eden bir sgRNA kitaplığı tarandı ve bunların 20 verimli, kanser hücre çizgilerinin en az biri apoptosis bulmuşlardır. Burada kan kanserlerine karşı potansiyel terapötik ilaçların bir heptamer tipi sgRNA kitaplığının taranması için bir protokol mevcut. protokol hücre canlılığı ve her sgRNA etkisini değerlendirmek nasıl fu için nasıl, sgRNA kütüphane oluşturmak için nasıl dahilrther flow sitometri ile etkili sgRNAlardır değerlendirir. Yaklaşık 2000 hit 16.384 heptamerlerin oluşan tam ölçekli sgRNA kütüphanenin taranması ile elde edilebilir olması beklenmektedir.

Introduction

(TR Nase Z L sonra adlandırılan - u E fficacious gen susmasının tilizing) DOĞRU gen susturma RNA yönelik gen susturma teknolojileri 1 biridir. Bu teknoloji geliştirdi tRNase Z L (ya da 3 'tRNase), tRNA 3' işleme endoribonuclease özelliklerine dayanarak olmuştur: Bir tanıyarak yapay küçük bir rehber RNA (sgRNA) yönetimindeki herhangi beklenen yerinde herhangi bir hedef RNA yarabilir 9 - hedef RNA ve sgRNA 2 arasında oluşturulmuş önceden tRNA benzeri ya da mikro-ön-tRNA-benzeri bir yapı. uzunluğunda nt genellikle 7-31 olan sgRNA, dört gruba, 5'-yarım-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineer RNA ve kanca RNA kategorize edilir.

15 - Biz hücreler 10 canlı içine çeşitli yapay olarak tasarlanmış sgRNAlardır sunarak DOĞRU gen susturma etkinliğini göstermiştir. Biz de sgRNAlardır hücrelerin wi tarafından alınabilir göstermiştirherhangi bir transfeksiyon reaktifleri thout ve hedef RNA seviyelerini bozulduğunu ve / veya insan kanser hücrelerinin 16 apoptosis doğurabileceği - 18. 21 - DOĞRU gen susturma tRNase Z L ve doğal sgRNAlardır 19 üzerinden hücre içi ve hücreler arası gen düzenleyici ağ sistemi üzerinde çalışması için görünür.

Kan kanserleri 22 potansiyel terapötik heptamer tipi sgRNAlardır aramak için 156 heptamer tipi sgRNAlardır içeren bir sgRNA kütüphane inşa ettik. İnsan miyeloma ve lösemi hücrelerinin ömrü üzerindeki etkisi için filtrelenmiş ve 20 tanesi etkin kanser hücre çizgilerinin en az biri apoptosis bulmuşlardır. Ve bunların 4 fare ksenogreft deneylerinde tümör büyüme oranlarını azaltmak için gösterilmiştir.

Burada kan kanserlerine karşı potansiyel terapötik ilaçların bir heptamer tipi sgRNA kitaplığının taranması için bir protokol mevcut. protokol nasıl dahilhücre canlılığı ve nasıl daha fazla flow sitometri ile etkili sgRNAlardır değerlendirmek için her sgRNA etkisini değerlendirmek için nasıl sgRNA kütüphanesini oluşturmak için. Bunlar, bu protokolde yer almaz, ancak fare ksenogreft modellerinde sgRNA hücresel hedef RNAlar için analiz ve etkili sgRNAlardır değerlendirilmesi, geleneksel yöntemlerle 17,22 göre gerçekleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bir heptamer tipi 1. İnşaat sgRNA Kütüphanesi

  1. Tam ölçekli bir kütüphane inşa edilecek sürece 16.384 (4 7) 7-nt dizilerinin bir alt kümesini seçin.
    Not: dizileri rasgele ve / veya belirli bir hücre RNA'lar hedeflemek için tasarlanmış olabilir. İkincisi, saç tokası yapıları 4,10 hemen alt baş 7-nt dizilere tamamlayıcı uygun bir bilgisayar programı ve / veya görsel olarak basıp dizilerin yardımı ile, bir hedef RNA tRNA T kolunu benzer saç tokası yapıları bulmak 17,18.
  2. Seçilen heptamerlerin her sentezleme tam 2'- O metillenmiş, 5'- ve bir DNA / RNA sentezleyici ile 3'-fosforile edilmiş RNA. Kontrollü gözenekli cam (CPG) Zemin üzerinde fosforamidit yöntemini kullanarak, ve 5'-terminal 4,4'-dimetoksitritil (DMT) sentezin son döngüde (5 'fosfat ilave) koruma grubu terk 23.
    NOT: Özel synthetic RNA da oligonükleotid tedarikçilerden elde edilebilir.
  3. Son sentez döngüsünün tamamlanmasından sonra, 8 saat boyunca 55 ° C 'de, 1 ml 29%' si amonyum hidroksit ekleyin Teflon astar vidalı kapaklı bir cam şişeye sütun sentezlenen oligonükleotid ile CPG transferi ve inkübe CPG, oligonükleotidin ayrılması ve bazlar ve fosfatlar koruma gruplarını kaldırmak.
  4. 40 ° C 'de santrifüj lü bir evaporatörde amonyum hidroksit buharlaştınn ve 0.2 ml 0.1 M n-hexylammonium asetat içinde oligonükleotid yeniden çözülür.
  5. % 10-50 asetonitril / 0.1 M n-hexylammonium asetat ihtiva eden bir tampon maddesi ile bir polistiren-divinilbenzen kolonu kullanılarak ters-faz yüksek performans sıvı kromatografi yoluyla sentetik oligonükleotit saflaştınlır. 80 ° C de 25 dakika süreyle / 2.0 ml dk sütun çalıştırın.
  6. % 20 asetik asit solüsyonu yapmak için kısımlara ayrılmış örnek (1-2 mi) konsantre asetik asit 0.25-0.5 ml ilave edilir, ve doğmuş iyileşmesinite oda sıcaklığında 1 saat boyunca bu çözelti, DMT grubu çıkarmak için.
  7. 40 ° C 'de santrifüj lü bir evaporatörde örnek kurutun, 1 mi 29% amonyak içinde yeniden çözülür ve 5' fosfat yan zincirini çıkarmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çözeltiden inkübe edin.
  8. 40 ° C 'de santrifüj lü bir evaporatörde 0.3 ml numune hacmi (1 mi) azaltır.
  9. kesme 1000, 4 ° C'de bir gece boyunca moleküler ağırlığa sahip bir diyaliz tüpü kullanılarak damıtılmış su karşı tüm konsantre edildi örneği (500 mi) diyaliz.
  10. Daha sonra, bir pipet ile 1.5 ml tüp diyaliz tüpünden diyaliz örnek aktarın 40 ° C 'de santrifüj lü bir evaporatörde kurutun ve hacmi arasında olmalıdır, su için enjeksiyon dereceli su içinde yeniden çözülür daha büyük bir 100 uM çözelti yapmak için yeteri kadar küçük olabilir.
  11. bir spektrofotometre ile 260 nm'de RNA numunesinin optik yoğunluğunun ölçülmesi ve 100 olan konsantrasyonunu ayarlamakSu için enjeksiyon dereceli su ilave edilerek uM. -20 ° C Kullanmadan önce aşağıda RNA çözümü saklayın.

Hücre Canlılığına için sgRNA Kütüphanesi 2. Eleme

  1. Hazırlama 10 3 hücre / 99 ul / göz (ör HL60 ve RPMI-8226),% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde bir 96-yuvalı tabak üzerinde. Sadece arka plan çıkarma için ortam içeren kuyu hazırlayın. numune kuyuları çevreleyen kuyu boş steril su ekleyin, kenar etkilerini ortadan kaldırmak için.
  2. her bir suda için enjeksiyon dereceli su içinde çözülmüş heptamer tipi sgRNA (100 uM) 1 ul ekle. üç kez, her sgRNA deneyi. 3 gün boyunca% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe plakası.
  3. Her bir oyuğa, bir ticari olarak temin edilebilir WST-8 çözeltisinin uygun bir hacmi ekleyin. 1 ila 4 saat boyunca, aynı inkübatörde 37 ° C'de inkübe plakası.
  4. absorbans a ölçünBir mikro levha okuyucusu ile 450 nm t.
    NOT: Bir çok durumda, emme ve canlı hücre sayısı arasındaki doğrusal absorbans değeri 1.0 aşmadıkça muhafaza gibi görünmektedir.

Akış Sitometrisi ile Etkili sgRNAlardır 3. Değerlendirilmesi

  1. Hazırlama 10 3 hücre /% 10 fetal bovin serumu ve% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde bir 96-yuvalı tabak üzerinde 99 ul / göz (ör HL60). bir sgRNA test edilecek en az 10 kuyu hazırlayın. numune kuyuları çevreleyen kuyu boş steril su ekleyin, kenar etkilerini ortadan kaldırmak için.
  2. her bir suda için enjeksiyon dereceli su içinde çözülmüş heptamer tipi sgRNA (100 uM) 1 ul ekle. 3 gün boyunca% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe plakası.
  3. bir pipet, bir 5-ml'lik bir tüp içine en az 10 kuyu aynı sgRNA ile muamele hücreleri toplamak. 30 ° C'de bir santrifüj içinde 5 dakika boyunca tüp spin0 xg ve medya atın.
  4. tüpe 1X fosfat tamponlu salin (PBS) 2 ml ilave edilir ve hücreler yeniden askıya. 300 x g'de santrifüj içinde 5 dakika boyunca tüp spin ve PBS atın. tüp 1x anneksin V bağlayıcı tampon 150 ul ekleyin ve hücrelerin yeniden askıya.
  5. , Fikoeritrin 2 ul (PE) ile konjüge edilmiş anneksin V çözeltisi ve tüp 7-aminoactinomycin D (7AAD) çözeltisi 1 ul ekle iyice karıştırın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tüp inkübe edin. 24 debi sitometresinde örnek analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Altı heptamer tipi sgRNAlardır 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), ve 5'-CACCAGC-3' (H13260) kimyasal 5'- ve 3'-fosfat ihtiva eden 2'-O-metil RNA sentez edildi.

Bu sgRNAlardır insan lösemi hücre hattı, HL60, ve bir insan miyeloma hücre hattı RPMI-8226 canlılığı üzerindeki etkileri incelendi. Hücre canlılığı deneylerinin Örnek neden olur. Şekil 1 'de dört sgRNAlardır H1885, H3277, H10927 gösterilir ve H13260 çok etkili ve sırası ile>% 80 ve>% 70 ile HL60 ve RPMI-8226 hücre canlılığı azaltılmış. heptamerlerin H3277 ve H10927 de kanserli olmayan HEK293 hücre canlılığı üzerindeki etkileri bakımından test edildi, ve neredeyse Affe gösterilmiştirct hücre 22 canlılığı.

Annexin V ve 7AAD çift boyama ile akış sitometrisi heptamer H1885, H3277, H10927 veya H13260 ile muamele HL60 hücreleri için gerçekleştirilmiştir. Her sgRNA, erken ve geç apoptotik aşamalarında toplam hücre sayısı (56-95%) sahte (Şekil 2) bu (% 4-6) daha yüksek oldu. Bu gözlemler, HL60 hücre canlılığının azaltılması apoptoza bağlı olduğuna işaret etmektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Hücre canlılığı ölçülür. Hücre canlılığı, HL60 hücrelerinde (A) veya RPMI-8226 hücreleri (B) yokluğunda ya da çıplak heptamer tipi sgRNA H1885 1 uM, H3277, H10927 mevcudiyetinde kültürlenmiştir 72 saat sonra ölçüldü H10944, H12287 veya H13260. sgRNAlardır yokluğunda göreceli canlı hücre sayıları 100 Hata ayarlanırçubuklar SD gösterir (n = 3). * P <0.002. Lösemi Araştırma, Vol yayımlanmaktadır. 38. Takahashi, M. ve diğ., Hematolojik maligniteler karşı potansiyel tedavi aktif maddeleri, s 808-815, Şek bir heptamer tipi sgRNA kütüphanesinin taranması. 1, Telif Hakkı (2014), Elsevier izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Akış sitometrisi. HL60 hücreleri ile ilgili olarak, akış sitometrisi Annexin V ve 7AAD çift boyama yapıldı. Hücreler yokluğunda ya da çıplak heptamer tipi sgRNA H1885 (A), H3277 (A) H13260 (A) ya da H10927 (B) 1 uM varlığında kültürlenen 72 saat sonra analiz edilmiştir. Lösemi Araştırma, Vol yayımlanmaktadır. 38, Takahashi, M. ve diğ., Hematolojik maligniteler karşı potansiyel tedavi aktif maddeleri, s 808-815, Şek bir heptamer tipi sgRNA kütüphanesinin taranması. 2, Telif Hakkı (2014), Elsevier izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma Hedef odaklı Ar-Ge, Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı, Japonya Özel Okullar Tanıtım ve Yardımlaşma Corporation Bilim Araştırma Teşvik Fonu aracılığıyla Uyarlanabilir ve Dikişsiz Teknoloji Transferi Programı tarafından desteklenen ve JSPS KAKENHI Hibe Numaraları 24300342 ve 15H04313 oldu .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom heptamer RNA Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge Transgenomic 99-3860
Water-for-injection-grade Water Otsuka Pharmaceutical  7131400A2129
RPMI-1640 medium Wako 189-02025
Fetal Bovine Serum SIGMA-ALDRICH 172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai Tesque 26253-84
96 Well Plate Greiner Bio-one 655 180
Cell Counting Kit-8 DOJINDO 343-07623 WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R TEKAN 510-82851
FACS Round-Bottom Tube BD Falcon 60819-820
Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 51-66121E
PE Annexin V BD Biosciences 51-65875X
7AAD SIGMA-ALDRICH A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur BD Biosciences 342973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
  2. Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
  3. Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
  4. Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
  5. Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
  6. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
  7. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
  8. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
  9. Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
  10. Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
  11. Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
  12. Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
  13. Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
  14. Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
  15. Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
  16. Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
  17. Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
  18. Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
  19. Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
  20. Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
  21. Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
  22. Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
  23. Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
  24. FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
  25. Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).

Tags

Tıp Sayı 112 DOĞRU gen susturma tRNase Z sgRNA kütüphane taraması bir RNA tedavisi kanser terapötik madde
DOĞRU gen susturma: Potansiyel Kanser Tedavi Ajanlar için heptamer tipi Küçük Rehberi RNA Kütüphanesi Taranması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M.,… More

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter