Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs.
Abstract
TRUE Gen - Silencing (genannt nach tR Nase Z L - u e fficacious gene silencing tilizing) ist eine von der RNA-gerichtete Gen - Silencing - Technologien, die eine künstliche kleine Führungs RNA (sgRNA) verwendet tRNA 3' - Prozessierung Endoribonuklease zu führen, tRNase Z L eine Ziel-RNA zu erkennen. sgRNAs kann durch Zellen ohne Transfektionsreagentien aufgenommen werden und können ihre Ziel-RNA-Niveaus und / oder induzieren Apoptose in menschlichen Krebszellen downregulate. Wir haben eine sgRNA Bibliothek mit 156 Heptamer-Typ sgRNAs für die Wirkung auf die Lebensfähigkeit von menschlichen Myelom und Leukämie-Zellen gescreent, und fand, daß 20 von ihnen effizient Apoptose in zumindest einer der Krebszelllinien induzieren kann. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs. Das Protokoll enthält, wie die sgRNA Bibliothek zu konstruieren, wie die Auswirkungen der einzelnen sgRNA auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten und wie fueitere bewerten die effektiven sgRNAs mittels Durchflusszytometrie. Rund 2.000 Treffer wäre zu erwarten, durch das Screening der Full-Scale sgRNA Bibliothek von 16.384 Heptamere zusammengesetzt zu erhalten.
Introduction
TRUE Gen - Silencing (genannt nach tR Nase Z L - u e fficacious gene silencing tilizing) ist einer der RNA-directed gene silencing Technologien 1. Diese Technologie wurde auf die Eigenschaften von tRNase Z L (oder 3 'tRNase), tRNA 3' - Prozessierung Endoribonuclease entwickelt basiert: es jedes Ziel - RNA an einer erwarteten Stelle unter der Leitung eines künstlichen kleinen Führungs RNA spalten kann (sgRNA) durch eine Anerkennung pre-tRNA-ähnlichen oder Mikro pre-tRNA-ähnlichen Struktur zwischen der Ziel - RNA gebildet , und der sgRNA 2-9. sgRNA, die in der Regel 7-31 nt in der Länge, ist in vier Gruppen eingeteilt, 5'-Hälfte-tRNA, RNA Heptamer, 14-nt RNA linear und hook RNA.
Wir haben die Wirksamkeit von TRUE gene silencing demonstriert durch verschiedene künstlich gestaltete sgRNAs Einführung in die Zellen 10 leben - 15. Wir haben auch gezeigt, dass sgRNAs durch Zellen wi aufgenommen werden kann,thout jegliche Transfektionsreagenzien und können ihre Ziel - RNA - Niveaus downregulate und / oder Apoptose in menschlichen Krebszellen induzieren 16 - 18. TRUE Gen - Silencing erscheint auf dem intra- und interzellulären Genregulationsnetz System über tRNase Z L und natürliche sgRNAs 19 zu arbeiten - 21.
Wir haben eine sgRNA Bibliothek mit 156 Heptamers-Typ sgRNAs konstruiert 22 für potentielle therapeutische Heptamers-Typ sgRNAs für Blutkrebs zu suchen. Wir haben es für die Wirkung auf die Lebensfähigkeit von menschlichen Myelom und Leukämie-Zellen gescreent, und fand, daß 20 von ihnen effizient Apoptose in zumindest einer der Krebszelllinien induzieren kann. Und 4 von ihnen haben gezeigt, dass Tumorwachstumsraten in Maus-Xenograft Experimente reduzieren.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs. Das Protokoll enthält, wiezu konstruieren, die sgRNA Bibliothek, wie die Auswirkungen der einzelnen sgRNA auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten und wie Zytometrie die effektiven sgRNAs durch die Strömung weiter auszuwerten. Analyse für sgRNA der zellulären Ziel - RNAs und Bewertung der effektiven sgRNAs in Modellen Maus - Xenotransplantat kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden 17,22, obwohl diese in diesem Protokoll nicht enthalten.
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Protocol
1. Aufbau eines Heptamer-Typ sgRNA Bibliothek
- Wählen einer Teilmenge der 16.384 (4 7) 7-nt - Sequenzen , wenn der umfassende Bibliothek konstruiert werden soll.
HINWEIS: Die Sequenzen können statistische und / oder gestaltet sein, spezifische zelluläre RNAs abzuzielen. Für letztere hairpin - Strukturen ähnlich der T-Arm von tRNA in einer Ziel - RNA mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms zu finden und / oder optisch und wählen Sequenzen komplementär zu 7-nt - Sequenzen unmittelbar stromabwärts der Haarnadelstrukturen 4,10, 17,18. - Synthetisieren jedes der ausgewählten Heptamere als ein vollständig 2'- O -methylated, 5'- und 3'-phosphorylierter RNA mit einem DNA / RNA - Synthesizer. Verwenden Sie die Phosphoramidit-Methode auf dem Glas mit kontrollierten Poren (CPG) Unterstützung, und lassen Sie das 5'-terminale 4,4'-Dimethoxytrityl (DMT) Gruppe im letzten Zyklus zu schützen (die Zugabe des Phosphat '5) der Synthese 23.
HINWEIS: Benutzerdefinierte synth e tisches RNA kann auch von Oligonukleotid-Lieferanten erhalten werden. - Nach Abschluss der letzten Synthesezyklus, übertragen Sie die CPG mit dem synthetisierten Oligonukleotid aus der Säule in eine Glasampulle mit einem Schraubverschluss Teflon-Liner, 1 ml von 29% Ammoniumhydroxid und brüten sie bei 55 ° C für 8 h auf das Oligonucleotid von dem CPG abzuspalten und die Schutzgruppen von den Basen und Phosphaten entfernen.
- Verdunsten Ammoniumhydroxid mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C und wieder aufzulösen das Oligonucleotid in 0,2 ml 0,1 M n-hexylammonium acetat.
- Reinige den synthetischen Oligonukleotids durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines Polystyrol-Divinylbenzol-Säule mit einem Puffer, der 10-50% Acetonitril / 0,1 M n-hexylammonium acetat. Führen Sie die Säule bei 2,0 ml / min für 25 min bei 80 ° C.
- Hinzufügen 0,25-0,5 ml konzentrierter Essigsäure zu der fraktionierten Probe (1-2 ml), eine 20% ige Essigsäurelösung zu machen, und Incubate diese Lösung für 1 h bei Raumtemperatur die DMT-Gruppe zu entfernen.
- Trocknen der Probe mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C, wieder aufzulösen sie in 1 ml von 29% igem Ammoniumhydroxid, und Inkubieren der Lösung für 15 min bei Raumtemperatur die Seitenkette des 5'-Phosphat zu entfernen.
- Reduzieren das Volumen (1 ml) der Probe auf etwa 0,3 ml mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C.
- Dialysieren die gesamte konzentrierte Probe gegen destilliertes Wasser (500 ml) über Nacht einen Dialyseschlauch mit einem Molekulargewichts-Cut-off 1000 bei 4 ° C verwendet wird.
- Übertragen die dialysierte Probe aus dem Dialyseschlauch in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette, trocknen mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C und anschließend wieder aufzulösen es in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser, dessen Volumen sollte klein genug, um eine von mehr als 100 uM Lösung herzustellen.
- Messen, um eine optische Dichte der RNA bei 260 nm mit einem Spektrophotometer und stellen seine Konzentration auf 100uM von Wasser zur Injektion-grade Zugabe von Wasser. Speichern die RNA-Lösung bei unter -20 ° C vor dem Gebrauch.
2. Screening der sgRNA Bibliothek für Zell Viability
- Vorbereitung 10 3 Zellen / 99 ul / Vertiefung (beispielsweise HL60 und RPMI-8226) auf einer Schale mit 96 Vertiefungen in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin - Lösung. Bereiten Vertiefungen, die die Medien nur für Untergrundsubtraktion. Zur Vermeidung von Randeffekten, fügen Sie steriles Wasser zu leeren Brunnen rund um die Probenvertiefungen.
- 1 ul Heptamers-Typ sgRNA (100 & mgr; M), gelöst in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser zu jeder Vertiefung. Assay jedes sgRNA in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage.
- Eine geeignete Menge eines handelsüblichen WST-8-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C im selben Inkubator für 1 bis 4 Stunden.
- Messen Sie die Absorption einT 450 nm mit einem Mikroplattenleser.
HINWEIS: In den meisten Fällen Linearität zwischen Extinktion und Lebendzellzahl wird beibehalten werden, es sei denn der Wert Extinktion 1,0 übersteigt.
3. Bewertung der effektiven sgRNAs durch Durchflusszytometrie
- Vorbereitung 10 3 Zellen / 99 ul / Vertiefung (beispielsweise HL60) auf einer Schale mit 96 Vertiefungen in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin - Lösung. Vorbereitung mindestens 10 Vertiefungen für eine sgRNA getestet werden. Zur Vermeidung von Randeffekten, fügen Sie steriles Wasser zu leeren Brunnen rund um die Probenvertiefungen.
- 1 ul Heptamers-Typ sgRNA (100 & mgr; M), gelöst in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage.
- Sammeln Sie die mit dem gleichen sgRNA behandelten Zellen von mindestens 10 Brunnen in einen 5-ml-Röhrchen mit einer Pipette. Drehen Sie das Röhrchen 5 min in einer Zentrifuge bei 300 · g, und entsorgen Sie die Medien.
- 2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit dem Rohr und resuspendieren der Zellen. Drehen Sie das Röhrchen 5 min in einer Zentrifuge bei 300 g und verwerfen PBS. Zugabe von 150 ul 1x Annexin V-Bindungspuffer auf das Rohr und die Zellen erneut zu suspendieren.
- In 2 ul Phycoerythrin (PE) konjugiertem Annexin V-Lösung und 1 ul 7-Aminoactinomycin D (7AAD) Lösung in das Röhrchen, mischen sie gut, und Inkubation die Röhrchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Analysieren Sie die Probe ein Durchflusszytometer 24 verwendet wird .
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Representative Results
Die sechs Heptamer-Typ sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287) und 5'-CACCAGC-3' (H13260) wurden chemisch synthetisiert , wie 2' - O - methyl RNA enthaltenden 5'- und 3'-Phosphate.
Diese sgRNAs wurden die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit eines menschlichen Leukämie-Zelllinie untersucht, HL60 und einer menschlichen Myelom-Zelllinie, RPMI-8226. Repräsentative Ergebnisse der Zelllebensfähigkeitstests sind in Abbildung 1 dargestellt. Die vier sgRNAs H1885, H3277, H10927 und H13260 waren sehr effektiv und reduziert die Lebensfähigkeit von HL60 und RPMI-8226 - Zellen durch> 80% und> 70%, respectively. Die Heptamere H3277 und H10927 wurden auch für die Auswirkungen auf die Nicht-Krebs-HEK293 die Lebensfähigkeit der Zellen getestet und haben kaum affe gezeigtct die Lebensfähigkeit der Zellen 22.
Die Durchflusszytometrie mit Annexin V und 7AAD Doppelfärbung wurde für HL60-Zellen mit dem Heptamers H1885, H3277, H10927 oder H13260 behandelt durchgeführt. In jedem sgRNA, eine Gesamtzellzahl (56-95%) in der frühen und späten apoptotischen Stadien war viel höher als die (4-6%) in gespieltem (Abbildung 2). Diese Beobachtungen legen nahe, daß die Reduktion von HL60 Lebensfähigkeit der Zellen zur Apoptose zurückzuführen ist.
Figure 1. Zelllebensfähigkeitstests. Die Lebensfähigkeit der Zellen 72 Stunden nach der HL60 - Zellen gemessen wurde (A) oder RPMI-8226 - Zellen (B) wurden in Abwesenheit oder Gegenwart von 1 uM des nackten Heptamer-type sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287 oder H13260. Die relativen lebenden Zellzahlen in Abwesenheit von sgRNAs werden auf 100 Fehler eingestelltBalken zeigen SD (n = 3). *, P <0,002. Nachdruck aus Leukemia Research, Bd. 38, M. Takahashi et al., Screening einer Heptamer-type sgRNA Bibliothek für potentielle therapeutische Mittel gegen hämatologischen Malignitäten, pp 808-815, Fig. 1, Copyright (2014), mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Durchflusszytometrie. Im Hinblick auf HL60 - Zellen wurde mit Annexin V und 7AAD Doppelfärbung Durchflusszytometrie durchgeführt. Die Zellen wurden 72 h nach kultiviert in Abwesenheit oder Gegenwart von 1 uM des nackten Heptamer-type sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A) analysiert oder H10927 (B). Nachdruck aus Leukemia Research, Bd. 38, Takahashi M. et al., Screening einer Heptamer-type sgRNA Bibliothek für potentielle therapeutische Mittel gegen hämatologischen Malignitäten, pp 808-815, Fig. 2, Copyright (2014), mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Anpassungsfähig und Seamless Technologie-Transfer-Programm durch zielorientierte F & E, Japan Science and Technology Agency, die Wissenschaft Forschungsförderungsfonds von der Förderung und den gegenseitigen Aid Corporation für Privatschulen von Japan unterstützt, und die JSPS KAKENHI Grants-Nummern 24300342 und 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
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