Summary
Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker.
Abstract
TRUE genuitschakeling (genoemd na tR Nase ZL - u tilizing e fficacious genuitschakeling) is een van de RNA-gerichte gen silencing technieken, die een kunstmatige geleidepen RNA (sgRNA) ingezet om tRNA 3 'verwerking endoribonuclease, tRNase ZL gids , een doel-RNA te herkennen. sgRNAs kunnen door cellen worden zonder transfectie reagentia en hun doel-RNA niveaus downreguleren en / of apoptose in humane kankercellen. We hebben een sgRNA bibliotheek met 156 heptameer type sgRNAs voor het effect op de levensvatbaarheid van humane myeloma en leukemie cellen onderzocht en vonden dat 20 ze efficiënt apoptose in ten minste één van de kanker cellijnen kan induceren. Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker. Het protocol bevat hoe de sgRNA bibliotheek te construeren, hoe het effect van elke sgRNA op de levensvatbaarheid van de cellen, en te beoordelen hoe om te further evalueren effectieve sgRNAs met flowcytometrie. Rond 2000 treffers zou naar verwachting worden verkregen door het screenen van de full-scale sgRNA bibliotheek bestaat uit 16.384 heptameren.
Introduction
TRUE genuitschakeling (genoemd na tR Nase ZL - u tilizing e fficacious genuitschakeling) is een van de RNA-gerichte gene silencing technologie 1. Deze technologie werd ontwikkeld op basis van eigenschappen van tRNase ZL (of 3 'tRNase), tRNA 3' verwerking endoribonuclease: het kan elke doel-RNA op een verwachte plaats splitsen onder leiding van een kunstmatige geleidepen RNA (sgRNA) door het herkennen pre-tRNA-achtige of micro-pre-tRNA-achtige structuur gevormd tussen het doelwit-RNA en sgRNA 2-9. sgRNA, dat gewoonlijk 7-31 nt lang is onderverdeeld in vier groepen, 5'-half-tRNA, heptameer RNA, 14-nt lineair RNA en RNA haak.
We hebben de effectiviteit van TRUE gene silencing aangetoond door de invoering van verschillende kunstmatig ontworpen sgRNAs in levende cellen 10-15. We hebben ook aangetoond dat sgRNAs kan worden opgenomen door cellen without elke transfectiereagentia en kunnen hun doelwit RNA-spiegels downregulate en / of apoptose in menselijke kankercellen 16-18. TRUE genuitschakeling lijkt te werken op de intracellulaire en intercellulaire genregulerend netwerksysteem via tRNase ZL en natuurlijke sgRNAs 19-21.
We hebben een sgRNA bibliotheek met 156 heptameer-type sgRNAs geconstrueerd om te zoeken naar potentiële therapeutische heptameer-type sgRNAs voor bloedkanker 22. We hebben het gescreend op het effect op de levensvatbaarheid van humane myeloma en leukemie cellen en vonden dat 20 ze efficiënt apoptose in ten minste één van de kanker cellijnen kan induceren. En 4 ervan is aangetoond dat tumorgroeisnelheden in muis xenograft experimenten verminderen.
Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker. Het protocol bevat hoehet sgRNA construeren, hoe het effect van elke sgRNA op cellevensvatbaarheid en hoe de effectieve sgRNAs verdere beoordeling door flowcytometrie beoordelen. Analyse voor sgRNA de cellulaire doelwit RNA en evaluatie van effectieve sgRNAs in muizen xenograft modellen kan worden uitgevoerd volgens conventionele werkwijzen 17,22, hoewel deze niet in dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bouw van een heptameer-type sgRNA Library
- Selecteer een subset van de 16.384 (4 7) 7-nt sequenties tenzij de full-scale bibliotheek te construeren.
LET OP: De sequenties kunnen willekeurig en / of om specifieke cellulaire RNA's doelwit. Voor dit laatste voorbeeld haarspeldstructuren lijkt de T-arm van tRNA in een doel-RNA met behulp van een geschikt computerprogramma en / of visueel en selecteer sequenties complementair aan 7-nt sequenties onmiddellijk stroomafwaarts van de haarspeldstructuren 4,10, 17,18. - Synthetiseren elk van de geselecteerde heptameren als volledig 2'-methylated, 5'- en 3'-gefosforyleerd RNA een DNA / RNA synthesizer. Gebruik de fosforamidiet methode op gecontroleerde porie glas (CPG) support, en laat de 5'-terminale 4,4'-dimethoxy- trityl (DMT) beschermende groep in de laatste cyclus (de toevoeging van de 5 'fosfaat) van de synthese 23.
LET OP: Aangepaste synthetic RNA kan ook worden verkregen uit oligonucleotide leveranciers. - Na voltooiing van de laatste synthesecyclus Breng het CPG het gesynthetiseerde oligonucleotide van de kolom een glazen flacon met een Teflon-bekleding schroefdop, voeg 1 ml 29% ammoniumhydroxide, en incubeer deze bij 55 ° C gedurende 8 uur tot klieven het oligonucleotide uit de CPG en verwijder de beschermende groepen van de grondslagen en fosfaten.
- Damp ammoniumhydroxide met een centrifugale verdamper bij 40 ° C en opnieuw los het oligonucleotide in 0,2 ml 0,1 M n-hexylammonium acetaat.
- Zuiver het synthetische oligonucleotide door middel van reverse-fase hoge prestatie vloeistofchromatografie onder toepassing van polystyreen-divinylbenzeen kolom met een buffer met 10-50% acetonitril / 0,1 M n-hexylammonium acetaat. Run de kolom bij 2,0 ml / min gedurende 25 min bij 80 ° C.
- Voeg 0,25-0,5 ml geconcentreerd azijnzuur op de gefractioneerde monster (1-2 ml) een 20% azijnzuuroplossing maken en incubate deze oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de DMT groep verwijderd.
- Droog het monster met een centrifugale verdamper bij 40 ° C, opnieuw oplossen in 1 ml 29% ammoniumhydroxide, en incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur aan de zijketen van het 5 'fosfaat te verwijderen.
- Verminder het volume (1 ml) van het monster tot ongeveer 0,3 ml met een centrifugale verdamper bij 40 ° C.
- Dialyseer de gehele geconcentreerde monster tegen gedestilleerd water (500 ml) onder toepassing van een dialysebuis met een molecuulgewicht cut-off 1000 bij 4 ° C overnacht.
- Breng het gedialyseerde monster uit de dialysebuis een 1,5 ml buis met een pipet, drogen met een centrifugale verdamper bij 40 ° C en vervolgens opnieuw oplossen in water-voor-injectie-grade water, waarvan het volume moet klein genoeg om meer dan 100 pM oplossing.
- Meet een optische dichtheid van het RNA monster bij 260 nm met een spectrofotometer en pas de concentratie 100uM door toevoeging van water-for-injection-grade water. Bewaar de oplossing bij RNA beneden -20 ° C voor gebruik.
2. Screening van de sgRNA Bibliotheek voor de levensvatbaarheid van de cellen
- Bereid 10 3 cellen / 99 ul / putje (bijvoorbeeld HL60 en RPMI-8226) op een 96-putjes in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Bereid putjes die de media alleen achtergrond aftrek. Om randeffecten te elimineren, voeg steriel water om putten rond de monsterputjes legen.
- Voeg 1 pl heptameer type sgRNA (100 uM) opgelost in water-voor-injectie-grade water aan elk putje. Assay elke sgRNA in drievoud. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3 dagen.
- Voeg een zodanige hoeveelheid van een commercieel verkrijgbare WST-8-oplossing aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C in dezelfde incubator gedurende 1 tot 4 uur.
- Meet de absorptie van eent 450 nm met een microplaat reader.
Opmerking: In de meeste gevallen wordt lineariteit tussen absorptie en levensvatbaar celaantal te handhaven indien de absorptiewaarde boven 1,0.
3. Evaluatie van de effectieve sgRNAs door flowcytometrie
- Bereid 10 3 cellen / 99 ul / putje (bijvoorbeeld HL60) op een 96-putjes in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Maak minstens 10 putjes één sgRNA te testen. Om randeffecten te elimineren, voeg steriel water om putten rond de monsterputjes legen.
- Voeg 1 pl heptameer type sgRNA (100 uM) opgelost in water-voor-injectie-grade water aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3 dagen.
- Verzamel de cellen behandeld met dezelfde sgRNA van ten minste 10 putjes in een 5 ml-buis met een pipet. Spin de buis gedurende 5 minuten in een centrifuge bij 300 XG, en gooi de media.
- Voeg 2 ml van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de buis en resuspendeer de cellen. Spin de buis gedurende 5 minuten in een centrifuge bij 300 g, en gooi PBS. Voeg 150 ul van 1 x annexine V binding buffer aan de buis en resuspendeer de cellen.
- Voeg 2 pl fycoerytrine (PE) geconjugeerd annexine V-oplossing en 1 gl 7-amino-actinomycine D (7AAD) oplossing voor de buis goed mengen en incubeer de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Analyseer het monster met een flow cytometer 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De zes heptameer type sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287) en 5'-CACCAGC-3' (H13260) werden chemisch gesynthetiseerd als 2'-O-methyl RNA-bevattende 5'- en 3'-fosfaten.
Deze sgRNAs werden onderzocht op de effecten op de levensvatbaarheid van een menselijke leukemie cellijn, HL60, en een menselijke myeloma cellijn, RPMI-8226. Representatieve resultaten van de cellevensvatbaarheid assays worden getoond in figuur 1. De vier sgRNAs H1885, H3277, H10927 en H13260 waren zeer effectief en verminderde de levensvatbaarheid van HL60 en RPMI-8226-cellen met> 80% en> 70%, respectievelijk. De heptameren H3277 en H10927 werden ook getest op het effect op niet-kankerachtige HEK293 levensvatbaarheid van de cellen, en er is aangetoond nauwelijks affect de levensvatbaarheid van de cellen 22.
De flowcytometrie met annexine V en 7AAD dubbele kleuring werd uitgevoerd voor HL60 cellen behandeld met de heptameer H1885, H3277, H10927 of H13260. In elk sgRNA, een totaal aantal cellen (56-95%) in de vroege en late apoptotische stadia was veel hoger dan die (4-6%) in mock (figuur 2). Deze waarnemingen suggereren dat de vermindering van HL60 cellevensvatbaarheid wordt veroorzaakt door apoptose.
Figuur 1. cellevensvatbaarheidsassays. Cel levensvatbaarheid werd gemeten 72 uur na HL60 cellen (A) of RPMI-8226-cellen (B) werden gekweekt in afwezigheid of aanwezigheid van 1 uM van het naakte heptameer type sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287 of H13260. De relatieve aantallen levende cel in afwezigheid van sgRNAs aangepast tot 100. Errorbalken geven SD (n = 3). *, P <0,002. Herdruk van Leukemie Research, Vol. 38, M. Takahashi et al., Screening van een heptameer type sgRNA bibliotheek van potentiële therapeutische middelen tegen hematologische maligniteiten, pp 808-815, Fig. 1, Copyright (2014), met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Flowcytometrie. Wat HL60 cellen, stroomcytometrie werd uitgevoerd met annexine V en 7AAD dubbele kleuring. De cellen werden geanalyseerd na 72 uur gekweekt in afwezigheid of aanwezigheid van 1 uM van het naakte heptameer type sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A) of H10927 (B). Herdruk van Leukemie Research, Vol. 38, M. Takahashi et al., Screening van een heptameer type sgRNA bibliotheek van potentiële therapeutische middelen tegen hematologische maligniteiten, pp 808-815, Fig. 2, Copyright (2014), met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door flexibele en naadloze Technology Transfer Program via Target-gedreven R & D, Japan Science and Technology Agency, de Science Research Stimuleringsfonds voor de actie en de Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan, en de JSPS KAKENHI Grant Numbers 24300342 en 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
