Summary
Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft.
Abstract
TRUE gendæmpning (betegnet efter tR Nase Z L - u tilizing e fficacious gendæmpning) er en af RNA-rettede gen silencing teknologier, som anvender en kunstig lille guide RNA (sgRNA) til at guide tRNA 3'forarbejdning endoribonuclease, tRNase Z L at anerkende et mål RNA. sgRNAs kan optages af celler uden transfektionsreagenser og kan nedregulere deres mål-RNA-niveauer og / eller inducere apoptose i humane cancerceller. Vi har screenet en sgRNA bibliotek indeholdende 156 heptamer-type sgRNAs for virkningen på levedygtigheden af humane myelom og leukæmiceller, og fandt, at 20 af dem effektivt kan inducere apoptose i mindst en af de cancercellelinjer. Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft. Protokollen indeholder hvordan at konstruere sgRNA biblioteket, hvordan at vurdere effekten af hver sgRNA på celle levedygtighed, og hvordan man further evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Omkring 2.000 hits ville forventes at opnås ved screening i fuld skala sgRNA bibliotek bestående af 16.384 heptamerer.
Introduction
TRUE gendæmpning (betegnet efter tR Nase Z L - u tilizing e fficacious gendæmpning) er en af de RNA-dirigerede gene silencing teknologier 1. Denne teknologi er blevet udviklet på baggrund af egenskaber tRNase Z L (eller 3 'tRNase), tRNA 3 »behandling endoribonuclease: det kan kløve enhver target RNA ved enhver forventet sted under ledelse af en kunstig lille guide RNA (sgRNA) ved at anerkende en pre-tRNA-lignende eller mikro-pre-tRNA-lignende struktur dannet mellem mål-RNA og sgRNA 2 - 9. sgRNA, som normalt er 7-31 nt i længde, er kategoriseret i fire grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineær RNA, og krog RNA.
Vi har påvist effektiviteten af TRUE gendæmpning ved at indføre forskellige kunstigt designede sgRNAs i levende celler 10 - 15. Vi har også vist, at der kan optages sgRNAs af celler without eventuelle transfektionsreagenser og kan nedregulere deres mål-RNA-niveauer og / eller inducere apoptose i humane cancerceller 16 - 18. TRUE gendæmpning synes at arbejde på den intracellulære og intercellulære gen regulatoriske netværk system via tRNase Z L og naturlige sgRNAs 19 - 21.
Vi har konstrueret en sgRNA bibliotek, der indeholder 156 heptamer-type sgRNAs at søge efter potentielle terapeutiske heptamer-type sgRNAs for blodkræft 22. Vi har screenet det for virkningen på levedygtigheden af humane myelom og leukæmiceller, og fandt, at 20 af dem effektivt kan inducere apoptose i mindst en af de cancercellelinjer. Og 4 af dem har vist sig at reducere tumor vækst i mus xenograft eksperimenter.
Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft. Protokollen indeholder hvordanat konstruere sgRNA biblioteket, hvordan at vurdere effekten af hver sgRNA på celle levedygtighed, og hvordan man yderligere at evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Analyse for sgRNA cellulære mål-RNA'er og evaluering af effektive sgRNAs i muse xenograftmodeller kan udføres ifølge traditionelle fremgangsmåder 17,22, skønt disse ikke er inkluderet i denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion af en heptamer-typen sgRNA Bibliotek
- Vælge en delmængde af de 16.384 (4 7) 7-nt-sekvenser medmindre fuldskala bibliotek skal bygges.
BEMÆRK: Sekvenserne kan være tilfældige og / eller designet til at målrette specifikke cellulære RNA. For sidstnævnte finde hårnålestrukturer ligner T-arm tRNA i et mål-RNA ved hjælp af et passende computerprogram og / eller visuelt, og vælge sekvenserne komplementære til 7-nt-sekvenser umiddelbart nedstrøms for hårnålestrukturerne 4,10, 17,18. - Syntetisere hver af de udvalgte heptamerer som en fuldt 2'-O--methylated, 5'- og 3'-phosphoryleret RNA med en DNA / RNA-synteseapparat. Brug phosphoramidit metode med kontrolleret poreglas (CPG) støtte, og lad det 5'-terminale 4,4'-dimethoxytrityl (DMT) beskyttende gruppe på i den sidste cyklus (tilsætning af 5'-phosphat) af syntesen 23.
BEMÆRK: Tilpasset synthetic RNA kan også fås fra oligonucleotid leverandører. - Efter afslutning af den sidste syntesecyklus, overføre CPG med det syntetiserede oligonucleotid fra søjlen til et hætteglas med en Teflon-foring skruelåg, tilsættes 1 ml 29% ammoniumhydroxid, og inkuber det ved 55 ° C i 8 timer til spalte oligonukleotidet fra CPG og fjerne beskyttelsesgrupperne fra baserne og phosphater.
- Fordampe ammoniumhydroxid med en centrifugalfordamper ved 40 ° C og re-opløse oligonukleotidet i 0,2 ml 0,1 M n-hexylammonium acetat.
- Oprens syntetiske oligonucleotid gennem omvendt fase højtydende væskekromatografi ved anvendelse af en polystyren-divinylbenzen-søjle med en buffer indeholdende 10-50% acetonitril / 0,1 M n-hexylammonium acetat. Kør søjlen ved 2,0 ml / min i 25 minutter ved 80 ° C.
- Tilsættes 0,25-0,5 ml koncentreret eddikesyre til den fraktionerede prøve (1-2 ml) for at gøre en 20% eddikesyreopløsning, og INCUBAte denne opløsning i 1 time ved stuetemperatur til fjernelse af DMT gruppen.
- Tør prøven med en centrifugalfordamper ved 40 ° C, igen opløse den i 1 ml 29% ammoniumhydroxid, og inkuber opløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur for at fjerne sidekæden af 5'-phosphat.
- Reducer volumen (1 ml) af prøven til ca. 0,3 ml med et centrifugalfordamper ved 40 ° C.
- Dialysere hele koncentrerede prøve mod destilleret vand (500 ml) under anvendelse af en dialyserør med en molekylvægt afskæring 1000 ved 4 ° C natten over.
- Overfør den dialyserede prøve fra dialyserøret til et 1,5-ml rør med en pipette, tør den med en centrifugalfordamper ved 40 ° C, og efterfølgende genopløses i vand til injektion-grade vand, hvis volumen skal være lille nok til at gøre en større end 100 uM opløsning.
- Mål en optisk tæthed på RNA-prøven ved 260 nm med et spektrofotometer og justere dets koncentration til 100uM ved tilsætning af vand til injektion-grade vand. RNA løsning opbevares ved under -20 ° C før brug.
2. Screening af sgRNA Bibliotek for Cell Levedygtighed
- Forbered 10 3 celler / 99 pl / brønd (fx HL60 og RPMI-8226) på en 96-brønds skål i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin-opløsning. Forbered brønde indeholdende kun mediet til baggrund subtraktion. For at eliminere randeffekter, tilsæt sterilt vand til tomme brønde omgivende prøvebrøndene.
- Tilsæt 1 pi heptamer-typen sgRNA (100 uM) opløst i vand til injektion-grade vand til hver brønd. Analysere hver sgRNA i tre eksemplarer. Inkubér pladen ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator i 3 dage.
- Tilsæt en passende mængde af et kommercielt tilgængeligt WST-8-opløsning til hver brønd. Inkubér pladen ved 37 ° C i den samme inkubator i 1 til 4 timer.
- Mål absorbansen ent 450 nm med en mikropladelæser.
BEMÆRK: I de fleste tilfælde vises linearitet mellem absorbans og levedygtige celler, der skal fastholdes, med mindre absorbans værdi overstiger 1,0.
3. Evaluering af Effektiv sgRNAs ved flowcytometri
- Forbered 10 3 celler / 99 pl / brønd (fx HL60) på en 96-brønds skål i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin-opløsning. Fremstilles mindst 10 brønde i én sgRNA, der skal testes. For at eliminere randeffekter, tilsæt sterilt vand til tomme brønde omgivende prøvebrøndene.
- Tilsæt 1 pi heptamer-typen sgRNA (100 uM) opløst i vand til injektion-grade vand til hver brønd. Inkubér pladen ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator i 3 dage.
- Opsamle cellerne behandlet med samme sgRNA fra mindst 10 brønde i en 5-ml rør med en pipette. Spin røret i 5 minutter i en centrifuge ved 300 xg, og kassér medierne.
- Tilsæt 2 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) til røret, og genopslæmmes cellerne. Spin røret i 5 minutter i en centrifuge ved 300 xg, og kassér PBS. Tilføj 150 pi 1x annexin V bindende buffer til røret, og re-suspendere cellerne.
- Tilsæt 2 pi phycoerythrin (PE) -konjugeret annexin V Solution og 1 pi af 7-aminoactinomycin D (7AAD) opløsning til røret, bland dem godt, og inkuber røret i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Analyser prøven ved hjælp af en flowcytometer 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De seks heptamer-type sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), og 5'-CACCAGC-3' (H13260) blev kemisk syntetiseret som 2'-O-methyl RNA indeholdende 5'- og 3'-phosphater.
Disse sgRNAs blev undersøgt for virkninger på levedygtighed af en human leukæmi cellelinje, HL60, og en human myelomcellelinje, RPMI-8226. Repræsentative resultater af cellelevedygtighedsassays er vist i figur 1. De fire sgRNAs H1885, H3277, H10927 og H13260 var meget effektiv og reducerede levedygtigheden af HL60 og RPMI-8226-celler ved> 80% og> 70% hhv. De heptamerer H3277 og H10927 blev også testet for virkningerne på ikke-kræft HEK293 cellelevedygtighed, og har vist sig at næppe Affect cellelevedygtigheden 22.
Den flowcytometri med annexin V og 7AAD dobbelt farvning blev udført for HL60-celler behandlet med heptamer H1885, H3277, H10927, eller H13260. I hver sgRNA, et totalt celleantal (56-95%) i tidlige og sene apoptotiske stadier var meget højere end (4-6%) i mock (figur 2). Disse observationer viser, at reduktionen af HL60 cellelevedygtighed skyldes apoptose.
Figur 1. Cell levedygtighed assays. Cellelevedygtighed blev målt 72 timer efter HL60-celler (A) eller RPMI-8226-celler (B) blev dyrket i fravær eller nærvær af 1 uM af den nøgne heptamer-typen sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287 eller H13260. De relative levende celle numre i fravær af sgRNAs justeres til 100. Fejlsøjler angiver SD (n = 3). *, P <0,002. Genoptrykt fra leukæmi Research, Vol. 38, Takahashi M. et al., Screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske midler mod blodkræftsygdomme, pp 808-815, fig. 1, Copyright (2014), med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Flow cytometri. Med hensyn til HL60-celler, flowcytometri blev udført med annexin V og 7AAD dobbelt farvning. Cellerne blev analyseret 72 timer efter dyrket i fravær eller nærvær af 1 uM af den nøgne heptamer-typen sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A), eller H10927 (B). Genoptrykt fra leukæmi Research, Vol. 38, Takahashi M. et al., Screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske midler mod blodkræftsygdomme, pp 808-815, fig. 2, Copyright (2014), med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilpasses og Seamless Technology Transfer Program via Target-drevet R & D, Japan Science and Technology Agency, Fonden Science Research Promotion fra Corporation for private skoler Japan Fremme og Mutual Aid, og JSP'er KAKENHI Grant Numbers 24300342 og 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
